(14)

Если донор не подает сигнал в акцепторном канале и наоборот, что означает, что S3 и S4 равны 0, то этот шаг можно пропустить, и сигналы можно использовать сразу после коррекции фона.

Скорректированные донорные и акцепторные сигналы могут использоваться для отделения фактического сигнала FRET от спектрального просачивания в канале FRET, согласно Youvan et al .{c}} $$

(18)

Моделирование экспериментов FRET

Для моделирования экспериментов FRET мы создали математическую модель, основанную на обобщенной форме закона действия масс, которая описывает состояние всех химических взаимодействий в состоянии равновесия.

$$ A + B \ rightleftharpoons \ text {AB}, \, {K} _ {a} = \ frac {[AB]} {[A] \ ast [B]} $$

(19)

Состояние равновесия, или, точнее, концентрации свободных и связанных фракций молекул, зависит от концентраций реагентов, а также их сродства, описываемого константой сродства K _a (или ее обратной величиной, константа диссоциации K _d ). K _a — постоянное значение для реакции при указанной температуре и давлении. Для расчета FRET мы можем использовать наши донор и акцептор как A и B соответственно.

$$ {K} _ {a} = \ frac {[complex]} {{[don]} _ {free} \ ast {[acc]} _ {free}} $$

(20)

$$ [сложный] = [don] — {[don]} _ {free} = [acc] — {[acc]} _ {free} $$

(21)

Когда эти формулы объединены и решены для [комплекса], количество связанных и свободных частиц может быть определено при заданной общей концентрации донора, акцептора и значения K _a .{2}} + [don] {K} _ {a} + \ frac {[acc]} {z} {K} _ {a} +1} {2 {K} _ {a}} $$

(24)

Важно отметить, что этот способ введения фактора стехиометрии подразумевает, что многочисленные молекулы донора или акцептора, которые появляются в комплексе, уже связаны друг с другом до взаимодействия между молекулами донора и акцептора. {c} \) и F ​​ ^c можно рассчитать, применив фиксированное значение максимальной эффективности FRET FRET _max , которое представляет эффективность FRET, если все донорные и акцепторные молекулы были задействованы в донорно-акцепторном комплексе, а также спектральные коэффициенты просачивания S1, S2, S3 и S4.

$$ {D} _ {da} = {[don]} _ {free} + [complex] \ ast (1-FRE {T} _ {max}) + ({[acc]} _ {free} + [сложный]) \ ast {S} _ {4} $$

(26)

$$ {A} _ {da} = {[acc]} _ {free} + [complex] + (\, {[don]} _ {free} + [complex] \ ast (1-FRE {T } _ {max})) \ ast {S} _ {3} $$

(27)

$$ {F} _ {da} = [комплекс] \ ast FRE {T} _ {max} + S1 \ ast {D} _ {da} + S2 \ ast {A} _ {da} $$

(28)

Для вычислительного моделирования модель можно упростить, установив для S1, S2, S3 и S4 значение 0, что не влияет на математическое моделирование.

Из полученных значений были рассчитаны показатели FRET в соответствии с уравнениями с 16 по 18.

Подгонка результатов FRET

Для получения трех количественных переменных K _a ^app , z и FRET _max , мы модифицировали результаты наших измерений в имитационную модель. Чтобы напрямую использовать интенсивности донорного и акцепторного каналов, а также результирующий DFRET для подгонки, мы немного изменили формулу, чтобы получить меру FRET вместо концентрации комплекса.{app}} \ ast \ frac {FRE {T} _ {max}} {don} $$

(31)

Подгонка была проведена с помощью нелинейной модели наименьших квадратов, минимизирующей отклонение теоретических и реальных значений за несколько итераций. Подгонка модели может быть непосредственно применена к измеренным значениям, но должна быть ограничена значимой областью около стехиометрии комплекса. Для простого взаимодействия 1: 1 мы применяем модель ко всем значениям с отношением акцептора к донору от 0,2 до 2.

Статистическая информация

Статистические значения для подгонки модели были определены с помощью нелинейного алгоритма подгонки наименьших квадратов программного обеспечения R. Статистическая информация (где применимо) и n чисел приведены на соответствующих рисунках или в подписях к рисункам.

Реализованное программное обеспечение и код

Все описанные расчеты и оценки могут быть выполнены в свободно доступных ( R, ImageJ, CytExpert, FlowPy ) или общих (Microsoft Excel) программных пакетах.

Расчеты FRET, оценка FRET и моделирование были выполнены в Microsoft Excel (версия 2013). Приведены примеры таблиц данных (дополнительные шаблоны 1 и 2), включая объяснения по использованию и образец набора данных (дополнительные рисунки 8–10).

была выполнена в R (https://www.r-project.org/) с использованием команд нелинейной аппроксимации методом наименьших квадратов. Предоставляется код, используемый для фитинга (дополнительное примечание 2).

Весь написанный код, который использовался в этой работе, включая полностью автоматизированные макросы ImageJ и последовательности R-кода, предоставляется в качестве дополнения или доступен на Github по адресу https: // github.com / BHochreiter.

