2019 лада: продажи за 9 месяцев 2019 года выросли на 2,4%


0
Categories : Разное

Содержание

LADA запускает виртуальный гоночный Чемпионат »LADA e-Championship 2019»

LADA запускает виртуальный гоночный Чемпионат »LADA e-Championship 2019»
Параллельно с открытием нового сезона Российской серии кольцевых гонок (РСКГ) запускается виртуальный гоночный чемпионат «LADA e-Championship 2019» в самом престижном и мощном классе машин «Туринг». 

Это событие – первый шаг сотрудничества между LADA и организатором киберспортивных соревнований RaceRoom. Участники чемпионата будут соревноваться на виртуальных моделях LADA Vesta TCR, которые полностью соответствуют реальным автомобилям. 

LADA Vesta TCR обладает мощностью 340 л.с. и крутящим моментом 410 Нм. Перед сезоном 2019 данный автомобиль был существенно обновлен. Он получил модернизированный двигатель и заднюю подвеску, также изменилась аэродинамика передней части автомобиля.

Квалификационный отбор 1 этапа стартует 27 апреля. Календарь LADA e-Championship синхронизирован с расписанием РСКГ, поэтому отбор будет проходить в течение нескольких месяцев.

Подробности смотрите на специальном сайте Чемпионата LADA e-Championship 2019.

Отправляя сообщение, я соглашаюсь с политикой обработки персональных данных, выражаю свое согласие и разрешаю АО «АВТОВАЗ», а также, по их поручению, третьим лицам осуществлять обработку моих персональных данных (фамилия, имя, отчество, год, месяц, дата и место рождения; адрес, номер паспорта и сведения о дате выдачи паспорта и выдавшем его органе; образование, профессия, место работы и должность; домашний, рабочий и мобильный телефоны; адрес электронной почты и другие данные, требуемые для отправки сообщения), включая сбор, систематизацию, накопление, хранение, уточнение, использование, распространение (в том числе трансграничную передачу), обезличивание, уничтожение персональных данных), в целях связанных с возможностью предоставления информации о товарах и услугах, которые потенциально могут представлять интерес, а также в целях сбора и обработки статистической информации и проведения маркетинговых исследований.

Согласие на обработку персональных данных в соответствии с указанными выше условиями я предоставляю на 10 (десять) лет. Я уведомлен и согласен с тем, что указанное согласие может быть мной отозвано посредством направления письменного заявления заказным почтовым отправлением с описью вложения, либо вручено лично под подпись.

Отправляя сообщение, я соглашаюсь с политикой обработки персональных данных, выражаю свое согласие и разрешаю АО «АВТОВАЗ», а также, по их поручению, третьим лицам осуществлять обработку моих персональных данных (фамилия, имя, отчество, год, месяц, дата и место рождения; адрес, номер паспорта и сведения о дате выдачи паспорта и выдавшем его органе; образование, профессия, место работы и должность; домашний, рабочий и мобильный телефоны; адрес электронной почты и другие данные, требуемые для отправки сообщения), включая сбор, систематизацию, накопление, хранение, уточнение, использование, распространение (в том числе трансграничную передачу), обезличивание, уничтожение персональных данных), в целях связанных с возможностью предоставления информации о товарах и услугах, которые потенциально могут представлять интерес, а также в целях сбора и обработки статистической информации и проведения маркетинговых исследований.

Согласие на обработку персональных данных в соответствии с указанными выше условиями я предоставляю на 10 (десять) лет. Я уведомлен и согласен с тем, что указанное согласие может быть мной отозвано посредством направления письменного заявления заказным почтовым отправлением с описью вложения, либо вручено лично под подпись.

Отправляя сообщение, я соглашаюсь с политикой обработки персональных данных, выражаю свое согласие и разрешаю АО «АВТОВАЗ», а также, по их поручению, третьим лицам осуществлять обработку моих персональных данных (фамилия, имя, отчество, год, месяц, дата и место рождения; адрес, номер паспорта и сведения о дате выдачи паспорта и выдавшем его органе; образование, профессия, место работы и должность; домашний, рабочий и мобильный телефоны; адрес электронной почты и другие данные, требуемые для отправки сообщения), включая сбор, систематизацию, накопление, хранение, уточнение, использование, распространение (в том числе трансграничную передачу), обезличивание, уничтожение персональных данных), в целях связанных с возможностью предоставления информации о товарах и услугах, которые потенциально могут представлять интерес, а также в целях сбора и обработки статистической информации и проведения маркетинговых исследований.

Согласие на обработку персональных данных в соответствии с указанными выше условиями я предоставляю на 10 (десять) лет. Я уведомлен и согласен с тем, что указанное согласие может быть мной отозвано посредством направления письменного заявления заказным почтовым отправлением с описью вложения, либо вручено лично под подпись.

Гродненский государственный университет имени Янки Купалы

Опубликовано в газете «Гродзенскі ўніверсітэт» в № 4 от 19 мая 2017 года

 

 

Лада Рудикова: «В студентов нужно вкладывать душу»

Математика и поэзия, физика и музыка, танцы и путешествия – это увлечения одного человека. Недавно разносторонняя и творческая женщина, заведующий кафедрой современных технологий программирования факультета математики и информатики Лада Владимировна Рудикова отметила юбилей и издание очередной книги.

В детстве девочка с необычным славянским именем Лада увлекалась всем и сразу: много читала, ходила в музыкальную школу, посещала занятия математической школы при университете, репарировала крыс в институте биохимии. Мечтала стать врачом или артисткой оперетты.

– К последнему папа отнесся очень скептически, – рассказывает Лада Владимировна за столом в уютном кабинете кафедры современных технологий программирования. – Настаивал, чтобы я поступала на математический факультет. Несмотря на диплом математической школы и направление на математический факультет, медалистка Лада выбрала физику: поступила на специальность «Физика. Преподаватель физики», но вскоре перевелась на специальность «Физика. Инженерфизик». Окончив университет с красным дипломом, Лада Владимировна устроилась инженером-конструктором в Гродненское производственное объединение «Волна».

