(14)

Если донор не подает сигнал в акцепторном канале и наоборот, что означает, что S3 и S4 равны 0, то этот шаг можно пропустить, и сигналы можно использовать сразу после коррекции фона.

Скорректированные донорные и акцепторные сигналы могут использоваться для отделения фактического сигнала FRET от спектрального просачивания в канале FRET, согласно Youvan et al .{c}} $$

(18)

Моделирование экспериментов FRET

Для моделирования экспериментов FRET мы создали математическую модель, основанную на обобщенной форме закона действия масс, которая описывает состояние всех химических взаимодействий в состоянии равновесия.

$$ A + B \ rightleftharpoons \ text {AB}, \, {K} _ {a} = \ frac {[AB]} {[A] \ ast [B]} $$

(19)

Состояние равновесия, а точнее, концентрации свободных и связанных фракций молекул, зависит от концентраций реагентов, а также их сродства, описываемого константой сродства K _a (или ее обратной величиной, константа диссоциации K _d ).K _a — постоянное значение для реакции при указанной температуре и давлении. Для расчета FRET мы можем использовать наши донор и акцептор как A и B соответственно.

$$ {K} _ {a} = \ frac {[complex]} {{[don]} _ {free} \ ast {[acc]} _ {free}} $$

(20)

$$ [сложный] = [don] — {[don]} _ {free} = [acc] — {[acc]} _ {free} $$

(21)

Когда эти формулы объединены и решены для [комплекса], количество связанных и свободных частиц может быть определено при заданной общей концентрации донора, акцептора и значения K _a .{2}} + [don] {K} _ {a} + \ frac {[acc]} {z} {K} _ {a} +1} {2 {K} _ {a}} $$

(24)

Важно отметить, что этот способ введения фактора стехиометрии подразумевает, что многочисленные молекулы донора или акцептора, которые появляются в комплексе, уже связаны друг с другом до взаимодействия между молекулами донора и акцептора. {c} \) и F ​​ ^c можно рассчитать, применив фиксированное значение максимальной эффективности FRET FRET _max , которое представляет эффективность FRET, если все донорные и акцепторные молекулы были задействованы в донорно-акцепторном комплексе, а также спектральные коэффициенты просачивания S1, S2, S3 и S4.

$$ {D} _ {da} = {[don]} _ {free} + [complex] \ ast (1-FRE {T} _ {max}) + ({[acc]} _ {free} + [сложный]) \ ast {S} _ {4} $$

(26)

$$ {A} _ {da} = {[acc]} _ {free} + [complex] + (\, {[don]} _ {free} + [complex] \ ast (1-FRE {T } _ {max})) \ ast {S} _ {3} $$

(27)

$$ {F} _ {da} = [комплекс] \ ast FRE {T} _ {max} + S1 \ ast {D} _ {da} + S2 \ ast {A} _ {da} $$

(28)

Для вычислительного моделирования модель можно упростить, установив для S1, S2, S3 и S4 значение 0, что не влияет на математическое моделирование.

Из полученных значений были рассчитаны показатели FRET в соответствии с уравнениями с 16 по 18.

Подгонка результатов FRET

Для получения трех количественных переменных K _a ^app , z и FRET _max , мы модифицировали результаты наших измерений в имитационную модель. Чтобы напрямую использовать интенсивности донорного и акцепторного каналов, а также результирующий DFRET для подгонки, мы немного изменили формулу, чтобы получить меру FRET вместо концентрации комплекса.{app}} \ ast \ frac {FRE {T} _ {max}} {don} $$

(31)

Подгонка проводилась с помощью нелинейной модели наименьших квадратов, что сводило к минимуму отклонение теоретических и реальных значений за несколько итераций. Подгонка модели может быть непосредственно применена к измеренным значениям, но должна быть ограничена значимой областью около стехиометрии комплекса. Для простого взаимодействия 1: 1 мы применяем модель ко всем значениям с отношением акцептора к донору от 0,2 до 2.

Статистическая информация

Статистические значения для подгонки модели были определены с помощью нелинейного алгоритма подгонки наименьших квадратов программного обеспечения R. Статистическая информация (где применимо) и n чисел приведены на соответствующих рисунках или в подписях к рисункам.

Реализованное программное обеспечение и код

Все описанные расчеты и оценки могут быть выполнены в свободно доступных ( R, ImageJ, CytExpert, FlowPy ) или общих (Microsoft Excel) программных пакетах.

Расчеты FRET, оценка FRET и моделирование были выполнены в Microsoft Excel (версия 2013). Приведены примеры таблиц данных (дополнительные шаблоны 1 и 2), включая пояснения по использованию и образец набора данных (дополнительные рисунки 8–10).

была выполнена в R (https://www.r-project.org/) с использованием команд нелинейной аппроксимации методом наименьших квадратов. Предоставляется код, используемый для фитинга (дополнительное примечание 2).

Весь написанный код, который использовался в этой работе, включая полностью автоматизированные макросы ImageJ и последовательности R-кода, предоставляется в качестве дополнения или доступен на Github по адресу https: // github.com / BHochreiter.

Динамическая настройка FRET в биосенсоре зеленого флуоресцентного белка

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Кристаллическая структура Twitch-2B

Мы расшифровали структуру с разрешением 2,5 Å (таблица S1A). Асимметричный блок состоит из двух мономеров (рис. S1A). Они представляют идентичные конформации отдельных доменов [среднеквадратичные отклонения (RMSDs) ниже 0,2 Å] и несколько иную междоменную конформацию (RMSD 0,992 Å), но, по-видимому, не собираются как симметричный гомодимер.Их интерфейс (рис. S1B), покрывающий 630 Å ² ( 11 ), на самом деле значительно меньше, чем интерфейс стабильного димера ( 12 ). Кроме того, данные малоуглового рентгеновского рассеяния (МУРР) показывают, что в растворе Twitch-2B является мономерным (рис. S2). Поэтому мы сфокусируем наше описание здесь на мономере A. Кристаллическая структура показывает расположение донора и акцептора относительно минимального кальций-связывающего домена TnC, а также структуру оптимизированных линкеров (рис.1). Структура кальций-связывающего домена очень похожа на C-концевой глобулярный домен куриного TnC (RMSD 0,84 Å) ( 13 ), на структуру ЯМР, решенную ранее ( 8 ), и на структуру кальмодулина. (RMSD 1,08 Å) ( 14 ). Основные оси двух бочкообразных доменов флуоресцентного белка ориентированы почти под перпендикулярным углом друг к другу. Стволы β практически не контактируют друг с другом (рис. 2А) с очень маленькой общей границей раздела (150 Å ² ).Интерфейсы минимального кальций-связывающего домена с mCerulean3 и cpVenus ^cd также относительно невелики, покрывая только 257 и 351 Å ² , соответственно (см. Ниже). Взаимодействия в основном носят гидрофильный характер (рис. 2А).

( A ) Полярные взаимодействия между остатками минимального домена TnC, mCerulean3 и cpVenus ^cd показаны пунктирными линиями. Остатки показаны в виде палочек.( B ) Полярные взаимодействия, опосредованные остатками (показаны в виде палочек) от линкеров между mCerulean3 и кальций-связывающим доменом (у лосося), а также взаимодействия между cpVenus ^cd и кальций-связывающим доменом (пурпурный) . ( C ) Гидрофобные взаимодействия между остатками (показаны в виде палочек) линкеров между mCerulean3 и кальций-связывающим доменом (у лосося), а также линкером между cpVenus ^cd и кальций-связывающим доменом (пурпурный) с остатками (серым цветом) из ядра минимального домена TnC.( D и E ) Крупный план области вокруг N532 Twitch-2B и мутанта N532F Twitch-2B (Twitch-6).

Линкер между mCerulean3 и кальций-связывающим доменом (V ₂₃₂ ADA) образует спираль 3 ₁₀ , которая прочно удерживается на месте водородными связями основной цепи от V232 и S236 в mCerulean3 до E301 и E239 кальция. -связывающий домен (рис. 2Б). Далее линкер между кальций-связывающим доменом и cpVenus ^cd (P ₃₀₅ IYPEL) образует полтора α-спиральных витка (рис.2, B и C), карбонилы основной цепи E309 и L310 образуют водородные связи с боковой цепью R551 (рис. 2B) cpVenus ^cd . Боковая цепь E309 также образует водородную связь с Y152 mCerulean3, плотно связывая три домена вместе. Остатки I306, Y307 и L310 этой короткой спирали участвуют в сети гидрофобных контактов (рис. 2C). Очевидно, что скрининг оптимальных линкеров ( 8 ) привел к последовательностям со спиральными элементами, очень хорошо интегрирующимися в структуру минимального домена TnC, в то время как эти линкеры удерживают на месте донорный и акцепторный домены в основном за счет полярных взаимодействий.