Динамическая настройка FRET в биосенсоре зеленого флуоресцентного белка

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Кристаллическая структура Twitch-2B

Мы расшифровали структуру с разрешением 2,5 Å (таблица S1A). Асимметричный блок состоит из двух мономеров (рис. S1A). Они представляют идентичные конформации отдельных доменов [среднеквадратичные отклонения (RMSDs) ниже 0,2 Å] и несколько иную междоменную конформацию (RMSD 0,992 Å), хотя, по-видимому, не собираются как симметричный гомодимер.Их интерфейс (рис. S1B), покрывающий 630 Å ² ( 11 ), на самом деле значительно меньше, чем интерфейс стабильного димера ( 12 ). Кроме того, данные малоуглового рентгеновского рассеяния (МУРР) показывают, что в растворе Twitch-2B является мономерным (рис. S2). Поэтому мы сфокусируем наше описание здесь на мономере A. Кристаллическая структура показывает расположение донора и акцептора относительно минимального кальций-связывающего домена TnC, а также структуру оптимизированных линкеров (рис.1). Структура кальций-связывающего домена очень похожа на C-концевой глобулярный домен куриного TnC (RMSD 0,84 Å) ( 13 ), на структуру ЯМР, решенную ранее ( 8 ), и на структуру кальмодулина. (RMSD 1,08 Å) ( 14 ). Главные оси двух бочкообразных β-доменов флуоресцентного белка ориентированы почти под перпендикулярным углом друг к другу. Стволы β практически не контактируют друг с другом (рис. 2A) с очень маленькой общей границей раздела (150 Å ² ).Интерфейсы минимального кальций-связывающего домена с mCerulean3 и cpVenus ^cd также относительно невелики, покрывая только 257 и 351 Å ² , соответственно (см. Ниже). Взаимодействия в основном носят гидрофильный характер (рис. 2А).

( A ) Полярные взаимодействия между остатками минимального домена TnC, mCerulean3 и cpVenus ^cd показаны пунктирными линиями. Остатки показаны в виде палочек.( B ) Полярные взаимодействия, опосредованные остатками (показаны в виде палочек) от линкеров между mCerulean3 и кальций-связывающим доменом (у лосося), а также взаимодействия между cpVenus ^cd и кальций-связывающим доменом (пурпурный) . ( C ) Гидрофобные взаимодействия между остатками (показаны в виде стержней) линкеров между mCerulean3 и кальций-связывающим доменом (у лосося), а также линкером между cpVenus ^cd и кальций-связывающим доменом (пурпурный) с остатками (серым цветом) из ядра минимального домена TnC.( D и E ) Крупный план области вокруг N532 Twitch-2B и мутанта N532F Twitch-2B (Twitch-6).

Линкер между mCerulean3 и кальций-связывающим доменом (V ₂₃₂ ADA) образует спираль 3 ₁₀ , которая прочно удерживается на месте водородными связями основной цепи от V232 и S236 в mCerulean3 до E301 и E239 кальция. -связывающий домен (рис. 2Б). Далее линкер между кальций-связывающим доменом и cpVenus ^cd (P ₃₀₅ IYPEL) образует полтора α-спиральных витка (рис.2, B и C), карбонилы основной цепи E309 и L310 образуют водородные связи с боковой цепью R551 (рис. 2B) cpVenus ^cd . Боковая цепь E309 также образует водородную связь с Y152 mCerulean3, плотно связывая три домена вместе. Остатки I306, Y307 и L310 этой короткой спирали участвуют в сети гидрофобных контактов (рис. 2C). Очевидно, что скрининг оптимальных линкеров ( 8 ) привел к последовательностям со спиральными особенностями, очень хорошо интегрирующимися в структуру минимального домена TnC, в то время как эти линкеры удерживают на месте донорный и акцепторный домены в основном за счет полярных взаимодействий.

Расчет эффективности FRET на основе структуры

Структура предоставила важную информацию для расчетов FRET. Во-первых, расстояние между центрами масс флуорофоров составляет 3,65 нм (рис. 1B). Затем внутри структуры флуорофоры mCerulean3 и cpVenus ^cd выровнены в конфигурации «голова к голове». Таким образом, мы могли точно определить относительную ориентацию дипольных моментов флуорофоров (рис. 1C; см. Материалы и методы), которые доступны из расчетов теории функционала плотности ( 15 ).Используя эту объединенную информацию, мы рассчитали фактор ориентации κ ² , равный 1,98 (уравнение 1; материалы и методы), и расстояние Ферстера, R ₀ , 6,9 нм для mCerulean3 / cpVenus ^cd . Пара FRET (уравнение 3; материалы и методы). С этими параметрами, используя уравнение Фёрстера, E = R06 / (R06 + r6), теоретическая эффективность FRET, E , Twitch-2B была определена как 0,98. Эффективность FRET, экспериментально определенная с помощью деканшинга донора, равна 0.78 (рис. S3A), что значительно ниже, чем полученное из кристаллической структуры.

Два мономера Twitch-2B в асимметричном блоке (рис. S1A) не только имеют очень похожую конформацию (RMSD основной цепи 0,992 Å), но также образуют очень похожие контакты упаковки кристаллов (рис. S1C). Таким образом, мы делаем вывод, что ориентация доменов в мономере сама по себе не ограничивается кристаллической упаковкой, а в основном внутримономерными взаимодействиями, описанными выше (рис. 2А), и очень вероятно выбрана из пула уже существующих конформаций в растворе.Поскольку междоменные интерфейсы в мономере Twitch-2B относительно малы (рис. 2A), высокая гибкость решения может быть причиной наблюдаемого снижения эффективности FRET. Чтобы исследовать эту гипотезу, мы затем обратили внимание на передовые методы ЯМР.

ЯМР-исследование динамики биосенсора

Чтобы получить представление о возможной динамике, мы использовали парамагнитный ЯМР ( 16 ) с образцом Twitch-2B, где два сайта связывания кальция TnC были загружены диспрозием (Dy).Анизотропная магнитная восприимчивость комплекса TnC-Dy ₂ индуцирует парамагнитный тензор выравнивания, который может быть определен из структуры ( 17 ) (см. Материалы и методы). Мы использовали спектрометры на 900 МГц и 1,1 ГГц, поскольку тензор юстировки квадратично зависит от магнитного поля. Если данный флуоресцентный белок является жестким по отношению к TnC, то тензор выравнивания, который он испытывает, идентичен TnC. Если, однако, флуоресцентный белок является динамическим по отношению к TnC, то это движение уменьшит тензор выравнивания первого ( 16 , 18 ).Это позволяет количественно оценить динамику флуоресцентных белков по отношению к TnC. В то время как диполярные связи усредняются в изотропном растворе из-за случайного изотропного переворачивания, парамагнитно-индуцированные тензоры выравнивания приводят к анизотропному распределению ориентации TnC и, следовательно, прикрепленных зеленых флуоресцентных белков в растворе, что приводит к неполному усреднению диполярного муфты, позволяющие наблюдать остаточные диполярные связи (RDC). Мы определили RDC метильных групп парамагнитно выровненного Twitch-2B ( 19 ) (см. Материалы и методы).Наблюдаемый диапазон RDC достаточен для измерения размера тензора выравнивания ( 20 ), так что отнесение метильных групп не было необходимым.