– Творческому человеку, а я себя таковым считаю, всегда тесно в рамках какой-то системы, – делится собеседница. – На заводе я выполняла интересную работу, получала достойную зарплату, но чувствовала, что это не мое. Однажды в газете увидела объявление о наборе в аспирантуру и решила действовать.

На родном физико-техническом факультете мест не оказалось, и заведующий кафедрой дифференциальных уравнений Степан Андреевич Минюк предложил Ладе Владимировне поступить в дневную аспирантуру по специальности «Дифференциальные уравнения».

– В жизни случай часто играет большую роль, – рассказывает собеседница. – Ближе к окончанию аспирантуры встал вопрос о трудоустройстве, а на кафедре информатики и вычислительной техники как раз была вакансия, требующая от соискателя физического образования, чтобы читать курсы по микроэлектронике и микропроцессорам. С тех пор моя работа связана с этой кафедрой.

Лада Владимировна стала лаборантом, а затем и ассистентом кафедры информатики и вычислительной техники. В 1999 году защитила кандидатскую диссертацию и, минуя должности преподавателя и старшего преподавателя, стала доцентом.

– Признаюсь, до какого-то момента я не представляла себя педагогом, – делится Лада Владимировна. – Но работа в университете мне очень нравится: с одной стороны, у меня есть возможность обучать, общаться со студентами. С другой стороны, могу работать над своими научными идеями. Университет расширяет границы, давая возможности формировать свой график, знакомиться и общаться с людьми по академической линии, участвовать в конференциях.

За годы своего существования кафедра информатики и вычислительной техники не раз реорганизовывалась, преобразовывалась, менялось ее название. С 2013 года Лада Владимировна заведует кафедрой современных технологий программирования и продолжает ее развивать.

– Мы ведем подготовку иностранных студентов и магистрантов, читаем курсы на английском языке, – рассказывает собеседница. – Наша специальность очень востребована, и уровень знаний наших студентов должен соответствовать. Практически все выпускники находят работу. Это отличный показатель. Увлекаются наши студенты и наукой: каждый год участвуют в республиканском конкурсе «100 идей для Беларуси», занимают призовые места на Республиканском конкурсе научных работ студентов.

Секрет успешной работы коллектива кафедры – в особой дружеской атмосфере, заметной даже случайному гостю.

– Приятно осознавать, что у нас на кафедре между коллегами сложились теплые отношения, – рассказывает Лада Владимировна. – Все спорные вопросы мы всегда обсуждаем вместе. Силовые меры руководства не выход, мы склоняемся к демократическому, консенсусному решению проблем.

Собеседница отмечает, что она как творческий человек старается поддерживать любые идеи и начинания своих коллег.

– Какие бы руководитель не использовал методы, какую бы не избрал стратегию, главное в работе – осязаемые результаты, по которым можно судить о людях, о кафедре в целом и о том, что мы вносим в науку, в жизнь, в отношения между людьми.

Во время нашей беседы на кафедру то и дело заглядывали студенты. У каждого свой вопрос или просьба, и для всех двери кабинета открыты.

– Не без гордости отмечу, что за несколько лет мы укрепили вектор работы со студентами, – отмечает Лада Владимировна. – Я как преподаватель всегда пытаюсь войти в положение студента, быть участливой, понимающей. На кафедру можно прийти в любое время, мы всегда постараемся решить проблемы, связанные не только с учебой, но и жизненные, личные. Общение со студентами дарит хорошее настроение, желание работать. Их просто нужно увлекать, вкладывать в них душу.

Увлечь студентов заведующий кафедрой современных технологий программирования старается и с помощью интересных мероприятий. Недавно совместно с Парком высоких технологий провели серию митапов по астрономии на тему «Информационные технологии в исследованиях космоса» в рамках студенческого научного семинара «Информатика сегодня». Участниками могли стать не только студенты, но и все желающие.

– Инициировал встречи наш выпускник, астроном-любитель Иван Адамин, – рассказывает Лада Владимировна. – Большую помощь в организации оказал старший преподаватель нашей кафедры Евгений Жавнерко. Пришедшие узнали об истории развития астрономии и о вкладе, который вносят в эту науку информационные технологии, из первых рук – от человека, пишущего программное обеспечение по базам данных НАСА. Это отличный способ привлечь молодых людей в науку и вдохновить их изучать современные технологии.

Кафедра планирует и дальше работать с Парком высоких технологий.

Уже есть идея запустить конкурс «Запрограммируй дудлы для белорусского сегмента Интернета». Совсем скоро на базе ПВТ состоится презентация восьмой книги Лады Владимировны, изданной в сотрудничестве с издательством «БХВ-Петербург», – «Microsoft Offi ce Excel 2016».

– Сотрудничаю с «БХВ» уже 10 лет, – говорит собеседница. – Начала писать книги в очередном творческом порыве. Стараюсь писать в практико-ориентированном ключе, привожу много примеров, чтобы читатель мог сам на практике освоить программу.

Лада Владимировна признается, что писать художественную литературу пока не пробовала, зато увлекается поэзией: в столе давно лежит сверстанный сборник стихов. Начала писать в начале 2000-х годов, когда получала второе высшее образование и изучала немецкий язык.

– Нам дали задание перевести на русский язык стихотворение «Пантера» Райнера Рильке. Можно было сделать так называемый «подстрочник», но я попыталась оформить текст более художественно. Получилось отлично. Потом переводила и другие стихи Рильке, преподаватель очень хвалил. С тех пор и увлеклась поэзией. Сейчас пишу реже, но бывают моменты вдохновения, когда стихи рождаются на одном дыхании.

Увлечение художественным словом – прозаическим и поэтическим – появилось еще в детстве. И сейчас Лада Владимировна продолжает много читать:

– Из современного люблю произведения Харуки Мураками, серию «Хохот шамана» Владимира Серкина и книгу «Цена познания» Юрия Алкина, к слову, программиста компании Microsoft и выходца из Минска.

Также в детстве собеседница увлеклась музыкой. Окончила музыкальную школу по классу фортепиано, игра на инструменте приносит удовольствие до сих пор. Любовь к мелодии и ритму вдохновила Ладу Владимировну заняться современными танцами. Еще одно увлечение собеседницы – путешествия.