Расчет эффективности FRET на основе структуры

Структура предоставила важную информацию для расчетов FRET. Во-первых, расстояние между центрами масс флуорофоров составляет 3,65 нм (рис. 1B). Затем внутри структуры флуорофоры mCerulean3 и cpVenus ^cd выровнены в конфигурации «голова к голове». Таким образом, мы могли точно определить относительную ориентацию дипольных моментов флуорофоров (рис. 1C; см. Материалы и методы), которые доступны из расчетов теории функционала плотности ( 15 ).Используя эту объединенную информацию, мы рассчитали фактор ориентации κ ² , равный 1,98 (уравнение 1; материалы и методы), и расстояние Ферстера, R ₀ , 6,9 нм для mCerulean3 / cpVenus ^cd . Пара FRET (уравнение 3; материалы и методы). С этими параметрами, используя уравнение Фёрстера, E = R06 / (R06 + r6), теоретическая эффективность FRET, E , Twitch-2B была определена как 0,98. Эффективность FRET, экспериментально определенная с помощью деканшинга донора, равна 0.78 (рис. S3A), что значительно ниже, чем полученное из кристаллической структуры.

Два мономера Twitch-2B в асимметричном блоке (рис. S1A) не только имеют очень похожую конформацию (RMSD основной цепи 0,992 Å), но также образуют очень похожие контакты упаковки кристаллов (рис. S1C). Таким образом, мы делаем вывод, что ориентация доменов в мономере сама по себе не ограничивается кристаллической упаковкой, а в основном внутримономерными взаимодействиями, описанными выше (рис. 2А), и очень вероятно выбрана из пула уже существующих конформаций в растворе.Поскольку междоменные интерфейсы в мономере Twitch-2B относительно малы (рис. 2A), высокая гибкость решения может быть причиной наблюдаемого снижения эффективности FRET. Чтобы исследовать эту гипотезу, мы затем обратили внимание на передовые методы ЯМР.

ЯМР-исследование динамики биосенсора

Чтобы получить представление о возможной динамике, мы использовали парамагнитный ЯМР ( 16 ) с образцом Twitch-2B, где два сайта связывания кальция TnC были загружены диспрозием (Dy).Анизотропная магнитная восприимчивость комплекса TnC-Dy ₂ индуцирует парамагнитный тензор выравнивания, который может быть определен из структуры ( 17 ) (см. Материалы и методы). Мы использовали спектрометры на 900 МГц и 1,1 ГГц, поскольку тензор юстировки квадратично зависит от магнитного поля. Если данный флуоресцентный белок является жестким по отношению к TnC, то тензор выравнивания, который он испытывает, идентичен TnC. Если, однако, флуоресцентный белок является динамическим по отношению к TnC, то это движение уменьшит тензор выравнивания первого ( 16 , 18 ).Это позволяет количественно оценить динамику флуоресцентных белков по отношению к TnC. В то время как диполярные связи усредняются в изотропном растворе из-за случайного изотропного переворачивания, парамагнитно-индуцированные тензоры выравнивания приводят к анизотропному распределению ориентации TnC и, следовательно, прикрепленных зеленых флуоресцентных белков в растворе, что приводит к неполному усреднению диполярного муфты, позволяющие наблюдать остаточные диполярные связи (RDC). Мы определили RDC метильных групп парамагнитно выровненного Twitch-2B ( 19 ) (см. Материалы и методы).Наблюдаемый диапазон RDC достаточен для измерения размера тензора выравнивания ( 20 ), так что отнесение метильных групп не было необходимым.

Мы обнаружили, что диапазон значений RDC и, таким образом, тензор выравнивания, испытываемый флуоресцентными белками, в 10 раз меньше, чем рассчитанные на основе жесткой рентгеновской структуры (рис. 3; см. Материалы и методы). Таким образом, динамика должна быть причиной несоответствия между расчетной и экспериментальной эффективностями FRET.Кристаллическая структура может быть только частью динамического конформационного ансамбля в растворе.

Прогнозирование RDC метильных групп в двух доменах флуоресцентного белка и TnC с использованием рентгеновской структуры (выделено пурпурным цветом). Тензор выравнивания, индуцированный двумя ионами диспрозия, связанными с TnC, является результатом трансляции тензора, полученного из кальмодулина (см. Материалы и методы). Экспериментальные RDC от парамагнитного ЯМР Twitch-2B (зеленый) и Twitch-6 (пурпурный).Дальность действия уменьшается в 10 и 5 раз для Twitch-2B и Twitch-6 соответственно.

Конструирование мутанта на основе структуры с улучшенной эффективностью FRET

Предполагая структурную целостность отдельных доменов, мы предположили, что линкерные области являются стержнем этой динамики. На границах раздела между доменом TnC и донорным и акцепторным доменами преобладают полярные взаимодействия (рис. 2А). Мы предположили, что замена этих взаимодействий гидрофобными контактами сделает линкеры жесткими и увеличит экспериментальную эффективность FRET.С этой целью мы разработали мутацию N532F (рис. 2, D и E) на поверхности cpVenus ^cd , создавая новое взаимодействие с F249 кальций-связывающего домена (рис. 2D). Как и ожидалось, эта мутация вызвала существенное увеличение максимального изменения отношения FRET с 800 до 1100% in vitro (рис. S4). В кристаллической структуре этого мутанта (Twitch-6; таблица S2) боковая цепь F532 действительно связывается в гидрофобный карман, образованный боковыми цепями F249, Asp262 и Y338 (рис. 2E).В остальном структуры Twitch-6 и Twitch-2B очень похожи (RMSD 0,25 Å), что приводит к почти идентичной теоретической эффективности FRET (см. Дополнительные материалы). Благодаря этой конструкции экспериментальная эффективность FRET Twitch-6 увеличилась до 0,90, с 0,78 для Twitch-2B (рис. S3B), а диапазон RDC, измеренных с Twitch-6, удвоился по сравнению с Twitch-2B (рис. 3). . Это указывает на сужение интерфейса между доменом TnC и cpVenus ^cd , и, таким образом, уменьшение динамики между доменами является причиной увеличения FRET.

Конформационные ансамбли в решении

Определив динамику как причину снижения эффективности FRET Twitch-2B в решении, мы хотели получить представление о конформационном пространстве, возникающем в результате этой динамики. Для этой цели мы выбрали конформационные ансамбли, исследующие динамику скелета исключительно на динамических линкерных областях между доменами флуоресцентного белка и доменом TnC (см. Материалы и методы), оценивая более 1 миллиона шестичленных ансамблей против наблюдаемых RDC и эффективности FRET (Таблица 1, рис.4 и Материалы и методы). Среди всех возможных ансамблей мы выбрали тот, который лучше всего воспроизводит как экспериментальную эффективность FRET, так и диапазон RDC (Таблица 1). Этот ансамбль полностью объясняет, как гибкость неупорядоченных остатков линкерных областей приводит к наблюдаемому снижению эффективности FRET и диапазона RDC.

Ансамбли для Twitch-2B (слева) и Twitch-6 (справа) содержат по шесть структур каждый, причем самые большие отклоняющиеся структуры показаны зеленым и красным.Состояния, которые не являются этими крайними конформациями, прозрачны.

Влияние на улучшенную конструкцию датчика FRET

Таким образом, мы получили кристаллическую структуру флуоресцентного кальциевого биосенсора Twitch-2B и вместе с динамикой линкеров, определенной с помощью парамагнитного ЯМР, мы количественно оценили эффективность FRET. Поскольку динамика ограничивала эффективность FRET, мы успешно сконструировали ригидифицированный мутант с увеличенным FRET. Таким образом, структурные и динамические характеристики ратиометрических датчиков FRET обеспечили принципы проектирования, которые могут быть применимы к другим системам, в которых эффекты FRET используются для восприятия сигналов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клонирование, экспрессия и очистка Twitch-2B и Twitch-6

Конструкция Twitch-2B была описана ранее ( 8 ). Для настоящего исследования кодирующую последовательность трехдоменного слитого белка клонировали в модифицированный вектор pET16b, кодирующий слитый белок с N-концевой меткой His ₇ и последовательностью расщепления, распознающей вирус травления табака (TEV). Мутант Twitch-2B N532F (Twitch-6) был создан с использованием набора для сайт-направленного мутагенеза QuikChange (Agilent).Экспрессионные конструкции pET16bTEV-Twitch-2B и pET16bTEV-Twitch-6 трансформировали в штамм Escherichia coli BL21 (DE3). Экспрессию белка проводили при 303 К индукцией 0,5 мМ изопропил-β-d-1-тиогалактопиранозидом. Клетки собирали через 7 часов после индукции. Меченный селенометионином белок Twitch-2B был сверхэкспрессирован в штамме B834 метионин-ауксотрофа E. coli в минимальной среде с добавлением (+) — l-селенометионина в соответствии с группой по экспрессии белка EMBL (Европейская лаборатория молекулярной биологии) (www.embl.de).