Мы обнаружили, что диапазон значений RDC и, следовательно, тензор выравнивания, испытываемый флуоресцентными белками, в 10 раз меньше, чем рассчитанные по жесткой рентгеновской структуре (рис. 3; см. Материалы и методы). Таким образом, динамика должна быть причиной несоответствия между расчетной и экспериментальной эффективностями FRET.Кристаллическая структура может быть только частью динамического конформационного ансамбля в растворе.

Прогнозирование RDC метильных групп в двух доменах флуоресцентного белка и TnC с использованием рентгеновской структуры (выделено пурпурным цветом). Тензор выравнивания, индуцированный двумя ионами диспрозия, связанными с TnC, является результатом трансляции тензора, полученного из кальмодулина (см. Материалы и методы). Экспериментальные RDC от парамагнитного ЯМР Twitch-2B (зеленый) и Twitch-6 (пурпурный).Дальность действия уменьшается в 10 и 5 раз для Twitch-2B и Twitch-6 соответственно.

Конструирование мутанта на основе структуры с улучшенной эффективностью FRET

Предполагая структурную целостность отдельных доменов, мы предположили, что линкерные области являются стержнем этой динамики. На границах раздела между доменом TnC и донорным и акцепторным доменами преобладают полярные взаимодействия (рис. 2А). Мы предположили, что замена этих взаимодействий гидрофобными контактами сделает линкеры жесткими и увеличит экспериментальную эффективность FRET.С этой целью мы разработали мутацию N532F (рис. 2, D и E) на поверхности cpVenus ^cd , создавая новое взаимодействие с F249 кальций-связывающего домена (рис. 2D). Как и ожидалось, эта мутация вызвала существенное увеличение максимального изменения отношения FRET с 800 до 1100% in vitro (рис. S4). В кристаллической структуре этого мутанта (Twitch-6; таблица S2) боковая цепь F532 действительно связывается в гидрофобный карман, образованный боковыми цепями F249, Asp262 и Y338 (рис. 2E).В остальном структуры Twitch-6 и Twitch-2B очень похожи (RMSD 0,25 Å), что приводит к почти идентичной теоретической эффективности FRET (см. Дополнительные материалы). Благодаря этой конструкции экспериментальная эффективность FRET Twitch-6 увеличилась до 0,90, с 0,78 для Twitch-2B (рис. S3B), а диапазон RDC, измеренных с Twitch-6, удвоился по сравнению с Twitch-2B (рис. 3). . Это указывает на сужение интерфейса между доменом TnC и cpVenus ^cd , и, таким образом, снижение динамики между доменами является причиной увеличения FRET.

Конформационные ансамбли в решении

Определив динамику как причину снижения эффективности FRET Twitch-2B в решении, мы хотели получить представление о конформационном пространстве, возникающем в результате этой динамики. Для этой цели мы выбрали конформационные ансамбли, исследующие динамику скелета исключительно на динамических линкерных областях между доменами флуоресцентного белка и доменом TnC (см. Материалы и методы), оценивая более 1 миллиона шестичленных ансамблей в сравнении с наблюдаемыми RDC и эффективностью FRET (Таблица 1, рис.4 и Материалы и методы). Среди всех возможных ансамблей мы выбрали тот, который лучше всего воспроизводит как экспериментальную эффективность FRET, так и диапазон RDC (Таблица 1). Этот ансамбль полностью объясняет, как гибкость неупорядоченных остатков линкерных областей приводит к наблюдаемому снижению эффективности FRET и диапазона RDC.

Ансамбли для Twitch-2B (слева) и Twitch-6 (справа) содержат по шесть структур каждый, причем самые большие отклоняющиеся структуры показаны зеленым и красным.Состояния, которые не являются этими крайними конформациями, прозрачны.

Влияние на улучшенную конструкцию датчика FRET

Таким образом, мы получили кристаллическую структуру флуоресцентного кальциевого биосенсора Twitch-2B и вместе с динамикой линкеров, определенной с помощью парамагнитного ЯМР, мы количественно оценили эффективность FRET. Поскольку динамика ограничивала эффективность FRET, мы успешно сконструировали ригидифицированный мутант с увеличенным FRET. Таким образом, структурные и динамические характеристики ратиометрических датчиков FRET обеспечили принципы проектирования, которые могут быть применимы к другим системам, в которых эффекты FRET используются для восприятия сигналов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клонирование, экспрессия и очистка Twitch-2B и Twitch-6

Конструкция Twitch-2B была описана ранее ( 8 ). Для настоящего исследования кодирующую последовательность трехдоменного слитого белка клонировали в модифицированный вектор pET16b, кодирующий слитый белок с N-концевой меткой His ₇ и последовательностью расщепления, распознающей вирус травления табака (TEV). Мутант Twitch-2B N532F (Twitch-6) был создан с использованием набора для сайт-направленного мутагенеза QuikChange (Agilent).Экспрессионные конструкции pET16bTEV-Twitch-2B и pET16bTEV-Twitch-6 трансформировали в штамм Escherichia coli BL21 (DE3). Экспрессию белка проводили при 303 К индукцией 0,5 мМ изопропил-β-d-1-тиогалактопиранозидом. Клетки собирали через 7 часов после индукции. Меченный селенометионином белок Twitch-2B был сверхэкспрессирован в штамме B834 метионин-ауксотрофа E. coli в минимальной среде с добавлением (+) — l-селенометионина в соответствии с группой экспрессии белка EMBL (Европейская лаборатория молекулярной биологии) (www. embl.de).