– Люблю активный отдых: ходить, смотреть, общаться с местным населением, а не просто лежать на пляже, – рассказывает Лада Владимировна. – Недавно открыла для себя прекрасную страну Мальту. Невероятно красивая природа, доброжелательные и открытые люди, смешение европейской и восточной культур. Но все равно всегда и отовсюду хочется вернуться домой.

Собеседница признается, что ее жизненная опора и фундамент для продуктивной работы и творчества – ее крепкая семья, надежные друзья, любимые коллеги и студенты. Этой удивительной женщине удается всегда оставаться в гармонии с собой и окружающим миром.

– Ощущение счастья должно быть внутри человека и не зависеть от внешних факторов, – убеждена Лада Владимировна. – Даже после неприятностей нужно не замыкаться в себе, а, наоборот, открываться миру и делиться

В Костанае стартовало производство автомобилей LADA

Совместное производство автомобилей Lаda стартовало на заводе «СарыаркаАвтоПром» в казахстанском городе Костанае. Об этом сообщила в пятницу пресс-служба правительства Казахстана по итогам рабочей поездки заместителя премьер-министра республики Романа Скляра в Костанайскую область.

«Сегодня на заводе „СарыаркаАвтоПром“ состоялся старт совместного производства автомобилей Lаda. На промышленной площадке завода будет осуществляться выпуск всего модельного ряда автомобилей Lаda: Niva Travel, Niva 4х4, Vesta, X-RAY, Largus и Granta. Производство автомобилей Lаda Granta включает в себя мелкоузловой метод с применением операций по покраске авто», — говорится в сообщении.

В настоящее время на предприятии продолжаются работы по освоению высокотехнологичных производственных операций по сварке кузовов модели Lаda Granta для дальнейшего увеличения локализации Lаda на казахстанском заводе. Для производства организованы новые рабочие места, сотрудники прошли необходимое обучение.

Кроме того, Роман Скляр вместе с генеральным директором ПАО «Камаз» Сергеем Когогиным проинспектировали в Костанае ход строительства завода KamLitKZ по производству чугунного литья компонентов для грузовой техники нового модельного ряда КАМАЗов поколения К5. «В присутствии заместителя премьер-министра Казахстана состоялось подписание нового инвестиционного контракта по проекту строительства завода „Камаз“ по производству главных передач ведущих мостов, а также соглашения о промышленной сборке данных компонентов между Министерством иностранных дел, Министерством индустрии и инфраструктурного развития Казахстана и KamLitKZ», — отмечается в сообщении.

Заключение данных соглашений стало еще одним шагом в рамках реализации крупных инвестиционных проектов компании «Камаз» по созданию современных высокотехнологичных производств автомобильных компонентов на территории Казахстана. «Продукция казахстанского производства будет поставляться на конвейер главного завода „Камаз“ в Набережных Челнах. Инвестиции в новый проект составят порядка 82 млрд тенге (более 192 млн долларов — прим. ТАСС). На заводе и в смежных отраслях промышленности Казахстана будет создано более 600 новых рабочих мест», — уточнили в пресс-службе.

Расширенная нормализация FRET позволяет проводить количественный анализ белковых взаимодействий, включая стехиометрию и относительную аффинность в живых клетках.

Используемые плазмиды

Все плазмиды, которые мы использовали, доступны из коллекции лаборатории Шмида. Банк данных, содержащий их, доступен в Интернете по адресу http://www.meduniwien.ac.at/user/johannes.schmid/. Используемые плазмиды и карты перечислены на дополнительном рисунке 11.

Подготовка образцов клеток

Все эксперименты проводились на клетках HeLa, клон ACC 57.Клетки пассировали за день до трансфекции, достигая слияния 70-80% в день трансфекции. Для экспериментов под микроскопом клетки высевали на 8-луночные предметные стекла там же с стеклянным дном. Для проточной цитометрии клетки высевали в 24-луночные многолуночные планшеты. Для достижения охвата в широком диапазоне соотношений акцептора к донору плазмиды, несущие донор или акцептор, трансфицировали в пяти различных массовых соотношениях: 5: 1, 3: 1, 1: 1, 1: 3 и 1: 5. Трансфекция была достигнута с помощью реагента для трансфекции TurboFect ™ (Thermo Scientific ™, номер по каталогу: R0531) в соответствии со спецификациями продукта.

Получение и оценка микроскопических изображений

Микроскопия проводилась на конфокальной системе лазерного сканирования Nikon A1 R +, оснащенной 12-битными детекторами, с использованием апохроматического масляного иммерсионного объектива 60x (NA1. 4). Донорный канал был получен при возбуждении на 488 нм и эмиссионном фильтре 525/50. Канал FRET был получен при возбуждении на 488 нм и эмиссионном фильтре 595/50. Акцепторный канал был получен при возбуждении на 561 нм и эмиссионном фильтре 595/50.

Измерения фотообесцвечивания акцептора проводились на Nikon A1 с использованием иммерсионного объектива с плоским апохроматическим маслом и иммерсией 60x (NA1.4). Фотодеструкция применялась на длине волны 561 нм при 100% мощности лазера в течение одной секунды (лазер: Melles Griot 85-YCA-020, выходная мощность 20 мВт при 561 нм ± 0,5 нм).

Оценка изображений проводилась с использованием программного пакета Fiji из ImageJ (https://fiji.sc/) и набора самописных макросов FRET, которые находятся в свободном доступе под GPLv3 (General Public License версии 3). ) на GitHub под (https://github.com/BHochreiter). Предоставляется описание и протокол использования этих макросов для оценки (дополнительный рис. 7).