Осадок клеток из 1 литра встряхиваемой культуры ресуспендировали в 60 мл лизирующего буфера [20 мМ трис-HCl (pH 7,9), 300 мМ NaCl, 20 мМ имидазол, 0,5 мМ фенилметилсульфонилфторид с одной таблеткой полного количества ЭДТА- свободных ингибиторов (Roche) на 100 мл лизирующего буфера]. Клетки лизировали ультразвуком с последующим центрифугированием при 27000 g и 277 К. Из супернатанта рекомбинантный белок очищали с помощью аффинной хроматографии с иммобилизованным металлом на 3 мл агарозной смолы Ni-нитрилотриуксусной кислоты (NTA) (Qiagen).Метку слияния His ₇ отщепляли протеазой TEV и удаляли инкубацией с 1 мл Ni-NTA агарозной смолы. Белок диализовали против 20 мМ трис (pH 7,0) и 150 мМ NaCl. После доведения концентрации сульфата аммония в растворе белка до 1 М белок дополнительно очищали хроматографией на гидрофобном взаимодействии на колонке с фенилсефарозой объемом 10 мл (GE Healthcare). Белок элюировали с этой колонки 50-мл градиентом от 1 до 0 М сульфата аммония.Фракции, содержащие белок, объединяли и концентрировали до объема 2,5 мл с помощью концентратора для ультрафильтрации с MWCO (пороговая молекулярная масса) 30 кДа (Vivascience). Наконец, белок очищали эксклюзионной хроматографией на гель-фильтрационной колонке HiLoad 26/60 Superdex 200 мкг. Фракции пика объединяли, диализовали против 20 мМ трис-HCl (pH 7,0), 100 мМ NaCl и 5 мМ CaCl ₂ , и концентрацию белка доводили до 20 мг / мл.

Флуоресцентная спектроскопия

Для спектроскопии рекомбинантного Twitch-2B in vitro белок был очищен от E.coli с использованием смолы Ni-NTA, как описано ( 6 ). Спектроскопию выполняли на спектрофотометре Cary Eclipse (Varian). Донорское расщепление Twitch-2B проводили путем расщепления Twitch-2B в связанном с кальцием состоянии в течение ночи при комнатной температуре с химотрипсином (70 Ед / мл; Sigma-Aldrich) при записи FRET. Небольшое оставшееся излучение cpVenus ^cd после переваривания химотрипсина было избирательно фотообесцвечено (5 мин) с помощью массива из шести светодиодов Luxeon Lumiled с пиком на длине волны 530 нм, с общей рассеиваемой мощностью 14.7 Вт и 870 люмен. Для защиты mCerulean3 от обесцвечивания использовали LP (длиннопроходный) фильтр с длиной волны 500 нм. Связанный с кальцием Twitch-6 был очень устойчив к расщеплению протеазой. Следовательно, EGTA (конечная концентрация, 5 мМ) добавляли во время переваривания химотрипсина, чтобы получить спектр деквенированного mCerulean3.

Кристаллизация, сбор данных и определение структуры

Кристаллы Twitch-2B и Twitch-6 были получены путем диффузионного смешивания паров 1 мкл раствора белка с 1 мкл раствора для лунок [0.2 M Na-формиат (pH 7,0), 5 мМ CaCl ₂ и 18-20% полиэтиленгликоля 3350]. Кристаллы были подвергнуты криозащите, перенеся их в хорошо раствор с добавлением от 16 до 18% глицерина на 1 мин и быстро охладив, погрузив их в жидкий азот.

Сбор данных производился в PXII, SLS, Швейцария, с использованием детектора PILATUS 6M (Dectris). Собственные данные собирали при 100 К на длине волны 1 Å. Данные по производному селенометионина были измерены при 0,98 Å. Все данные были обработаны с помощью программного обеспечения для детектора рентгеновских лучей (XDS) ( 21 ) и масштабированы с помощью SADABS (Bruker AXS).Определение пространственной группы и статистический анализ выполняли с использованием XPREP (Bruker AXS). Фазирование выполняли с помощью AutoSol ( 22 ).

Первоначальная модель была построена с помощью AutoBuild и дважды уточнена с помощью phenix.refine ( 23 ) с промежуточным ручным построением модели с помощью Coot ( 24 ). Окончательная модель была получена путем комбинированного ручного отслеживания (Coot) и уточнения с использованием Refmac5 ( 25 ). На графике Рамачандрана 96,69% ​​остатков располагались в предпочтительной области 2.72% в разрешенной области и 0,58% остатков были выбросами. Кристаллическая структура Twitch-6 была решена с помощью PHASER ( 26 ), используя PDB (Protein Data Bank) запись 6GEL в качестве модели поиска. Построение и уточнение модели выполнялись, как описано для Twitch-2B. Для этого мутанта 96,68% остатков попали в предпочтительную область графика Рамачандрана, 2,83% попали в разрешенную область и 0,49% были выбросами.

Расчеты FRET

Фактор ориентации κ ² может быть извлечен из структурной информации следующим образом: κ2 = (cos θT — 3 cos θD cos θA) 2 (1) где θ _T — угол между эмиссионным переходом диполь донора и диполь перехода поглощения акцептора; θ _D и θ _A — углы между этими диполями и вектором r , соединяющим донорный и акцепторный флуорофоры ( 27 ).Ориентация дипольных моментов перехода относительно вектора связи C → O (ω) в градусах ωD = 73 ° ωA = 76 ° была взята из Ansbacher et al. ( 15 ), а угловые параметры были извлечены из кристаллографических координат в угловых единицах θT = 152,95 ° θD = 149,17 ° θA = 26,79 °

Подробные вычисления объяснены в файле данных S1. Интеграл перекрытия, Дж, (λ), был рассчитан из экспериментальных спектров поглощения и излучения изолированных доменов cpVenus и mCerulean3 соответственно (рис.S5) со сценарием Python, включенным в качестве дополнительной информации. J (λ) был определен как 2,052 × 10 ¹⁵ M ⁻¹ см ⁻¹ нм ⁴ , следующим образом: J (λ) = ∫0∞FD (λ) εA (λ) λ4dλ = ∫0∞FD (λ) εA (λ) λ4dλ∫0∞FD (λ) dλ (2) где F _D (λ) — нормированная интенсивность флуоресценции донора в диапазоне длин волн от λ до λ + Δλ. ε _A (λ) — коэффициент экстинкции акцептора при λ.

Расстояние Ферстера, R ₀ , можно рассчитать на основе ранее полученных экспериментальных параметров R0 = 0.211 (κ2n − 4QDJ (λ)) 1/6 (3) где Q _D (0,87) — квантовый выход донора в отсутствие акцептора ( 4 ) и n , (1,33) показатель преломления водной среды.

Наконец, эффективность передачи энергии, E , может быть рассчитана как отношение скорости передачи к общей скорости распада донора в присутствии акцептора E = R06R06 + r6 (4)

Следуя этой процедуре, эффективность FRET была определена как E = 0.979, из кристаллографической структуры Twitch-2B. Эквивалентный расчет, выполненный со структурой мутанта Twitch-6, дает E = 0,983 (см. Файлы данных S1 и S2).

ЯМР-спектроскопия

Мы экспрессировали белки Twitch-2B и Twitch-6 в минимальной среде Toronto, приготовленной из 100% D ₂ O и пердейтерированной d-глюкозы и дополненной предшественниками аминокислот α-кетомасляной кислотой (метил-13C , 3,3-D2) и α-кетоизовалериановой кислоты (3-метил-13C, 3,4,4,4-D4), таким образом, селективно мечение атомами ¹³ C и ¹ H только метильных групп остатки валина, лейцина и изолейцина, сохраняя при этом остальные атомы C как ¹² C и протоны как ² H ( 19 ).

Сначала были получены спектры изотропных образцов в буфере A [20 мМ Mops (pH 7,0), 100 мМ NaCl и 5 мМ CaCl ₂ в 100% D ₂ O]. Затем белки диализовали против буфера B [20 мМ Mops (pH 7,0), 100 мМ NaCl и 10 мМ EDTA] с последующим диализом против буфера C [20 мМ Mops (pH 7,0) и 100 мМ NaCl] и, наконец, заменяли на буфер С, приготовленный на 100% D ₂ O, содержащем три эквивалента диспрозия, перед измерениями ЯМР. Концентрация белка в образцах составляла примерно 0.5 мМ.