Осадок клеток из 1 литра встряхиваемой культуры ресуспендировали в 60 мл лизирующего буфера [20 мМ трис-HCl (pH 7,9), 300 мМ NaCl, 20 мМ имидазол, 0,5 мМ фенилметилсульфонилфторид с одной таблеткой полного количества ЭДТА- свободных ингибиторов (Roche) на 100 мл лизирующего буфера]. Клетки лизировали ультразвуком с последующим центрифугированием при 27000 g и 277 К. Из супернатанта рекомбинантный белок очищали с помощью аффинной хроматографии с иммобилизованным металлом на 3 мл агарозной смолы Ni-нитрилотриуксусной кислоты (NTA) (Qiagen).Метку слияния His ₇ отщепляли протеазой TEV и удаляли инкубацией с 1 мл Ni-NTA агарозной смолы. Белок диализовали против 20 мМ трис (pH 7,0) и 150 мМ NaCl. После доведения концентрации сульфата аммония в растворе белка до 1 М белок дополнительно очищали хроматографией на гидрофобном взаимодействии на колонке с фенилсефарозой объемом 10 мл (GE Healthcare). Белок элюировали с этой колонки 50-мл градиентом от 1 до 0 М сульфата аммония. Фракции, содержащие белок, объединяли и концентрировали до объема 2,5 мл с помощью концентратора для ультрафильтрации с MWCO (пороговая молекулярная масса) 30 кДа (Vivascience). Наконец, белок очищали эксклюзионной хроматографией на гель-фильтрационной колонке HiLoad 26/60 Superdex 200 мкг. Фракции пика объединяли, диализовали против 20 мМ трис-HCl (pH 7,0), 100 мМ NaCl и 5 мМ CaCl ₂ , и концентрацию белка доводили до 20 мг / мл.

Флуоресцентная спектроскопия

Для спектроскопии рекомбинантного Twitch-2B in vitro белок был очищен от E.coli с использованием смолы Ni-NTA, как описано ( 6 ). Спектроскопию выполняли на спектрофотометре Cary Eclipse (Varian). Донорское расщепление Twitch-2B проводили путем переваривания Twitch-2B в связанном с кальцием состоянии в течение ночи при комнатной температуре с химотрипсином (70 Ед / мл; Sigma-Aldrich) при записи FRET. Небольшое оставшееся излучение cpVenus ^cd после переваривания химотрипсина было выборочно фотообесцвечено (5 мин) с помощью матрицы из шести светодиодов Luxeon Lumiled с пиком на длине волны 530 нм, для общей рассеиваемой мощности 14. 7 Вт и 870 люмен. Для защиты mCerulean3 от обесцвечивания использовали LP (длиннопроходный) фильтр с длиной волны 500 нм. Связанный с кальцием Twitch-6 был очень устойчив к перевариванию протеазой. Следовательно, EGTA (конечная концентрация, 5 мМ) добавляли во время переваривания химотрипсина, чтобы получить спектр деквенированного mCerulean3.

Кристаллизация, сбор данных и определение структуры

Кристаллы Twitch-2B и Twitch-6 были получены путем диффузионного смешивания паров 1 мкл раствора белка с 1 мкл раствора для лунок [0.2 M Na-формиат (pH 7,0), 5 мМ CaCl ₂ и 18-20% полиэтиленгликоля 3350]. Кристаллы были подвергнуты криозащите, перенеся их в хорошо раствор с добавлением от 16 до 18% глицерина на 1 мин и быстро охладив, погрузив их в жидкий азот.

Сбор данных производился в PXII, SLS, Швейцария, с использованием детектора PILATUS 6M (Dectris). Собственные данные собирали при 100 К на длине волны 1 Å. Данные по производному селенометионина были измерены при 0,98 Å. Все данные были обработаны с помощью программного обеспечения для детектора рентгеновских лучей (XDS) ( 21 ) и масштабированы с помощью SADABS (Bruker AXS).Определение пространственной группы и статистический анализ выполняли с использованием XPREP (Bruker AXS). Фазирование выполняли с помощью AutoSol ( 22 ).

Первоначальная модель была построена с помощью AutoBuild и дважды уточнена с помощью phenix.refine ( 23 ) с промежуточным ручным построением модели с помощью Coot ( 24 ). Окончательная модель была получена путем комбинированного ручного отслеживания (Coot) и уточнения с использованием Refmac5 ( 25 ). На графике Рамачандрана 96,69% ​​остатков располагались в предпочтительной области 2.72% в разрешенной области и 0,58% остатков были выбросами. Кристаллическая структура Twitch-6 была решена с помощью PHASER ( 26 ), используя PDB (Protein Data Bank) запись 6GEL в качестве модели поиска. Построение и уточнение модели выполнялись, как описано для Twitch-2B. Для этого мутанта 96,68% остатков попали в предпочтительную область графика Рамачандрана, 2,83% попали в разрешенную область и 0,49% были выбросами.

Расчеты FRET

Фактор ориентации κ ² может быть извлечен из структурной информации следующим образом: κ2 = (cos θT — 3 cos θD cos θA) 2 (1) где θ _T — угол между эмиссионным переходом диполь донора и диполь перехода поглощения акцептора; θ _D и θ _A — углы между этими диполями и вектором r , соединяющим донорный и акцепторный флуорофоры ( 27 ).Ориентация дипольных моментов перехода относительно вектора связи C → O (ω) в градусах ωD = 73 ° ωA = 76 ° была взята из Ansbacher et al. ( 15 ), а угловые параметры были извлечены из кристаллографических координат в угловых единицах θT = 152,95 ° θD = 149,17 ° θA = 26,79 °

Подробные вычисления объяснены в файле данных S1. Интеграл перекрытия, Дж, (λ), был рассчитан из экспериментальных спектров поглощения и излучения изолированных доменов cpVenus и mCerulean3 соответственно (рис. S5) со сценарием Python, включенным в качестве дополнительной информации. J (λ) был определен как 2,052 × 10 ¹⁵ M ⁻¹ см ⁻¹ нм ⁴ , следующим образом: J (λ) = ∫0∞FD (λ) εA (λ) λ4dλ = ∫0∞FD (λ) εA (λ) λ4dλ∫0∞FD (λ) dλ (2) где F _D (λ) — нормированная интенсивность флуоресценции донора в диапазоне длин волн от λ до λ + Δλ. ε _A (λ) — коэффициент экстинкции акцептора при λ.