Получение и оценка проточной цитометрии

Измерения FRET на основе проточной цитометрии были выполнены на приборе CYTOFLEX S (Beckman Coulter, серийный номер AW19039, используя следующие настройки каналов. Донорный канал: лазерное возбуждение 488 нм, 525/40 Эмиссионный фильтр БП (505–545 нм), канал FRET: лазерное возбуждение 488 нм, эмиссионный фильтр 610/20 БП (600-620 нм), канал акцептора: лазерное возбуждение 561 нм, эмиссионный фильтр 610/20 БП (600-620 нм)

Программа CytExpert (https: // www.beckman.com/coulter-flow-cytometers/software) использовался для сбора данных и стробирования анализируемых популяций. Программное обеспечение FlowPy (http://flowpy.wikidot.com/) использовалось для извлечения данных из файлового формата FCS в текстовый формат с разделителями табуляцией.

Оценка отбеливания акцептора

В качестве альтернативного метода для определения эффективности FRET мы использовали метод фотообесцвечивания акцептора, который использует прямое сравнение интенсивности излучения донора до и после фотодеструкции акцепторного флуорофора, после чего большинство измерений и инструментов вызванные искажения не имеют значения, и поэтому результат является прямым коррелятом физического процесса. Однако многие флуорофоры демонстрируют определенные спектральные аномалии при освещении сильным источником света, которые необходимо учитывать перед анализом FRET. Донорские флуорофоры иногда могут быть совместно обесцвечены или, наоборот, фотоактивированы освещением с определенной длиной волны акцептора, что приводит к изменению сигнала флуоресценции без присутствия FRET. Другое явление — фотопереключение акцептора после обесцвечивания, когда акцептор не теряет свою эмиссию, а переходит на другой профиль эмиссии, который часто можно обнаружить в донорном канале 12,13 .

Поправочные коэффициенты df (совместное обесцвечивание и фотоактивация донора) и af (фотопереключение акцептора) используются для учета этих эффектов и определяются для образцов, содержащих только донор или акцептор.

$$ df = \ frac {{D} _ {dpost} — {D} _ {dpre}} {{D} _ {dpre}} $$

(2)

$$ af = \ frac {{D} _ {apost} — {D} _ {apre}} {{A} _ {apre} — {A} _ {apost}} $$

(3)

где «пост» означает интенсивность после отбеливания с акцепторно-специфическим возбуждением, а «до» — значение до. {c}} $$

(5)

Расчет коэффициентов нормализации C1 и C2

Сигналы донора, FRET и акцептора требуют нормализации, чтобы преобразовать их в одно и то же измерение и сделать возможным расчет относительных концентраций и соотношений доноров и акцепторов. C1 и C2 нормализуют донор или акцептор соответственно к сигналу в канале FRET. Они требуют информации от конструкции с известной эффективностью переноса и стехиометрией. Каждый измеренный эксперимент включал популяцию, трансфицированную тандемной слитой конструкцией mCherry-YFP, которая удовлетворяет этим требованиям.{c} \ ast C2} $$

(8)

Расчет различных измерений FRET по полученным сигналам

Из-за спектральных свойств флуорофоров сигналы донора, акцептора и канала FRET должны корректироваться на спектральные перекрестные помехи (или просачивание) от другого флуорофора. Во-первых, четыре спектральных коэффициента прохождения определяются с использованием образцов, содержащих только донорный или акцепторный флуорофор. В литературе можно найти разные номенклатуры для этих факторов — в данной работе используются S1 – S4 31 .S1 и S3 описывают спектральный поток флуоресценции донора в FRET и акцепторный канал соответственно, тогда как S2 и S4 описывают спектральный поток флуоресценции акцептора в FRET и донорный канал соответственно. (Список математических параметров в уравнениях приведен в таблице 1)

$$ {\ rm {donor}} \, {\ rm {into}} \, {\ rm {FRET}} \, {\ rm { channel}}: {S} _ {1} = \ frac {{F} _ {d}} {{D} _ {d}} $$

(9)

$$ {\ rm {acceptor}} \, {\ rm {into}} \, {\ rm {FRET}} \, {\ rm {channel}}: {S} _ {2} = \ frac { {F} _ {a}} {{A} _ {a}} $$

(10)

$$ {\ rm {donor}} \, {\ rm {into}} \, {\ rm {acceptor}} \, {\ rm {channel}}: {S} _ {3} = \ frac { {A} _ {d}} {{D} _ {d}} $$

(11)

$$ {\ rm {acceptor}} \, {\ rm {into}} \, {\ rm {donor}} \, {\ rm {channel}}: {S} _ {4} = \ frac { {D} _ {a}} {{A} _ {a}} $$

(12)

Таблица 1 Список переменных. {c} = \ frac {{A} _ {da} — {S} _ {3} \ ast {D} _ {da}} {1- {S} _ {3} \ ast {S} _ {4 }} $$

(14)

Если донор не подает сигнал в акцепторном канале и наоборот, что означает, что S3 и S4 равны 0, то этот шаг можно пропустить, и сигналы можно использовать сразу после коррекции фона.

Скорректированные донорные и акцепторные сигналы могут использоваться для отделения фактического сигнала FRET от спектрального просачивания в канале FRET, согласно Youvan et al .{c}} $$

(18)

Моделирование экспериментов FRET

Для моделирования экспериментов FRET мы создали математическую модель, основанную на обобщенной форме закона действия масс, которая описывает состояние всех химических взаимодействий в состоянии равновесия.

$$ A + B \ rightleftharpoons \ text {AB}, \, {K} _ {a} = \ frac {[AB]} {[A] \ ast [B]} $$

(19)

Состояние равновесия, или, точнее, концентрации свободных и связанных фракций молекул, зависит от концентраций реагентов, а также их сродства, описываемого константой сродства K a (или ее обратной величиной, константа диссоциации K d ). K a — постоянное значение для реакции при указанной температуре и давлении. Для расчета FRET мы можем использовать наши донор и акцептор как A и B соответственно.

$$ {K} _ {a} = \ frac {[complex]} {{[don]} _ {free} \ ast {[acc]} _ {free}} $$

(20)

$$ [сложный] = [don] — {[don]} _ {free} = [acc] — {[acc]} _ {free} $$

(21)

Когда эти формулы объединены и решены для [комплекса], количество связанных и свободных частиц может быть определено при заданной общей концентрации донора, акцептора и значения K a .{2}} + [don] {K} _ {a} + \ frac {[acc]} {z} {K} _ {a} +1} {2 {K} _ {a}} $$