Образцы были протестированы с помощью экспериментов с метил-TROSY ( 19 , 28 ) (рис. S7) при 900 МГц и 1,1 ГГц, а связи J и J + RDC были определены с использованием J -модулированного Эксперимент с метил-TROSY ( 29 ), изображенный на рис. S6 в виде матриц 2048 × 128 комплексных точек данных с 96 переходными процессами на приращение ( t ₁ ). Общие использованные задержки модуляции J были следующими: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 и 20 мс (рис.S8). ЯМР-эксперименты проводили с использованием 5-мм TCI (криозонда тройного резонанса с инверсным детектированием) на спектрометре 900 МГц и криозонда TCI 3 мм на спектрометре 1,1 ГГц, оба оснащены консолями NEO (Bruker). Интенсивности (максимальная амплитуда) сигналов были извлечены с помощью CARA (компьютерное определение резонанса) ( 30 ) в экспериментах с обработкой NMRPipe ( 31 ) и проанализированы с помощью скриптов Python (рис. S8), следуя Pederson et al. ( 29 ).

Расчет парамагнитного тензора

Мы взяли парамагнитный тензор из комплекса кальмодулин-IQ, связанного с диспрозием, из ( 18 ) и рассчитали суммарный тензор дважды занятого кальцийсвязывающего домена TnC. Сайт связывания кальция 1 TnC перекрывается с сайтом связывания лантанидов кальмодулина (CaM N60D). Мы повернули матрицу выравнивания с сайта связывания кальция из CaM на второй сайт связывания кальция TnC и добавили его к тензору сайта связывания кальция 1, таким образом получив общий тензор TnC.Затем этот тензор использовался для расчета RDC из парамагнитных белков Twitch ACaM = (1,05 10−31−1,92 10−322,04 10−31−1,92 10−32−1,22 10−316,46 10−322,04 10−316,46 10−321,67 10−32 ) ATwitch = (1,46 10-318,39 10-323,46 10-318,39 10-32-1,06 10-312,26 10-323,46 10-312,26 10-32-3,92 10-32)

Тензоры даны в м ³ M ⁻¹ .

Генерация ансамбля

Сначала мы индивидуально смоделировали все возможные двугранные углы основной цепи (ϕ и ψ; выборка с шагом 60 °) линкерных остатков (от Arg ²²⁹ до Gln ²³¹ для mCerulean3 и Met от ³¹¹ до Gly ^{313 ​​} для cpVenus), что не привело к стерическому конфликту между одним из модифицированных доменов флуоресцентного белка и доменом TnC.Каждую из двух линкерных областей моделировали независимо. Из всех возможных комбинаций ϕ, ψ (117 649) вращение mCerulean3 привело к 477 возможным конформациям, в то время как cpVenus допустил 84 конформации, обеспечивая в целом 40 086 возможных конформаций.

Во-вторых, мы случайным образом объединили возможные структуры для mCerulean-TnC и TnC-cpVenus в ансамбли из шести членов. Мы произвольно отобрали 1 миллион шестичленных ансамблей из 40 068 возможных ϕ, ψ комбинаций линкеров между mCerulean и TnC и между TnC и cpVenus, чтобы гарантировать правильное исследование конформационного пространства Twitch.

В-третьих, мы рассчитали диапазон RDC (используя тензор, полученный, как описано выше) и FRET ансамблей и сравнили их с экспериментальными значениями, определив коэффициент качества ансамбля Qens = ∑i = 1i = 6 (RDCi − RDCeRDCe) 2+ (FRETi-FRETeFRETe) 2, где RDC _i — диапазоны распределения, субиндекс e указывает экспериментальное значение, а i указывает значение из члена ансамбля. Такое значение добротности отличается от 0, если совпадения предсказанных откликов RDC и FRET от ансамбля отклоняются от экспериментальных данных, и 0 в случае полного совпадения.Наконец, ансамбли были отсортированы по их Q _ens , и был выбран самый низкий из них.

Измерения SAXS

Данные SAXS были собраны на канале BM29 Европейского центра синхротронного излучения (ESRF) в Гренобле, Франция, с использованием автоматического устройства смены образцов ( 32 ). Белок диализовали либо против буфера A [20 мМ Mops (pH 7,0), 100 мМ NaCl и 5 мМ CaCl ₂ ] (связанное с кальцием состояние), либо против буфера B [20 мМ Mops (pH 7,0), 100 мМ NaCl и 10 мМ ЭДТА] (без кальция).Перед измерением белок центрифугировали для удаления более крупных частиц. Образцы измеряли при концентрациях 2,5, 10 и 20 мг / мл. Буфер для диализа использовали для коррекции эталонного буфера. Данные собирали при 293 К с использованием длины волны 0,995 Å и расстояния от образца до детектора 2,867 м. Загружали сто микролитров каждой концентрации образца, собирали и объединяли 10 кадров. Образцы непрерывно подавались в кювету, чтобы свести к минимуму эффекты радиационного повреждения.Изображения детектора были объединены и преобразованы в одномерные кривые рассеяния, а вклады буфера в рассеяние были вычтены с использованием программного обеспечения BsxCuBE. Дальнейшая обработка данных выполнялась автоматически с использованием онлайн-конвейера EDNA ( 33 ) для оценки качества образца и эффектов радиационного повреждения. Агрегации белков или радиационного повреждения не наблюдалось.

Данные были дополнительно проанализированы с помощью программного пакета ATSAS ( 34 ). Вкратце, первичная обработка и анализ данных были выполнены с использованием программ PRIMUS ( 35 ) и GNOM ( 36 ).

Теоретическое рассеяние от кристаллической структуры было рассчитано с использованием программы CRYSOL ( 37 ) (рис. S2), а молекулярные массы рассчитаны с использованием образца бычьего сывороточного альбумина в качестве стандарта.

Благодарности: Мы благодарим персонал компании SLS, X10SA за поддержку при сборе рентгеновских данных и ESRF, BM29 за поддержку при сборе данных SAXS. Мы благодарим M. Paulat, C. Schwiegk и A. Moritz за техническую помощь в производстве белка и K.Оверкамп для масс-спектров электроспрея. С. благодарит T. Gruene и G. Sheldrick за советы по уточнению кристаллической структуры и структурному анализу. К.Г. и П.Т.-М. поблагодарить R. Kuemmerle (Bruker Biospin) за измерения ЯМР на частоте 1,1 ГГц. Источник: Эта работа была поддержана Обществом Макса Планка и DFG SFB 870 (O.G.). П.Т.-М. был поддержан докторской стипендией Гумбольдта. Вклад авторов: P.T.-M. выполнен ЯМР. П.Т.-М. и К.Г. разработал парамагнитный метод ЯМР.П.Т.-М. рассчитаны структурные ансамбли. П.Т.-М. и С. выполнены измерения SAXS. К.Г. рассчитал FRET по рентгеновским структурам. T.T. и O.G. определили экспериментальные эффективности FRET. С. кристаллизовал Twitch-2B и Twitch-6 и решил кристаллические структуры. Рукопись написана всеми авторами. С. разработал проект. Конкурирующие интересы: Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов. Доступность данных и материалов: Структуры депонированы с кодом 6GEL для биосенсора Twitch-2B и 6GEZ для мутанта Twitch-2B N532F (Twitch-6).Все данные, необходимые для оценки выводов в статье, представлены в документе и / или дополнительных материалах. Дополнительные данные, относящиеся к этой статье, могут быть запрошены у авторов.

Датчик FRET движения С-конца выявляет активацию VRAC посредством передачи сигналов DAG плазматической мембраны, а не ионной силы

[Примечание редакции: план авторов по исправлениям был одобрен, и авторы подали официальную пересмотренную заявку.]

Учитывая список важных изменений, включая новые эксперименты, редакторы и рецензенты приглашают вас ответить в течение следующих двух недель с планом действий и графиком завершения дополнительной работы.Мы планируем поделиться вашими ответами с рецензентами, а затем выпустить обязательную рекомендацию.

Три рецензента согласны с тем, что основная проблема в этой статье заключается в отсутствии подтверждения электрофизиологией данных FRET. Очень важно проводить одновременные эксперименты, измеряя FRET и ток в ответ на активирующие стимулы. Если это выходит за рамки ваших технических возможностей, по крайней мере, такие же эксперименты по измерению FRET должны быть повторены электрофизиологами.Также важно, чтобы данные FRET и визуализации были представлены в более четкой форме и чтобы эксперименты PKC FRET также подтверждались электрофизиологией. Более подробный список комментариев см. В отчете рецензентов ниже.