Расстояние Ферстера, R ₀ , может быть вычислено из ранее полученных экспериментальных параметров R0 = 0.211 (κ2n − 4QDJ (λ)) 1/6 (3) где Q _D (0,87) — квантовый выход донора в отсутствие акцептора ( 4 ) и n , (1,33) показатель преломления водной среды.

Наконец, эффективность передачи энергии, E , может быть рассчитана как отношение скорости передачи к общей скорости распада донора в присутствии акцептора E = R06R06 + r6 (4)

Следуя этой процедуре, эффективность FRET была определена как E = 0. 979, из кристаллографической структуры Twitch-2B. Эквивалентный расчет, выполненный со структурой мутанта Twitch-6, дает E = 0,983 (см. Файлы данных S1 и S2).

ЯМР-спектроскопия

Мы экспрессировали белки Twitch-2B и Twitch-6 в минимальной среде Toronto, приготовленной из 100% D ₂ O и пердейтерированной d-глюкозы и дополненной предшественниками аминокислот α-кетомасляной кислотой (метил-13C , 3,3-D2) и α-кетоизовалериановой кислоты (3-метил-13C, 3,4,4,4-D4), тем самым селективно мечение атомами ¹³ C и ¹ H только метильных групп остатки валина, лейцина и изолейцина, сохраняя при этом остальные атомы C как ¹² C и протоны как ² H ( 19 ).

Сначала были получены спектры изотропных образцов в буфере A [20 мМ Mops (pH 7,0), 100 мМ NaCl и 5 мМ CaCl ₂ в 100% D ₂ O]. Затем белки диализовали против буфера B [20 мМ Mops (pH 7,0), 100 мМ NaCl и 10 мМ EDTA] с последующим диализом против буфера C [20 мМ Mops (pH 7,0) и 100 мМ NaCl] и, наконец, заменяли на буфер С, приготовленный на 100% D ₂ O, содержащем три эквивалента диспрозия, перед измерениями ЯМР. Концентрация белка в образцах была примерно 0.5 мМ.

Образцы были протестированы с помощью экспериментов с метил-TROSY ( 19 , 28 ) (рис. S7) при 900 МГц и 1,1 ГГц, а связи J и J + RDC были определены с использованием J -модулированного Эксперимент с метил-TROSY ( 29 ), изображенный на рис. S6 в виде матриц 2048 × 128 комплексных точек данных с 96 переходными процессами на приращение ( t ₁ ). Общие использованные задержки модуляции J были следующими: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 и 20 мс (рис.S8). ЯМР-эксперименты проводились с использованием 5-мм TCI (криозонда тройного резонанса с инверсным детектированием) на спектрометре 900 МГц и 3-мм криозонда TCI на спектрометре 1,1 ГГц, оба оснащены консолями NEO (Bruker). Интенсивности (максимальная амплитуда) сигналов были извлечены с помощью CARA (компьютерное определение резонанса) ( 30 ) в экспериментах с обработкой NMRPipe ( 31 ) и проанализированы с помощью скриптов Python (рис. S8), следуя Pederson et al. ( 29 ).

Расчет парамагнитного тензора

Мы взяли парамагнитный тензор из комплекса кальмодулин-IQ, связанного с диспрозием, из ( 18 ) и рассчитали суммарный тензор дважды занятого кальцийсвязывающего домена TnC. Сайт связывания кальция 1 TnC перекрывается с сайтом связывания лантанидов кальмодулина (CaM N60D). Мы повернули матрицу выравнивания с сайта связывания кальция из CaM на второй сайт связывания кальция TnC и добавили его к тензору сайта связывания кальция 1, таким образом получив общий тензор TnC.Затем этот тензор использовался для расчета RDC из парамагнитных белков Twitch ACaM = (1,05 10−31−1,92 10−322,04 10−31−1,92 10−32−1,22 10−316,46 10−322,04 10−316,46 10−321,67 10−32 ) ATwitch = (1,46 10-318,39 10-323,46 10-318,39 10-32-1,06 10-312,26 10-323,46 10-312,26 10-32-3,92 10-32)

Тензоры даны в м ³ M ⁻¹ .

Генерация ансамбля

Сначала мы индивидуально смоделировали все возможные двугранные углы основной цепи (ϕ и ψ; выборка с шагом 60 °) линкерных остатков (от Arg ²²⁹ до Gln ²³¹ для mCerulean3 и Met от ³¹¹ до Gly ^{313 ​​} для cpVenus), что не привело к стерическому конфликту между одним из модифицированных доменов флуоресцентного белка и доменом TnC. Каждую из двух линкерных областей моделировали независимо. Из всех возможных комбинаций ϕ, ψ (117 649) вращение mCerulean3 привело к 477 возможным конформациям, в то время как cpVenus допустил 84 конформации, обеспечивая в целом 40 086 возможных конформаций.

Во-вторых, мы случайным образом объединили возможные структуры для mCerulean-TnC и TnC-cpVenus в ансамбли из шести членов. Мы произвольно отобрали 1 миллион шестичленных ансамблей из 40 068 возможных ϕ, ψ комбинаций линкеров между mCerulean и TnC и между TnC и cpVenus, чтобы гарантировать правильное исследование конформационного пространства Twitch.