(24)

Важно отметить, что этот способ введения фактора стехиометрии подразумевает, что многочисленные молекулы донора или акцептора, которые появляются в комплексе, уже связаны друг с другом до взаимодействия между молекулами донора и акцептора. {c} \) и F ​​ c можно рассчитать, применив фиксированное значение максимальной эффективности FRET FRET max , которое представляет эффективность FRET, если все донорные и акцепторные молекулы были задействованы в донорно-акцепторном комплексе, а также спектральные коэффициенты просачивания S1, S2, S3 и S4.

$$ {D} _ {da} = {[don]} _ {free} + [complex] \ ast (1-FRE {T} _ {max}) + ({[acc]} _ {free} + [сложный]) \ ast {S} _ {4} $$

(26)

$$ {A} _ {da} = {[acc]} _ {free} + [complex] + (\, {[don]} _ {free} + [complex] \ ast (1-FRE {T } _ {max})) \ ast {S} _ {3} $$

(27)

$$ {F} _ {da} = [комплекс] \ ast FRE {T} _ {max} + S1 \ ast {D} _ {da} + S2 \ ast {A} _ {da} $$

(28)

Для вычислительного моделирования модель можно упростить, установив для S1, S2, S3 и S4 значение 0, что не влияет на математическое моделирование.

Из полученных значений были рассчитаны показатели FRET в соответствии с уравнениями с 16 по 18.

Подгонка результатов FRET

Для получения трех количественных переменных K a app , z и FRET max , мы модифицировали результаты наших измерений в имитационную модель. Чтобы напрямую использовать интенсивности донорного и акцепторного каналов, а также результирующий DFRET для подгонки, мы немного изменили формулу, чтобы получить меру FRET вместо концентрации комплекса.{app}} \ ast \ frac {FRE {T} _ {max}} {don} $$

(31)

Подгонка была проведена с помощью нелинейной модели наименьших квадратов, минимизирующей отклонение теоретических и реальных значений за несколько итераций. Подгонка модели может быть непосредственно применена к измеренным значениям, но должна быть ограничена значимой областью около стехиометрии комплекса. Для простого взаимодействия 1: 1 мы применяем модель ко всем значениям с отношением акцептора к донору от 0,2 до 2.

Статистическая информация

Статистические значения для подгонки модели были определены с помощью нелинейного алгоритма подгонки наименьших квадратов программного обеспечения R. Статистическая информация (где применимо) и n чисел приведены на соответствующих рисунках или в подписях к рисункам.

Реализованное программное обеспечение и код

Все описанные расчеты и оценки могут быть выполнены в свободно доступных ( R, ImageJ, CytExpert, FlowPy ) или общих (Microsoft Excel) программных пакетах.

Расчеты FRET, оценка FRET и моделирование были выполнены в Microsoft Excel (версия 2013). Приведены примеры таблиц данных (дополнительные шаблоны 1 и 2), включая объяснения по использованию и образец набора данных (дополнительные рисунки 8–10).

Подгонка модели

была выполнена в R (https://www.r-project.org/) с использованием команд нелинейной аппроксимации методом наименьших квадратов. Предоставляется код, используемый для фитинга (дополнительное примечание 2).

Весь написанный код, который использовался в этой работе, включая полностью автоматизированные макросы ImageJ и последовательности R-кода, предоставляется в качестве дополнения или доступен на Github по адресу https: // github.com / BHochreiter.

Динамическая настройка FRET в биосенсоре зеленого флуоресцентного белка

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Кристаллическая структура Twitch-2B

Мы расшифровали структуру с разрешением 2,5 Å (таблица S1A). Асимметричный блок состоит из двух мономеров (рис. S1A). Они представляют идентичные конформации отдельных доменов [среднеквадратичные отклонения (RMSDs) ниже 0,2 Å] и несколько иную междоменную конформацию (RMSD 0,992 Å), хотя, по-видимому, не собираются как симметричный гомодимер.Их интерфейс (рис. S1B), покрывающий 630 Å 2 ( 11 ), на самом деле значительно меньше, чем интерфейс стабильного димера ( 12 ). Кроме того, данные малоуглового рентгеновского рассеяния (МУРР) показывают, что в растворе Twitch-2B является мономерным (рис. S2). Поэтому мы сфокусируем наше описание здесь на мономере A. Кристаллическая структура показывает расположение донора и акцептора относительно минимального кальций-связывающего домена TnC, а также структуру оптимизированных линкеров (рис.1). Структура кальций-связывающего домена очень похожа на C-концевой глобулярный домен куриного TnC (RMSD 0,84 Å) ( 13 ), на структуру ЯМР, решенную ранее ( 8 ), и на структуру кальмодулина. (RMSD 1,08 Å) ( 14 ). Главные оси двух бочкообразных β-доменов флуоресцентного белка ориентированы почти под перпендикулярным углом друг к другу. Стволы β практически не контактируют друг с другом (рис. 2A) с очень маленькой общей границей раздела (150 Å 2 ).Интерфейсы минимального кальций-связывающего домена с mCerulean3 и cpVenus cd также относительно невелики, покрывая только 257 и 351 Å 2 , соответственно (см. Ниже). Взаимодействия в основном носят гидрофильный характер (рис. 2А).

Рис. 2 Структурные детали Twitch-2B.

( A ) Полярные взаимодействия между остатками минимального домена TnC, mCerulean3 и cpVenus cd показаны пунктирными линиями. Остатки показаны в виде палочек.( B ) Полярные взаимодействия, опосредованные остатками (показаны в виде палочек) от линкеров между mCerulean3 и кальций-связывающим доменом (у лосося), а также взаимодействия между cpVenus cd и кальций-связывающим доменом (пурпурный) . ( C ) Гидрофобные взаимодействия между остатками (показаны в виде стержней) линкеров между mCerulean3 и кальций-связывающим доменом (у лосося), а также линкером между cpVenus cd и кальций-связывающим доменом (пурпурный) с остатками (серым цветом) из ядра минимального домена TnC.( D и E ) Крупный план области вокруг N532 Twitch-2B и мутанта N532F Twitch-2B (Twitch-6).