Как мы описываем в приведенном ниже ответе по пунктам, мы стремились решить все эти вопросы. Мы провели флуорометрию патч-зажим для одновременного измерения FRET и токов, продемонстрировав связь изменения сигнала FRET с активацией VRAC.Мы улучшили представление наших данных и экспериментальных методов. Кроме того, мы провели электрофизиологические эксперименты и одновременные измерения FRET / тока, чтобы исследовать механизм активации VRAC. Тем самым мы подтвердили роль диацилглицерина. Вместо PKC мы смогли определить роль PKD в активации VRAC, используя объединенную мощность электрофизиологии и нашего датчика FRET. Кроме того, мы неожиданно обнаружили артефакты, связанные с конфигурацией целых клеток, которые остались бы не обнаруженными без нашего оптического инструмента.

Рецензент № 1:

В этой статье группы Stauber представлены результаты экспериментов, в которых они измерили сигнал FRET между присоединенной парой флуоресцентных белков в белках LRRC8A или E, которые образуют регулируемые по объему каналы VRAC. Измерения показывают, что сигнал FRET модулируется применением гипотонических растворов. Авторы утверждают, что сигнал связан с активацией канала VRAC, и представляют дополнительные экспериментальные доказательства того, что активация также опосредуется активацией фосфорилирования PKC.Экспериментальные методы адекватны, и в целом выводы подтверждаются доказательствами.

Мы благодарим рецензента за эти положительные комментарии.

Есть несколько моментов, которые необходимо изложить более четко. В частности, хотя есть доказательства того, что сигнал FRET специфичен для LRRC8, авторы цитируют несколько обзоров в качестве доказательства того, что сигнал FRET коррелирует с динамикой активации VRAC тем же стимулом. Однако доказательства в этих ссылках показывают, что активация VRAC стимулами фиксации напряжения происходит в мс-шкале времени, и не показаны данные о динамике реакции на гипертонический стимул.Авторам необходимо показать параллельный эксперимент, показывающий величину тока VRAC, продуцируемого LRRC8A / A и LRRC8A / E в их конкретной системе экспрессии.

Следуя предложениям рецензентов, мы выполнили флуорометрию с помощью патч-зажима, чтобы одновременно измерить FRET и токи LRRC8A-CFP / E-YFP в клетках HEK293, дефицитных по эндогенному VRAC. Эти измерения продемонстрировали, что временной ход изменений FRET коррелировал с текущей активацией и инактивацией при применении гипотонического буфера и последовательного изотонического буфера (новый рисунок 1F).Это заменяет цитирование обзоров на данной позиции. Пока нам не удалось измерить токи от гомомерных каналов LRRC8A / A — возможно, из-за чрезвычайно низкой проводимости (Gaitán-Peñas et al., 2016; Deneka et al., 2018).

Эксперименты с фиксацией напряжения показывают, что токи VRAC деактивируются в ответ на продолжительный приложенный стимул. Важно обсудить устойчивый характер сигнала FRET, если он связан с активацией канала. Считается ли, что для каждой модальности активации канала существуют разные ворота?

Как также видно из наших одновременных измерений FRET / тока, сигнал FRET (уменьшенный FRET, коррелирующий с активным VRAC) следует за токами (которые мы измеряем при -80 мВ).Устойчивая активность VRAC при гипотоничности не является чем-то необычным как в режиме фиксации напряжения целых клеток (например, обзор Pederson et al., 2016 и показанный на их рисунке 1A), так и в клетках, не подвергнутых фиксации с помощью заплатки целых клеток (как видно из многочисленных примеров). эксперименты по изучению VRAC-опосредованного оттока осмолита). Зависящая от времени инактивация нефизиологическими деполяризованными напряжениями типична для токов VRAC (кинетика инактивации и зависимость от напряжения меняются в зависимости от состава субъединицы LRRC8 — Voss et al., 2014, Ullrich et al., 2016). Мы наблюдали инактивацию этой характеристики в наших протокольных измерениях скачка напряжения, которые мы обычно проводили, чтобы подтвердить, что измеряемые нами токи опосредованы VRAC (новый рисунок 1F и новый рисунок 4C). Вероятно, существуют разные ворота для активации / инактивации за счет осмолярности и инактивации, вызванной деполяризацией, но обсуждение этого выходит за рамки данного исследования.

Рецензент № 2:

Для редакторов

Авторы разработали очень интересный анализ для мониторинга активности LRRC8-опосредованных каналов VRAC с использованием чисто оптического анализа на основе FRET.Такой анализ может быть полезен для исследований структуры-функции, а также для изучения функции VRAC в физиологических условиях. Однако основная критика заключается в том, что анализ не был подтвержден параллельными электрофизиологическими измерениями. Если авторы могут предоставить такое подтверждение, я бы поддержал публикацию.

Благодарим рецензента за в целом положительные комментарии. Следуя предложениям рецензентов, мы выполнили серию электрофизиологических измерений, также параллельно с нашим анализом FRET.

Авторам

В рукописи König et al. Описан метод мониторинга активности чувствительных к объему каналов VRAC / LRRC8 с разрешением во времени и пространстве путем измерения внутрикомплексного FRET между слитыми с С-концом флуоресцентными белками. Преследуются две основные цели: во-первых, продемонстрировать гибкость доменов с богатыми лейцином повторами (LRRD) и их участие в закрытии канала; во-вторых, чтобы предоставить доказательства того, что низкая внутриклеточная ионная сила не является физиологически значимым параметром для открытия VRACs.Скорее авторы предполагают, что активация при гипотонической стимуляции связана с активностью PKC.

Кроме того, авт. Используют анализ, чтобы показать, что LRRC8-обеспечиваемый VRAC не активируется в эндомембранах, а только в плазматической мембране.

Ключевые вопросы, лежащие в основе работы, заслуживают похвалы и потенциально очень важны для данной области. В частности, метод введения внутримолекулярного датчика FRET расстояния до субъединиц является весьма инновационным и потенциально очень полезным.Возможность контролировать активность LRRC8 с помощью чисто оптического анализа очень интригует.

Мы благодарим рецензента за эти положительные комментарии. Действительно, теперь мы видим главное преимущество чисто оптического анализа — мы не диализируем клетку и не теряем сигнальные пути.

Однако для полной валидации анализа необходимо несколько технических контролей. Что наиболее важно, обязательно, чтобы сам анализ и другие результаты подтверждались электрофизиологическими данными.

Все эксперименты должны быть дополнены электрофизиологическими записями. В принципе, было бы наиболее убедительно, если бы анализ FRET мог быть выполнен на той же клетке, которая была закреплена заплатой, чтобы убедиться, что изменения FRET отражают текущую активацию. Поскольку это может быть технически слишком сложно, необходимо, по крайней мере, проверить конструкции, используемые при электрофизиологических записях, в тех же условиях, что и анализ FRET. Присоединение флуоресцентных белков к С-концу может изменить «чувствительность к объему» само по себе.Фактически, добавление флуоресцентных белков к С-концу приводит к конститутивной активности анионных каналов в ооцитах Xenopus (Gaitán-Peñas et al., 2016).

Как было предложено авторами обзора, мы выполнили флуорометрию с помощью патч-зажима и измерили FRET и ток в тех же клетках. Мы обнаружили, что (как ранее описано Gaitán-Peñas et al., 2016) меченые конструкции давали остаточные токи в изотоничности. Тем не менее, токи явно усиливались гипотоничностью (как показывают измерения в ооцитах, проведенные Gaitán-Peñas et al., 2016). Это сделало измерения действительно технически сложными (со сверхэкспрессией клеток ниже 20% по сравнению с более чем 50% успешных результатов в клетках дикого типа), как также заявили Gaitán-Peñas et al., 2016: «Однако мы обнаружили это. быть чрезвычайно трудным из-за очень низкого уровня успешности образования гига-уплотнения. В нескольких успешных записях можно было наблюдать конститутивную VRAC-подобную активность каналов (данные не показаны) ». Тем не менее, с помощью флуориметрии патч-кламп мы смогли убедительно подтвердить связь наблюдаемых изменений FRET с активацией VRAC.

Авт. Предполагают центральную роль PKC в закрытии канала и указывают, что его фармакологическое ингибирование предотвращает открытие VRAC, управляемое гипотонией. Опять же, этот результат должен быть подтвержден электрофизиологическими записями с использованием тех же конструкций и конструкций без метки — необходимо количественное сравнение плотности тока с применением и без применения PMA / Gö6983 / стауроспорина.

Мы сначала подтвердили, что PMA также вызывает снижение cFRET в HEK293 в дополнение к клеткам HeLa (новая правая панель на рисунке 4A) и что изменения cFRET были специфичными для VRAC, поскольку неродственный датчик FRET (CFP-18aa-YFP) не действовал. ответить на PMA (новый рисунок 4 — приложение к рисунку 1A).Впоследствии мы провели электрофизиологические эксперименты на клетках, сверхэкспрессирующих наши конструкции LRRC8 с флуоресцентной меткой, и на клетках дикого типа с эндогенным VRAC, чтобы исследовать роль киназ, активированных DAG (и PMA).