В-третьих, мы рассчитали диапазон RDC (используя тензор, полученный, как описано выше) и FRET ансамблей и сравнили их с экспериментальными значениями, определив коэффициент качества ансамбля Qens = ∑i = 1i = 6 (RDCi − RDCeRDCe) 2+ (FRETi-FRETeFRETe) 2, где RDC _i — диапазоны распределения, субиндекс e указывает экспериментальное значение, а i указывает значение из члена ансамбля. Такое значение добротности отличается от 0, если согласования предсказанных откликов RDC и FRET от ансамбля отклоняются от экспериментальных данных, и 0 в случае полного согласия.Наконец, ансамбли были отсортированы по их Q _ens , и был выбран самый низкий из них.

Измерения SAXS

Данные SAXS были собраны на канале BM29 Европейского центра синхротронного излучения (ESRF) в Гренобле, Франция, с использованием автоматического устройства смены образцов ( 32 ). Белок диализовали либо против буфера A [20 мМ Mops (pH 7,0), 100 мМ NaCl и 5 мМ CaCl ₂ ] (связанное с кальцием состояние), либо против буфера B [20 мМ Mops (pH 7,0), 100 мМ NaCl и 10 мМ ЭДТА] (без кальция).Перед измерением белок центрифугировали для удаления более крупных частиц. Образцы измеряли при концентрациях 2,5, 10 и 20 мг / мл. Буфер для диализа использовали для коррекции эталонного буфера. Данные собирали при 293 К с использованием длины волны 0,995 Å и расстояния от образца до детектора 2,867 м. Загружали сто микролитров каждой концентрации образца, собирали и объединяли 10 кадров. Образцы непрерывно подавались в кювету, чтобы свести к минимуму эффекты радиационного повреждения.Изображения детектора были объединены и преобразованы в одномерные кривые рассеяния, а вклады буфера в рассеяние были вычтены с использованием программного обеспечения BsxCuBE. Дальнейшая обработка данных выполнялась автоматически с использованием онлайн-конвейера EDNA ( 33 ) для оценки качества образца и эффектов радиационного повреждения. Агрегации белков или радиационного повреждения не наблюдалось.

Данные были дополнительно проанализированы с помощью программного пакета ATSAS ( 34 ). Вкратце, первичная обработка и анализ данных были выполнены с использованием программ PRIMUS ( 35 ) и GNOM ( 36 ).

Теоретическое рассеяние от кристаллической структуры было рассчитано с использованием программы CRYSOL ( 37 ) (рис. S2), а молекулярные массы рассчитаны с использованием образца бычьего сывороточного альбумина в качестве стандарта.

Благодарности: Мы благодарим персонал компании SLS, X10SA за поддержку при сборе рентгеновских данных и ESRF, BM29 за поддержку при сборе данных SAXS. Мы благодарим M. Paulat, C. Schwiegk и A. Moritz за техническую помощь в производстве белка и K.Оверкамп для масс-спектров электроспрея. С. благодарит T. Gruene и G. Sheldrick за советы по уточнению кристаллической структуры и структурному анализу. К.Г. и П.Т.-М. поблагодарить R. Kuemmerle (Bruker Biospin) за измерения ЯМР на частоте 1,1 ГГц. Финансирование: Эта работа была поддержана Обществом Макса Планка и DFG SFB 870 (O.G.). П.Т.-М. был поддержан докторской стипендией Гумбольдта. Вклад авторов: P.T.-M. выполнен ЯМР. П.Т.-М. и К.Г. разработал парамагнитный метод ЯМР.П.Т.-М. рассчитаны структурные ансамбли. П.Т.-М. и С. выполнены измерения SAXS. К.Г. рассчитал FRET по рентгеновским структурам. T.T. и O.G. определили экспериментальные эффективности FRET. С. кристаллизовал Twitch-2B и Twitch-6 и решил кристаллические структуры. Рукопись написана всеми авторами. С. разработал проект. Конкурирующие интересы: Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов. Доступность данных и материалов: Структуры депонированы с кодом 6GEL для биосенсора Twitch-2B и 6GEZ для мутанта Twitch-2B N532F (Twitch-6).Все данные, необходимые для оценки выводов в статье, представлены в документе и / или дополнительных материалах. Дополнительные данные, относящиеся к этой статье, могут быть запрошены у авторов.

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно.Ниже приведены наиболее частые причины:

• В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки вашего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
• Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
• Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
• Дата на вашем компьютере в прошлом.Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
• Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файле cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта.Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

Контроль связывания дофамина с помощью нового аптамера для биосенсора на основе FRET

Основные моменты

•

Требования к структуре и последовательности для нового аптамера дофамина, охарактеризованного ITC.

•

Измерено буферное и температурно-зависимое связывание дофамина.

•

Разработан складной датчик FRET, и эта информация полезна для разработки других типов биосенсоров, использующих этот аптамер.

Abstract

Дофамин — один из важнейших нейромедиаторов. В 2018 году было сообщено о высококачественном ДНК-аптамере дофамина. Однако фундаментальное понимание его связывания и фолдинга отсутствует, что имеет решающее значение для конструкции соответствующего биосенсора.Здесь мы провели тщательные анализы, используя метод без меток, называемый изотермической титрационной калориметрией (ITC), для изучения его вторичной структуры. Мы разделили этот аптамер на четыре области и индивидуально исследовали каждую из них. Мы подтвердили наличие двух стержней, но считается, что третий стержень является частью петли. Затем аптамер был усечен. Исходный аптамер имел K _d 2,2 ± 0,3 мкМ при 25 ° C. Укорочение структуры на одну или две пары оснований увеличило K _d до 6.9 и 44,4 мкМ соответственно. Связывание дофамина стимулировалось как увеличением концентрации Mg ²⁺ , так и снижением температуры. При 5 ° C достигается K _d 0,4 ​​мкМ. Основываясь на этом понимании, мы разработали два биосенсора тушения с резонансным переносом энергии флуоресценции (FRET), которые отличаются только парой оснований. Более короткий сенсор имел в 3 раза большую чувствительность и предел обнаружения 0,9 мкМ. В 1% фетальной бычьей сыворотке датчик сохранил аналогичный предел обнаружения 1.14 мкМ. Также был продемонстрирован ратиометрический датчик FRET с двумя флуорофорами с низким пределом обнаружения 0,12 мкМ. Эта работа показала возможность разработки складных сенсоров для дофамина, и эта конструкция может быть распространена на другие методы измерения, такие как электрохимия и колориметрия.