Линкер между mCerulean3 и кальций-связывающим доменом (V 232 ADA) образует спираль 3 10 , которая прочно удерживается на месте водородными связями основной цепи от V232 и S236 в mCerulean3 до E301 и E239 кальция. -связывающий домен (рис. 2Б). Далее линкер между кальций-связывающим доменом и cpVenus cd (P 305 IYPEL) образует полтора α-спиральных витка (рис.2, B и C), карбонилы основной цепи E309 и L310 образуют водородные связи с боковой цепью R551 (рис. 2B) cpVenus cd . Боковая цепь E309 также образует водородную связь с Y152 mCerulean3, плотно связывая три домена вместе. Остатки I306, Y307 и L310 этой короткой спирали участвуют в сети гидрофобных контактов (рис. 2C). Очевидно, что скрининг оптимальных линкеров ( 8 ) привел к последовательностям со спиральными особенностями, очень хорошо интегрирующимися в структуру минимального домена TnC, в то время как эти линкеры удерживают на месте донорный и акцепторный домены в основном за счет полярных взаимодействий.

Расчет эффективности FRET на основе структуры

Структура предоставила важную информацию для расчетов FRET. Во-первых, расстояние между центрами масс флуорофоров составляет 3,65 нм (рис. 1B). Затем внутри структуры флуорофоры mCerulean3 и cpVenus cd выровнены в конфигурации «голова к голове». Таким образом, мы могли точно определить относительную ориентацию дипольных моментов флуорофоров (рис. 1C; см. Материалы и методы), которые доступны из расчетов теории функционала плотности ( 15 ).Используя эту объединенную информацию, мы рассчитали фактор ориентации κ 2 , равный 1,98 (уравнение 1; материалы и методы), и расстояние Ферстера, R 0 , 6,9 нм для mCerulean3 / cpVenus cd . Пара FRET (уравнение 3; материалы и методы). С этими параметрами, используя уравнение Фёрстера, E = R06 / (R06 + r6), теоретическая эффективность FRET, E , Twitch-2B была определена как 0,98. Эффективность FRET, экспериментально определенная с помощью деканшинга донора, равна 0.78 (рис. S3A), что значительно ниже, чем полученное из кристаллической структуры.

Два мономера Twitch-2B в асимметричном блоке (рис. S1A) не только имеют очень похожую конформацию (RMSD основной цепи 0,992 Å), но также образуют очень похожие контакты упаковки кристаллов (рис. S1C). Таким образом, мы делаем вывод, что ориентация доменов в мономере сама по себе не ограничивается кристаллической упаковкой, а в основном внутримономерными взаимодействиями, описанными выше (рис. 2А), и очень вероятно выбрана из пула уже существующих конформаций в растворе.Поскольку междоменные интерфейсы в мономере Twitch-2B относительно малы (рис. 2A), высокая гибкость решения может быть причиной наблюдаемого снижения эффективности FRET. Чтобы исследовать эту гипотезу, мы затем обратили внимание на передовые методы ЯМР.

ЯМР-исследование динамики биосенсора

Чтобы получить представление о возможной динамике, мы использовали парамагнитный ЯМР ( 16 ) с образцом Twitch-2B, где два сайта связывания кальция TnC были загружены диспрозием (Dy).Анизотропная магнитная восприимчивость комплекса TnC-Dy 2 индуцирует парамагнитный тензор выравнивания, который может быть определен из структуры ( 17 ) (см. Материалы и методы). Мы использовали спектрометры на 900 МГц и 1,1 ГГц, поскольку тензор юстировки квадратично зависит от магнитного поля. Если данный флуоресцентный белок является жестким по отношению к TnC, то тензор выравнивания, который он испытывает, идентичен TnC. Если, однако, флуоресцентный белок является динамическим по отношению к TnC, то это движение уменьшит тензор выравнивания первого ( 16 , 18 ).Это позволяет количественно оценить динамику флуоресцентных белков по отношению к TnC. В то время как диполярные связи усредняются в изотропном растворе из-за случайного изотропного переворачивания, парамагнитно-индуцированные тензоры выравнивания приводят к анизотропному распределению ориентации TnC и, следовательно, прикрепленных зеленых флуоресцентных белков в растворе, что приводит к неполному усреднению диполярного муфты, позволяющие наблюдать остаточные диполярные связи (RDC). Мы определили RDC метильных групп парамагнитно выровненного Twitch-2B ( 19 ) (см. Материалы и методы).Наблюдаемый диапазон RDC достаточен для измерения размера тензора выравнивания ( 20 ), так что отнесение метильных групп не было необходимым.

Мы обнаружили, что диапазон значений RDC и, следовательно, тензор выравнивания, испытываемый флуоресцентными белками, в 10 раз меньше, чем рассчитанные по жесткой рентгеновской структуре (рис. 3; см. Материалы и методы). Таким образом, динамика должна быть причиной несоответствия между расчетной и экспериментальной эффективностями FRET.Кристаллическая структура может быть только частью динамического конформационного ансамбля в растворе.

Рис. 3 Гистограммы парамагнитных данных RDC.

Прогнозирование RDC метильных групп в двух доменах флуоресцентного белка и TnC с использованием рентгеновской структуры (выделено пурпурным цветом). Тензор выравнивания, индуцированный двумя ионами диспрозия, связанными с TnC, является результатом трансляции тензора, полученного из кальмодулина (см. Материалы и методы). Экспериментальные RDC от парамагнитного ЯМР Twitch-2B (зеленый) и Twitch-6 (пурпурный).Дальность действия уменьшается в 10 и 5 раз для Twitch-2B и Twitch-6 соответственно.