Примечательно, и сначала в явном противоречии с нашими результатами измерений FRET, мы обнаружили, что PMA не активировал VRAC в зажатых клетках (новый рисунок 4B). Приложение PMA не повлияло ни на текущую, ни, что удивительно, на cFRET.Однако, когда мы инкубировали клетки с PMA перед установлением конфигурации целых клеток, мы обнаружили активацию флуоресцентно-меченного VRAC и эндогенного VRAC, как показано на новом рисунке 4C. Таким образом, мы могли бы подтвердить наши данные cFRET электрофизиологическими методами и впервые продемонстрировать, что цельноклеточная фиксация клеток влияет на передачу сигналов в пути активации VRAC, возможно, посредством клеточного диализа. Электрофизиологические измерения дополнительно подтвердили ингибирующий эффект DOG (ингибитор киназы DAG) на инактивацию VRAC после гипотонии как для флуоресцентно меченных LRRC8, так и для эндогенного VRAC (новый рисунок 5C), подтверждая роль передачи сигналов DAG в активации VRAC.

Наши попытки подтвердить влияние Gö6983 на cFRET электрофизиологическими измерениями привели к парадоксальным результатам. В клетках, содержащихся в цельноклеточной конфигурации патч-зажим, мы наблюдали огромное увеличение cFRET в четыре раза, что мы просто не можем объяснить. Параллельно Gö6983 не ингибировал токи VRAC, фактически искажая предполагаемую роль PKC в активации VRAC. В самом деле, мы бы упустили этот момент, если бы не проводили контрольные электрофизиологические эксперименты, предложенные тремя рецензентами.Мы соответствующим образом изменили все соответствующие утверждения в рукописи. Вместо этого применение Gö6983 уменьшило инактивацию токов, когда мы изменили буфер с гипотонического на изотонический. Мы показываем эти данные на новом Рисунке 4 — в приложении 2, но не делаем однозначных выводов.

Исключив PKC в качестве основного медиатора активации VRAC диацилглицерином (или PMA), мы протестировали PKD, которая также может быть привлечена к мембране и активирована DAG (и PMA). В отличие от Gö6983, ингибитор PKD CRT 0066101 уменьшал индуцированные гипотонией токи VRAC как во время зажима, так и при применении до прорыва мембраны (новый рисунок 5A, B).

Рецензент № 3:

Анионные каналы с регулируемым объемом (VRAC) играют центральную роль в модуляции объема клеток у животных, обеспечивая выход ионов хлора и более крупных осмолитов из клетки при активации в гипотонических условиях и, следовательно, противодействуя набуханию клеток. Эти каналы представляют собой гетерогексамеры, состоящие из обязательной субъединицы LRRC8A и дополнительных субъединиц LRRC8-B-E. Механизм активации VRAC не изучен, но было высказано предположение, что он связан с конформационными изменениями на его С-конце, и было показано, что он запускается снижением ионной силы в восстановленной системе.В настоящей рукописи Бенджамин Кениг и его сотрудники конструируют основанный на FRET датчик активности VRAC путем слияния С-концов различных субъединиц с любым из двух флуоресцентных белков, способных к FRET. Авторы показывают изменения FRET в ответ на гипотоническую среду, которые являются обратимыми при возвращении к изотоническим условиям, с кинетикой и фармакологией, которые согласуются с сигналом, происходящим от активации VRAC. Они также показывают, что обусловленные гипотоничностью изменения FRET происходят только для каналов в плазматической мембране, тогда как те, которые расположены во внутриклеточных компартментах (ER и golgi), не обнаруживают изменений в FRET.Они демонстрируют, что требование активности локализации в плазматической мембране не связано с различиями в концентрации холестерина или целостностью актинового цитоскелета. Напротив, авторы обнаружили, что стимуляция активности PKC приводит к заметным изменениям FRET, подобным тем, которые производятся гипертонической средой, тогда как ингибирование PKC предотвращает изменения FRET в ответ на гипотоническую среду. Авторы разработали набор умных инструментов для отслеживания активности VRAC, не требуя электрофизиологических измерений, и предоставляют релевантную информацию о физиологических условиях клетки, которые обеспечивают активность VRAC, и о роли С-конца в активации канала.Однако я думаю, что рукопись была бы намного сильнее, если бы авторы предоставили более прямые доказательства того, что изменения FRET действительно связаны с активацией канала. Кроме того, они должны устранить некоторые очевидные несоответствия в своих наблюдениях, а также в отношении опубликованных данных, а также предоставить дополнительную информацию о некоторых экспериментах.

Благодарим рецензента за в целом положительные комментарии. Мы рассмотрели опасения рецензента, как описано ниже.

У меня есть следующие конкретные проблемы:

1) Все выводы в рукописи основаны на предположении, что наблюдаемые изменения FRET отражают активацию канала.Однако доказательства, подтверждающие это, не являются прямыми, а скорее зависят от коррелятивных наблюдений за эффектами неспецифических методов лечения, которые также могут влиять на другие процессы в клетке. Возможно, что изменения FRET отражают конформационное изменение, независимое или, по крайней мере, частично независимое от активации. Этот вопрос особенно важен, учитывая, что роль С-конца в активации не установлена. Я думаю, что рукопись была бы значительно сильнее, если бы авторы могли предоставить более прямые доказательства этого, выполнив электрофизиологические измерения в сочетании с измерениями FRET, или используя дополнительные специфические ингибиторы VRAC, или проведя эксперименты с потерявшими функцию субъединицами VRAC.

Как было предложено рецензентами, сейчас мы выполнили электрофизиологические измерения одновременно с измерениями cFRET. Новые результаты демонстрируют четкую корреляцию изменений cFRET с токами VRAC. Это показывает, что датчик FRET является полезным инструментом для изучения активности VRAC и что С-концы перемещаются во время активации VRAC. Мы не претендуем на строгую роль C-конца в активации VRAC.

2) Одним из основных наблюдений в статье является то, что для наблюдаемых изменений FRET и активации каналов требуется локализация в плазматической мембране.Однако существует значительное количество внутриклеточно расположенных субъединиц LRRC8 даже без обработки BFA (см., Например, LRRC8E-RFP на рисунке 2C), и сигналы FRET, зависящие от гипотоничности, показанные на рисунке 1, по-видимому, исходят из всей клетки (см. Рисунок 1D). Авторы должны устранить это очевидное противоречие и предоставить подробную информацию о том, как они выполняли свой анализ для измерения сигналов, в основном исходящих от плазматической мембраны. Наблюдение, что LRRC8E, по-видимому, в большей степени удерживается в ER, чем LRRC8A (см. Рисунок 2C), по-видимому, противоречит наблюдению о том, что соотношение 8A / 8E не коррелирует с наблюдаемыми изменениями FRET, за исключением случаев, когда большая часть измеренного сигнала FRET происходит из плазматической мембраны.Авторы должны обсудить эти вопросы.

Благодарим рецензента за поднятие этой проблемы. В самом деле, часть любой субъединицы LRRC8 часто застревает в секреторном пути, как мы наблюдали ранее для экзогенно экспрессируемых комбинаций LRRC8 (Voss et al., 2014). Количество сигнала, не поступающего от плазматической мембраны, показало высокую вариабельность, при этом некоторые клетки показали много LRRC8A, а некоторые клетки LRRC8E внутриклеточно. Обычно существует тенденция к тому, что LRRC8E больше застревает в эндомембранной системе, но, что важно, мы не наблюдали корреляции с уровнями экспрессии.Поскольку VRAC могут принимать различные стехиометрии субъединиц, это указывает на то, что количество правильно спаренных (и задействованных) субъединиц также не зависит от уровней экспрессии. Соответственно, мы не наблюдали корреляции между абсолютными нормализованными по акцепторам значениями cFRET и уровнями экспрессии LRRC8E (не показаны). Действительно, сигнал YFP, исходящий из части ячейки с небольшим CFP (LRRC8A), не будет вносить вклад в реальный сигнал FRET правильно сформированных каналов VRAC (см. Отсутствие совместной локализации на рисунке 2C), но он действительно снизит акцептор -нормализованный cFRET (см. уравнение в разделе «Материалы и методы»).Однако, поскольку мы не наблюдали корреляции между уровнями экспрессии и внутриклеточной локализацией, нет никакой корреляции между соотношением экспрессии 8A / 8E и снижением cFRET (Рисунок 1 — приложение к рисунку 2B). Мы согласны с рецензентом, что это важный вопрос, который заслуживает пояснения в рукописи, и поэтому добавили соответствующее утверждение (подраздел «Межсубъединичный FRET показывает движение С-конца во время активации VRAC»).