Ключевые слова

Аптамеры

Мутация

Изотермическая калориметрия титрования

Дофамин

Флуоресцентный резонансный перенос энергии

Рекомендуемые статьи Цитирующие статьи (0)

© 2020 Elsevier B. V. Все права защищены.

Рекомендуемые статьи

Ссылки на статьи

Молекулярные детерминанты контактов ЭР – Гольджи, идентифицированные с помощью новой системы FRET – FLIM | Журнал клеточной биологии

Затем мы исследовали молекулярные механизмы, лежащие в основе потребности идентифицированных хитов в поддержании ERTGoCS и, в частности, зависело ли это от их активности переноса липидов. ORP10 ассоциируется с микротрубочками, но также и с комплексом Гольджи (рис.5 А; Nissilä et al., 2012), и хотя он не обладает каноническим доменом FFAT, он может взаимодействовать с VAP (Weber-Boyvat et al., 2015; Murphy and Levine, 2016). ORP10 принадлежит к подсемейству ORP, в которое входят члены, которые могут переносить PS (Maeda et al., 2013), такие как ORP5 и ORP8, которые передают PS в обмен на PI4P между ER и PM (Chung et al., 2015), в то время как Было показано, что сам ORP10 связывает и извлекает PS (Maeda et al., 2013). Мы наблюдали, что остатки оксистерин-родственного домена (ORD) ORP5 / ORP8, которые участвуют в обмене PS / PI4P (Chung et al., 2015) очень хорошо законсервированы в ORP10 (Fig. 5 B). Чтобы выяснить, обусловлена ​​ли потребность в ORP10 в поддержании ERTGoCS структурной ролью или его активностью переноса липидов, устойчивый к siRNA ORP10 реэкспрессировался в клетках с истощенным ORP10 как в его WT-форме, так и в формах, где сайты ORD участвуют в Связывание PS (L418D) и PI4P (H535 / 536A) было мутированным (фиг. 5B). Мы обнаружили, что WT, но не мутантные формы ORP10, которые были правильно нацелены на комплекс Гольджи (рис.5 C), может восстанавливать ERTGoCS в истощенных по ORP10 клетках (фиг. 5 D и фиг. S3, A и B), указывая на то, что активность ORP10 по переносу липидов необходима для стабильности этих MCS. PS синтезируется в ER, но обогащается PM, TGN и эндосомами (Leventis and Grinstein, 2010; Fairn et al., 2011), где он асимметрично распределяется между двухслойными листочками, ограничиваясь цитозольным листком. Таким образом, мы проверили возможность того, что ORP10 может участвовать в переносе PS из ER в цитозольный листок мембран TGN, изучая влияние истощения ORP10 на субклеточное распределение PS с использованием двух различных генетически кодируемых зондов: PS-связывающего домена лактадгерина. (Домен C2; Yeung et al., 2008; Рис. 5 E) и эвектина (домен PH; Uchida et al., 2011; рис. S3 C). Мы обнаружили, что истощение ORP10 индуцировало снижение PS в Гольджи, что было оценено по распределению двух зондов PS (Рис. 5 E и Рис. S3 C), которое показало заметное сокращение пула Гольджи (но не PM пул) в клетках ORP10-KD и наблюдением, что меньшее количество мембран TGN из клеток ORP10-KD сохраняется на PS-аффинных гранулах по сравнению с контрольными клетками (фиг. S3 D).

Таким образом, ORP10 необходим для защиты содержания PS в TGN и, в то же время, в ERTGoCS (рис.4, А – Е; Рис. 5 E; и фиг. S3, C и D), что указывает на то, что липидный состав TGN и, в частности, его содержание PS, имеет решающее значение для создания / поддержания этих структур. Подтверждая эту гипотезу, добавление экзогенного PS частично восстанавливает ERTGoCS в ORP10-истощенных клетках (Fig. 5 F). Аналогичные результаты были получены, когда продукция PS была увеличена за счет сверхэкспрессии мутантной (P269S) формы PS-синтазы 1, которая нечувствительна к ингибированию продукта (Sousa et al., 2014; Sohn et al., 2016; Рис. 5 G и Рис. S3 E).

Мы рассмотрели тот же вопрос (т.е. структурная роль в сравнении с зависимой от активности переноса липидов ролью в поддержании ERTGoCS) для OSBP1, который, как было обнаружено, является обязательным партнером ORP9 в поддержании ERTGoCS. С этой целью мы изучили влияние итраконазола, ингибитора активности обмена липидов OSBP1 (Strating et al., 2015), на стабильность ERTGoCS и обнаружили, что он не оказывает ингибирующего действия ни на контрольные клетки, ни на ORP9-KD. ячеек (рис.5 H).

Тернер и его коллеги используют двумерную электронную спектроскопию для изучения сигналов FRET

В статье «Двумерная электронная спектроскопия выявляет спектральную динамику переноса энергии резонанса Фёрстера», опубликованной в CHEM (том 5, выпуск 8, август 2019 г. ), Дэниел Тернер и его коллеги разрабатывают модель подписей FRET в 2D ES, которая помочь отличить их от других сигналов. Первым автором является аспирант химии Нью-Йоркского университета Брайан Петков, к нему присоединились другие докторанты Нью-Йоркского университета Тобиас Геллен, Камилла Фарфан, Уильям Карбери и Белинда Хетцлер.В список авторов включены профессор химии Дженис Калтер из Нью-Йоркского университета Дирк Траунер и доцент Нью-Йоркского университета в Шанхае Уильям Гловер и аспирант Синпин Ли, а также Дарин Улнесс из Университета Миннесоты.