Конструирование мутанта на основе структуры с улучшенной эффективностью FRET

Предполагая структурную целостность отдельных доменов, мы предположили, что линкерные области являются стержнем этой динамики. На границах раздела между доменом TnC и донорным и акцепторным доменами преобладают полярные взаимодействия (рис. 2А). Мы предположили, что замена этих взаимодействий гидрофобными контактами сделает линкеры жесткими и увеличит экспериментальную эффективность FRET.С этой целью мы разработали мутацию N532F (рис. 2, D и E) на поверхности cpVenus cd , создавая новое взаимодействие с F249 кальций-связывающего домена (рис. 2D). Как и ожидалось, эта мутация вызвала существенное увеличение максимального изменения отношения FRET с 800 до 1100% in vitro (рис. S4). В кристаллической структуре этого мутанта (Twitch-6; таблица S2) боковая цепь F532 действительно связывается в гидрофобный карман, образованный боковыми цепями F249, Asp262 и Y338 (рис. 2E).В остальном структуры Twitch-6 и Twitch-2B очень похожи (RMSD 0,25 Å), что приводит к почти идентичной теоретической эффективности FRET (см. Дополнительные материалы). Благодаря этой конструкции экспериментальная эффективность FRET Twitch-6 увеличилась до 0,90, с 0,78 для Twitch-2B (рис. S3B), а диапазон RDC, измеренных с Twitch-6, удвоился по сравнению с Twitch-2B (рис. 3). . Это указывает на сужение интерфейса между доменом TnC и cpVenus cd , и, таким образом, снижение динамики между доменами является причиной увеличения FRET.

Конформационные ансамбли в решении

Определив динамику как причину снижения эффективности FRET Twitch-2B в решении, мы хотели получить представление о конформационном пространстве, возникающем в результате этой динамики. Для этой цели мы выбрали конформационные ансамбли, исследующие динамику скелета исключительно на динамических линкерных областях между доменами флуоресцентного белка и доменом TnC (см. Материалы и методы), оценивая более 1 миллиона шестичленных ансамблей в сравнении с наблюдаемыми RDC и эффективностью FRET (Таблица 1, рис.4 и Материалы и методы). Среди всех возможных ансамблей мы выбрали тот, который лучше всего воспроизводит как экспериментальную эффективность FRET, так и диапазон RDC (Таблица 1). Этот ансамбль полностью объясняет, как гибкость неупорядоченных остатков линкерных областей приводит к наблюдаемому снижению эффективности FRET и диапазона RDC.

Таблица 1 Результаты выбора ансамбля. Рис. 4 Ансамбли белков Twitch, согласующиеся с измеренными эффективностями RDC и FRET.

Ансамбли для Twitch-2B (слева) и Twitch-6 (справа) содержат по шесть структур каждый, причем самые большие отклоняющиеся структуры показаны зеленым и красным.Состояния, которые не являются этими крайними конформациями, прозрачны.

Влияние на улучшенную конструкцию датчика FRET

Таким образом, мы получили кристаллическую структуру флуоресцентного кальциевого биосенсора Twitch-2B и вместе с динамикой линкеров, определенной с помощью парамагнитного ЯМР, мы количественно оценили эффективность FRET. Поскольку динамика ограничивала эффективность FRET, мы успешно сконструировали ригидифицированный мутант с увеличенным FRET. Таким образом, структурные и динамические характеристики ратиометрических датчиков FRET обеспечили принципы проектирования, которые могут быть применимы к другим системам, в которых эффекты FRET используются для восприятия сигналов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клонирование, экспрессия и очистка Twitch-2B и Twitch-6

Конструкция Twitch-2B была описана ранее ( 8 ). Для настоящего исследования кодирующую последовательность трехдоменного слитого белка клонировали в модифицированный вектор pET16b, кодирующий слитый белок с N-концевой меткой His 7 и последовательностью расщепления, распознающей вирус травления табака (TEV). Мутант Twitch-2B N532F (Twitch-6) был создан с использованием набора для сайт-направленного мутагенеза QuikChange (Agilent).Экспрессионные конструкции pET16bTEV-Twitch-2B и pET16bTEV-Twitch-6 трансформировали в штамм Escherichia coli BL21 (DE3). Экспрессию белка проводили при 303 К индукцией 0,5 мМ изопропил-β-d-1-тиогалактопиранозидом. Клетки собирали через 7 часов после индукции. Меченный селенометионином белок Twitch-2B был сверхэкспрессирован в штамме B834 метионин-ауксотрофа E. coli в минимальной среде с добавлением (+) — l-селенометионина в соответствии с группой экспрессии белка EMBL (Европейская лаборатория молекулярной биологии) (www. embl.de).

Осадок клеток из 1 литра встряхиваемой культуры ресуспендировали в 60 мл лизирующего буфера [20 мМ трис-HCl (pH 7,9), 300 мМ NaCl, 20 мМ имидазол, 0,5 мМ фенилметилсульфонилфторид с одной таблеткой полного количества ЭДТА- свободных ингибиторов (Roche) на 100 мл лизирующего буфера]. Клетки лизировали ультразвуком с последующим центрифугированием при 27000 g и 277 К. Из супернатанта рекомбинантный белок очищали с помощью аффинной хроматографии с иммобилизованным металлом на 3 мл агарозной смолы Ni-нитрилотриуксусной кислоты (NTA) (Qiagen).Метку слияния His 7 отщепляли протеазой TEV и удаляли инкубацией с 1 мл Ni-NTA агарозной смолы. Белок диализовали против 20 мМ трис (pH 7,0) и 150 мМ NaCl. После доведения концентрации сульфата аммония в растворе белка до 1 М белок дополнительно очищали хроматографией на гидрофобном взаимодействии на колонке с фенилсефарозой объемом 10 мл (GE Healthcare). Белок элюировали с этой колонки 50-мл градиентом от 1 до 0 М сульфата аммония. Фракции, содержащие белок, объединяли и концентрировали до объема 2,5 мл с помощью концентратора для ультрафильтрации с MWCO (пороговая молекулярная масса) 30 кДа (Vivascience). Наконец, белок очищали эксклюзионной хроматографией на гель-фильтрационной колонке HiLoad 26/60 Superdex 200 мкг. Фракции пика объединяли, диализовали против 20 мМ трис-HCl (pH 7,0), 100 мМ NaCl и 5 мМ CaCl 2 , и концентрацию белка доводили до 20 мг / мл.