3) Авторы должны обсудить очевидное противоречие своих данных с наблюдениями в реконструированной системе, где пониженная ионная сила достаточна для активации каналов VRAC.

В самом деле, Syeda et al., (2016) наблюдали активацию комплексов LRRC8, восстановленных в бислоев мембран за счет пониженной ионной силы. До сих пор у нас нет объяснения этому очевидному противоречию, за исключением среды VRAC, то есть системы искусственных мембранных двух слоев по сравнению с клеточным контекстом. В клеточном контексте, однако, есть несколько исследований, подтверждающих активацию VRAC без изменения ионной силы. Кроме того, изменения ионной силы, необходимые для активации VRAC, обычно не достигаются в экспериментах с использованием конфигурации целых клеток для изучения VRAC.Недавно это было подробно рассмотрено Стрэнджем и др. (2019). Следуя предложению рецензента, мы расширили наше обсуждение этого вопроса, добавив также дополнительные цитаты из важных исследований регулирующей роли ионной силы в активации VRAC (раздел «Обсуждение»).

4) Из изображений на Рисунке 3B я не могу определить, какие каналы локализованы в ER по сравнению с Гольджи, даже несмотря на то, что авторы использовали маркер для экспрессии Гольджи. Авторы должны использовать маркеры ER, Гольджи и плазматической мембраны, а также предоставить полуколичественный анализ, чтобы продемонстрировать расположение различных популяций каналов, а также предоставить более подробное описание того, как они выбрали свои области интереса для выполнения группового анализа каналов в каждом из каналов. клеточные отсеки.

Мы добавили изображения (новый рисунок 3 — приложение к рисунку 1), показывающие совместную локализацию LRRC8A-CFP-FM2 с маркером ER ER-YFP, маркером Гольджи GalNAc-RFP и с CD4-YFP в качестве маркера плазматической мембраны. после выхода из блока агрегации. Мы предоставляем полуколичественный анализ репрезентативной клетки, в которой мы прослеживаем конструкцию LRRC8A-CFP-FM2 через секреторный путь (Рисунок 3 — видео 1; количественные данные показаны для каждого временного интервала), для которого мы измеряем интенсивность флуоресценции CFP в область Гольджи и ROI для плазматической мембраны (изображено на видео).Мы добавили более подробное описание выбора ROI в подраздел «Система обратной агрегации».

5) На рисунке 1 — приложение к рисунку 1, авторы должны показать чистый FRET, а не нормализованные значения, чтобы читатели могли увидеть, насколько вариативность FRET была между элементами управления и VRAC.

Чистые значения FRET для наших флуоресцентно меченных субъединиц VRAC сильно различались, при этом измеренная эффективность FRET составляла от 10% до 80%.Вероятно, это связано с гибкой стехиометрией субъединиц гексамерных комплексов VRAC, по крайней мере, при экзогенной экспрессии LRRC8 (например, Gaitán-Peñas et al., 2016). Соответственно, cFRET (то есть скорректированное значение FRET, нормализованное к уровню акцептора) варьировалось в популяции клеток, что требовало нормализации значений. Относительное снижение cFRET во время активации VRAC не зависело от чистого FRET данной клетки, точно так же, как оно не коррелировало с соотношением экспрессии субъединиц (см. Точку 2 и рисунок 1 — приложение к рисунку 2B).Поэтому мы решили не показывать чистые значения FRET, поскольку это не добавит ценной информации. Однако теперь мы указываем вариабельность FRET как причину для нормализации (подраздел «Акцепторное фотообесцвечивание, сенсибилизированное излучение и ратиометрические анализы FRET»). Чистые значения FRET для контрольных конструкций FRET (CFP-18aa-YFP и GluA2-6Y-10C), с другой стороны, показали небольшую вариабельность между клетками, но мы также представляем их как нормализованные значения для ясности.

6) Авторы должны показать, влияет ли лечение LatB или MbCD на чистые уровни FRET, а не только на нормализованные значения.

Чистые значения FRET сильно различаются в зависимости от объясненных ячеек (см. Наш ответ на пункт 5). Среднее значение этого сильно изменчивого значения не изменилось обработкой LatB или MbCD: мы наблюдали среднее (ненормализованное) cFRET 52 ± 15% (необработанные клетки в изотоническом буфере), 45 ± 17% (LatB) и 47 ± 12% (МБКД). Мы предпочитаем не представлять эти данные в рукописи, так как считаем, что они не предоставят дополнительную полезную информацию.

7) Аннотация, заголовок и весь текст, по-видимому, подразумевают, что активация PKC связана с физиологической активацией VRAC при воздействии гипотонических растворов.Однако представленные данные на самом деле не устанавливают связь между стимуляцией VRAC PKC и изменениями внеклеточной осмолярности. Вполне может быть, что PKC-стимулированные VRAC действительно активируются ионной силой, и что эта чувствительность скрывается за счет ингибирования PKC. Авторы должны предоставить более подробное обсуждение того, как PKC может влиять на активность канала, даже если оно основано только на предположениях.

Этот аспект рукописи существенно изменился после новых измерений патч-зажима и осознания того, что PKC не так важен, как мы предполагали.Вместо этого мы демонстрируем гораздо более сильную связь с передачей сигналов DAG-PKD, потому что мы можем активировать, ингибировать или поддерживать токи VRAC в отсутствие или в противовес гипотоничности.

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно.Ниже приведены наиболее частые причины:

• В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки вашего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
• Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
• Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
• Дата на вашем компьютере в прошлом.Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
• Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу.Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в cookie-файлах может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта.Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

границ | Конверсия цитохрома P450 2D6 человека в инструмент на основе FRET для мониторинга аймалицина в живых клетках в реальном времени

Введение

Аджмалицин, природный монотерпеноидный алкалоид индола, представляет собой биоактивное соединение, хорошо известное своей антигипертензивной и антимикробной активностью (Moreno et al., 1995; Дас и Сатьяпракаш, 2018). Он также используется для снятия обструкции церебрального кровотока и продемонстрировал свой потенциал при лечении болезней системы кровообращения (Misra et al., 2006). Адренергическая блокировка и центральная депрессивная активность этого алкалоида была оценена Бхаргавой и Борисоном (1957). Сообщалось также о цитотоксической активности аджмалицина (Dey and De, 2012). Ранее предполагалось, что аджмалицин, наряду с другими гетероохимбиновыми алкалоидами, действует как предшественник различных оксиндольных алкалоидов, которые проявляют множество биологических активностей (Stavrinides et al., 2016). Кора корня R. serpentina и C. roseus , являющихся значительными источниками аджмалицина, была неизбирательно использована для экстенсивного извлечения аджмалицина из-за его высокого спроса (Zheng and Wu, 2004; Mallick et al., 2012; Fulzele, Namdeo, 2018). Кроме того, низкое содержание алкалоидов в растениях требует использования природных источников в больших количествах. В то же время значительное истощение природных источников исследовало вопрос, вызывающий озабоченность окружающей среды (Zafar et al., 2019). Следовательно, требуется устойчивое и увеличенное производство за счет тщательного изучения метаболических взаимодействий, участвующих в синтезе алкалоидов. Предыдущие попытки повысить продуктивность аджмалицина с помощью клеточных суспензионных культур, культур во встряхиваемых колбах, культур волосатых корней, методов выявления и лабораторных подходов к масштабированию, несомненно, способствовали повышению урожайности (Schlatmann et al., 1993; ten Hoopen et al., 1994; Альмагро и др., 2010). Однако возможность реализации достижений в более крупном масштабе сталкивается с трудностями, связанными с непомерно высокими затратами и трудозатратами.Учитывая нынешние блокады на пути повышения продуктивности алкалоидов, флуксомическое исследование могло бы щедро разрешить проблему, определив регуляторные элементы, влияющие на поток в метаболическом пути. Флюксомный подход к мониторингу динамики аджмалицина in vivo и может быть многообещающим в области исследований для понимания сложного взаимосвязанного клеточного метаболизма и может справедливо устранить препятствия, связанные с его низким выходом и производством. Возможность контролировать поток аджмалицина в реальном времени может быть предложен наносенсором FRET, разработанным в настоящем исследовании.Это обещает обеспечить высокое пространственное и временное разрешение при изучении потока аджмалицина. На сегодняшний день наносенсоры FRET были успешно разработаны для in vivo исследования различных аналитов, таких как лизин (Ameen et al., 2016), глицин бетаин (Ahmad et al., 2016), цинк (Mohsin et al., 2015 ), глюкозу (Fehr et al., 2003), глутамат (Okumoto et al., 2005) и рибозу (Lager et al., 2003). Учитывая потребность в инструменте, который может выполнять поток аджмалицина в живой системе в реальном времени, в этом исследовании был разработан генетически кодируемый наносенсор на основе FRET.