Реферат: Двумерная электронная спектроскопия (2D ES) исследует энергии хромофоров и их взаимодействие, поэтому этот метод в настоящее время широко используется для изучения механизмов передачи энергии возбуждения. Повсеместное распространение и важность резонансной передачи энергии Фёрстера (FRET) требуют тщательного изучения его характеристик в 2D ES.Здесь, используя принципы спектроскопии зашумленного света для учета события спонтанного переноса, мы описываем модель сигналов, которые возникают из FRET в 2D ES. Эта модель дает три теоретических результата относительно пика передачи энергии, которые согласуются с нашими лабораторными измерениями. Второе неожиданное открытие заключается в том, что процессы сольватации, которые вызывают динамический стоксов сдвиг акцепторного сигнала, также вызывают относительно более медленное красное смещение сигнала передачи энергии, обнаруживая фундаментальное различие в релаксации сольватации между фотовозбужденными и возбужденными FRET молекулами акцептора.Подписи, полученные из модели, служат эталоном для текущей работы над механизмами передачи энергии.

Здесь Тернер и его коллеги разрабатывают модель FRET в 2D ES, основанную на шумном свете, чтобы учесть вибрации, которые ее активируют. Что особенно важно, они обнаруживают несколько неуказанных особенностей, которые отличают FRET от других сигналов. Эти сигнатуры являются фундаментальными и сразу же применимы к текущей работе над фотосинтетическими комплексами, солнечными наноматериалами и другими ключевыми моментами в области возобновляемых источников энергии. Будущая междисциплинарная работа, начиная от исследований передачи энергии в организмах и заканчивая медицински применимыми методологиями биовизуализации, будет использовать преимущества этих спектральных и временных сигнатур.

Это исследование было поддержано Национальным научным фондом и Фондом Альфреда П. Слоана.

Кевин Фрет, открытый гей-исполнитель латинских ловушек, застрелен и убит в Пуэрто-Рико

Кевин Фрет, звезда социальных сетей из Пуэрто-Рико, объявивший себя первым открыто гомосексуальным латинским исполнителем ловушек, был смертельно ранен в Сан-Хуане рано утром в четверг. в полицию и местные новостные репортажи.

Г-н Фрет, 25 лет, ехал на мотоцикле в районе Сантурсе около 5:30 утра, когда он получил два выстрела: в голову и бедро, сообщила полиция. Его доставили в ближайшую больницу, где констатировали мертвым.

Полиция еще не сообщила имя человека, в которого стреляли, ожидая опознания тела, но менеджер г-на Фрета, Эдуардо Родригес, подтвердил его смерть в заявлении для Billboard.

Его смерть наступила на фоне всеобщей обеспокоенности по поводу преступности в Пуэрто-Рико; в среду топ F.Б.И. тамошний чиновник заявил, что остров столкнулся с «кризисом насилия».

В статье, опубликованной в апреле, журнал Paper Magazine назвал мистера Фрета «первым открыто гомосексуальным пионером латинской ловушки». В том же месяце он выпустил сингл под названием «Soy Así» или «I’m Like This».

Видео «Soy Así», которое было просмотрено более 500 000 раз на YouTube, начинается с того, что мистер Фрет одет в блестящий укороченный топ и обтягивающие брюки в тон, с винтовкой (предположительно поддельной) в руке. Окруженный женщинами в откровенных нарядах, он хвастается своей внешностью, макияжем и дизайнерской одеждой и называет себя «реинкарнацией Фриды Кало».

«Я человек, которому все равно, что говорят», — сказал он журналу.

«Молодые геи или молодые лесбиянки, которые смотрят на меня сейчас как на образец для подражания, типа вау, если он это сделал, и ему все равно, что скажут другие, я могу это сделать».

Латинский трэп возник на Карибах в середине 2000-х, смешивая южный хип-хоп с местными звуками. Плохой Банни, Мессия и Озуна — все они работали с Карди Би — являются одними из самых известных ее практикующих.

В заявлении для Billboard г-н.Менеджер Fret, г-н Родригес, сказал, что его клиент был «артистической душой и большим мечтателем».

«Его страстью была музыка, — добавил он, — и ему еще многое нужно было сделать».

В июле г-н Фрет появился в видео художника Майка Дюрана на песню «Diferente». Были знакомые образы — деньги, бикини, — но внешность мистера Фрета, одетого в сетчатую футболку с радугой в джакузи, а затем в белоснежной рубашке с блестящей короной и невероятно длинными ресницами, на самом деле была очень красивой. разные.

Сами Немир Оливарес, пуэрториканский писатель и активист, живущий в Нью-Йорке, сказал, что г-н Фрет олицетворяет надежду для таких людей, как он сам, которые столкнулись с издевательствами и домогательствами из-за своей сексуальной ориентации.

«Кевин Фрет представил свежий взгляд на музыкальный жанр, который очень гомофобен и очень мачистичен», — сказал он.

Г-н Фрет использовал хвастовство и перформативность жанра, чтобы обосновать инклюзивность, утверждал г-н Немир Оливарес.

«В Пуэрто-Рико это акт сопротивления», — добавил он.

Но не всегда все шло гладко. Г-н Фрет решительно отреагировал после того, как стал объектом гомофобных угроз в лирике конкурирующего артиста, что заставило некоторых усомниться в том, было ли его убийство мотивировано ненавистью.

Полиция искала другого мужчину на мотоцикле, который был с г-ном Фретом, когда его нашли, но быстро скрылся. Пока нет никаких указаний на мотив.

Г-н Фрет также жил в Майами в последние месяцы. В июне он был заряжен батареей после драки в районе Брикелл.Г-н Фрет сказал, что на него напали из-за своей сексуальности.

У него было много подписчиков в Instagram, но в четверг сообщений не было видно, что указывает на то, что он, возможно, удалил предыдущие сообщения.