Наносенсоры FRET следуют общей конструкции, состоящей из сэндвича с анализируемым специфическим лиганд-связывающим белком между донорными и акцепторными флуоресцентными белками. Выбор лиганд-связывающего белка осуществляется на основе его способности претерпевать конформационные изменения в присутствии целевого аналита. Измененная конформация связывающего лиганд белка путем связывания целевого аналита приводила к передаче безызлучательной энергии от донорного флуоресцентного белка к акцепторному флуоресцентному белку (пара FRET), демонстрируя измененную интенсивность излучения флуорофоров.Наносенсор использует переменную интенсивность излучения в качестве меры изменения концентрации метаболита, помогая в исследовании потока. Прелесть этих генетически закодированных наносенсоров на основе FRET заключается в том, что мониторинг метаболитов может выполняться в любом типе клеток и многократно.

Материалы и методы

Разработка химерной конструкции

Человеческий цитохром P450 2D6, связывающий аймалицин белок, был использован в качестве элемента для связывания аджмалицина для разработки наносенсора.Структура белка была проанализирована с использованием RCSB PDB (PDB ID-4WNT, разрешение 2,6 Å), и нуклеотидная последовательность гена (CYP2D6), кодирующего белок, была получена из KEGG (KEGG Entry-1565). КДНК человеческого CYP2D6 была приобретена у Sinobiologicals Inc., и амплификация гена была достигнута с использованием набора из двух праймеров: 5′- accggt cccctggccgtgatagtggccatctt-3 ‘(FP) и 5’- ccggt ctagcggggcacagcacaaa (RP), содержащий сайты рестрикции Age I, обозначенные здесь курсивом.Кроме того, вектор pDh28 был использован для амплификации нуклеотидных последовательностей ECFP и Венеры, причем праймеры были сконструированы для добавления сайтов attB 1 и attB 2 на 5′-конце ECFP и 3′-конце Венеры, соответственно. Затем сайты рестрикции Age I, содержащие ген CYP2D6, лигировали между 3 ‘концом ECFP и 5’ концом Венеры, получая химерную последовательность ECFP_CYP2D6_Venus, клонированную в векторе pGEM-Teasy (Promega, США). Затем рекомбинантную химерную последовательность вводили в вектор pRSET B (Novagen, Германия) рестрикционным расщеплением по сайтам Bam HI и Hin dIII.Разработанная рекомбинантная конструкция pRSET-B_ECFP_CYP2D6_Venus была обозначена как FLIP-Ajn (флуоресцентный индикаторный белок аймалицина). Клонированную конструкцию дополнительно вводили в векторы экспрессии дрожжевых (pYES-DEST52), растительных (pEarleyGate100) и животных клеток (pCDNA-DEST-40) с использованием технологии клонирования Gateway (Invitrogen, США). Первоначально pRSET-B_ECFP_CYP2D6_Venus был перемещен к pDONR222 в реакции рекомбинации, опосредованной BP, для создания входного клона (pDONR222_ECFP_CYP2D6_Venus).PDONR222_ECFP_CYP2D6_Venus был дополнительно переведен на pYES-DEST52, pEarleyGate100 и pCDNA-DEST-40, генерирующие клоны экспрессии, pYES-DEST52_ECFP_CYP2D6_Venus, pEarleyGate100_ECFP_CYP2D6_Venus и pEarleyGate100_ECFP_CYP2D6_Venus, с использованием реакции pEarleyGate100_ECFP_CYP2D6_Venus и pEarleyGate100_ECFP_CYP2D6_Venus и pEarleyGate100_ECFP_CYP2D6_Venus-mediated response. Для проверки рекомбинационных конструкций был принят анализ секвенирования (рисунок S1).

Экспрессия и очистка наносенсорного белка

Конструкцию FLIP-Ajn трансформировали в клетки Escherichia coli BL21 (DE3) и оставляли для роста при 21 ° C в течение 24 часов для экспрессии.Рост клеток продолжался до O.D. ₆₀₀ ~ 0,6. Впоследствии экспрессия была инициирована добавлением синтетического аналога аллолактозы — изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида (IPTG). Индуцированные клетки выдерживали в шейкере инкубатора при 21 ° C в течение 48 ч, колбу накрывали и помещали в темные условия. Затем культуру центрифугировали при 4500 × g при 4 ° C в течение 15 минут и растворение осадка выполняли с помощью 20 мМ трис-Cl (pH 7,5). После этого была проведена обработка клеток ультразвуком для высвобождения белка наносенсора.Белок наносенсора был отделен от клеточного дебриса центрифугированием при 7800 об / мин в течение 30 мин. Сначала супернатанту давали связываться с Ni-NTA агарозной смолой (Qiagen, Германия) в течение 3 ч в чашке Петри и выдерживали при 4 ° C. Затем белок дважды промывали в аффинной колонке с меткой Ni-NTA His ледяным буфером, содержащим 20 мМ трис-Cl, pH 7,5 и 20 мМ имидазол. Наконец, элюцию белка проводили 20 мМ трис-Cl, pH 7,5 и 250 мМ имидазолом, и хранили для дальнейшего исследования.

Характеристики нанодатчика

Характеристику наносенсора проводили с помощью микропланшетного ридера (Synergy h2, Biotek, США). Первоначально спектральный анализ наносенсора проводился путем измерения интенсивности излучения ECFP и Венеры. ECFP подвергали возбуждению с длиной волны 430 нм, и излучение регистрировали посредством спектрального сканирования между 450 и 600 нм с интервалом 10 нм в присутствии и в отсутствие аджмалицина. После спектрального анализа были изучены зависимость от pH, специфичность и сродство наносенсора.Фильтры / щели, используемые для анализа, были 430 нм / 20 нм для возбуждения ECFP, 485 нм / 20 нм для испускания ECFP и 540 нм / 20 нм для испускания Венеры. Элюированный белок разводили в 20 раз в различных буферных системах, а именно, Tris-Cl, PBS, TBS и MOPS в диапазоне pH 5,5–7,5 для анализа зависимости pH и оптимальной буферной системы для характеристики наносенсора. Тестирование специфичности разработанного наносенсора проводили путем добавления 10 мМ различных ингибиторов / субстратов CYP2D6 к FLIP-Ajn.Эти соединения представляли собой резерпин, резциннамин, винбластин, винкристин, хинидин, серпентин, тиоридазин и хинин. Сродство наносенсора осуществляли путем титрования белка наносенсора при различных концентрациях аджмалицина. Значение, полученное из отношения интенсивностей излучения Венеры / ECFP (отношение FRET) при связывании лиганда, обеспечивает меру концентрации субстрата. Аффинность связывания аджмалицина (значение K _d ) определяли, применяя следующее уравнение к кривым титрования лиганда:

S = (r — r _апо ) / (r _sat — r _apo ) = [L] / ( K _d + [L]), где S означает насыщение; [L] для концентрации аджмалицина; r для соотношения; r _апо представляет собой соотношение без аймалицина и r _сат с аджмалицином.

Мониторинг аймалицина в реальном времени

Бактериальные клетки

Разработанную рекомбинантную конструкцию pRSET-B_ECFP_CYP2D6_Venus (FLIP-Ajn) вводили в клетки E.coli BL21 (DE3) и выращивали при 37 ° C (150 об / мин) в шейкере-инкубаторе до достижения O.D. ₆₀₀ бактериального роста достигло 0,6. Затем клетки обрабатывали 0,5 мМ IPTG и выдерживали в течение 24 часов при 21 ° C при непрерывном встряхивании для экспрессии белка наносенсора. Мониторинг содержания аджмалицина в бактериальных клетках в реальном времени осуществляли путем добавления 10 мМ аджмалицина к бактериальной культуре, помещенной в многолуночные планшеты.Отношения интенсивностей излучения Венеры / ECFP регистрировались в течение 30 минут, а данные собирались каждые 5 минут. Контрольный эксперимент включает бактериальные клетки без аджмалицина. Используемые фильтры / щели возбуждения были такими же, как описано в предыдущем анализе.

Дрожжевые клетки

Клонированный шлюзом pYES-DEST_ECFP_CYP2D6_Venus был трансформирован в штамм BY4247 Saccharomyces cerevisiae / URA3 . Трансформированные дрожжевые клетки культивировали в синтетической среде определенного (SD), содержащей декстрозу (2%) в качестве источника углерода и галактозу (1%) для индукции.Экспрессированные дрожжевые клетки подвергали конфокальному микроскопическому анализу с использованием сканирующей головки Leica TCS-SPE и линзы объектива 63x с системой масляной иммерсии. В экспрессированную культуру вводили 10 мМ аджмалицина. Отношения интенсивностей излучения Венеры / ECFP регистрировались в течение 10 мин, а данные собирались каждые 20 с.