Флуоресцентная спектроскопия

Для спектроскопии рекомбинантного Twitch-2B in vitro белок был очищен от E.coli с использованием смолы Ni-NTA, как описано ( 6 ). Спектроскопию выполняли на спектрофотометре Cary Eclipse (Varian). Донорское расщепление Twitch-2B проводили путем переваривания Twitch-2B в связанном с кальцием состоянии в течение ночи при комнатной температуре с химотрипсином (70 Ед / мл; Sigma-Aldrich) при записи FRET. Небольшое оставшееся излучение cpVenus cd после переваривания химотрипсина было выборочно фотообесцвечено (5 мин) с помощью матрицы из шести светодиодов Luxeon Lumiled с пиком на длине волны 530 нм, для общей рассеиваемой мощности 14. 7 Вт и 870 люмен. Для защиты mCerulean3 от обесцвечивания использовали LP (длиннопроходный) фильтр с длиной волны 500 нм. Связанный с кальцием Twitch-6 был очень устойчив к перевариванию протеазой. Следовательно, EGTA (конечная концентрация, 5 мМ) добавляли во время переваривания химотрипсина, чтобы получить спектр деквенированного mCerulean3.

Кристаллизация, сбор данных и определение структуры

Кристаллы Twitch-2B и Twitch-6 были получены путем диффузионного смешивания паров 1 мкл раствора белка с 1 мкл раствора для лунок [0.2 M Na-формиат (pH 7,0), 5 мМ CaCl 2 и 18-20% полиэтиленгликоля 3350]. Кристаллы были подвергнуты криозащите, перенеся их в хорошо раствор с добавлением от 16 до 18% глицерина на 1 мин и быстро охладив, погрузив их в жидкий азот.

Сбор данных производился в PXII, SLS, Швейцария, с использованием детектора PILATUS 6M (Dectris). Собственные данные собирали при 100 К на длине волны 1 Å. Данные по производному селенометионина были измерены при 0,98 Å. Все данные были обработаны с помощью программного обеспечения для детектора рентгеновских лучей (XDS) ( 21 ) и масштабированы с помощью SADABS (Bruker AXS).Определение пространственной группы и статистический анализ выполняли с использованием XPREP (Bruker AXS). Фазирование выполняли с помощью AutoSol ( 22 ).

Первоначальная модель была построена с помощью AutoBuild и дважды уточнена с помощью phenix.refine ( 23 ) с промежуточным ручным построением модели с помощью Coot ( 24 ). Окончательная модель была получена путем комбинированного ручного отслеживания (Coot) и уточнения с использованием Refmac5 ( 25 ). На графике Рамачандрана 96,69% ​​остатков располагались в предпочтительной области 2.72% в разрешенной области и 0,58% остатков были выбросами. Кристаллическая структура Twitch-6 была решена с помощью PHASER ( 26 ), используя PDB (Protein Data Bank) запись 6GEL в качестве модели поиска. Построение и уточнение модели выполнялись, как описано для Twitch-2B. Для этого мутанта 96,68% остатков попали в предпочтительную область графика Рамачандрана, 2,83% попали в разрешенную область и 0,49% были выбросами.

Расчеты FRET

Фактор ориентации κ 2 может быть извлечен из структурной информации следующим образом: κ2 = (cos θT — 3 cos θD cos θA) 2 (1) где θ T — угол между эмиссионным переходом диполь донора и диполь перехода поглощения акцептора; θ D и θ A — углы между этими диполями и вектором r , соединяющим донорный и акцепторный флуорофоры ( 27 ).Ориентация дипольных моментов перехода относительно вектора связи C O (ω) в градусах ωD = 73 ° ωA = 76 ° была взята из Ansbacher et al. ( 15 ), а угловые параметры были извлечены из кристаллографических координат в угловых единицах θT = 152,95 ° θD = 149,17 ° θA = 26,79 °

Подробные вычисления объяснены в файле данных S1. Интеграл перекрытия, Дж, (λ), был рассчитан из экспериментальных спектров поглощения и излучения изолированных доменов cpVenus и mCerulean3 соответственно (рис. S5) со сценарием Python, включенным в качестве дополнительной информации. J (λ) был определен как 2,052 × 10 15 M −1 см −1 нм 4 , следующим образом: J (λ) = ∫0∞FD (λ) εA (λ) λ4dλ = ∫0∞FD (λ) εA (λ) λ4dλ∫0∞FD (λ) dλ (2) где F D (λ) — нормированная интенсивность флуоресценции донора в диапазоне длин волн от λ до λ + Δλ. ε A (λ) — коэффициент экстинкции акцептора при λ.

Расстояние Ферстера, R 0 , может быть вычислено из ранее полученных экспериментальных параметров R0 = 0.211 (κ2n − 4QDJ (λ)) 1/6 (3) где Q D (0,87) — квантовый выход донора в отсутствие акцептора ( 4 ) и n , (1,33) показатель преломления водной среды.

Наконец, эффективность передачи энергии, E , может быть рассчитана как отношение скорости передачи к общей скорости распада донора в присутствии акцептора E = R06R06 + r6 (4)

Следуя этой процедуре, эффективность FRET была определена как E = 0. 979, из кристаллографической структуры Twitch-2B. Эквивалентный расчет, выполненный со структурой мутанта Twitch-6, дает E = 0,983 (см. Файлы данных S1 и S2).

ЯМР-спектроскопия

Мы экспрессировали белки Twitch-2B и Twitch-6 в минимальной среде Toronto, приготовленной из 100% D 2 O и пердейтерированной d-глюкозы и дополненной предшественниками аминокислот α-кетомасляной кислотой (метил-13C , 3,3-D2) и α-кетоизовалериановой кислоты (3-метил-13C, 3,4,4,4-D4), тем самым селективно мечение атомами 13 C и 1 H только метильных групп остатки валина, лейцина и изолейцина, сохраняя при этом остальные атомы C как 12 C и протоны как 2 H ( 19 ).

Сначала были получены спектры изотропных образцов в буфере A [20 мМ Mops (pH 7,0), 100 мМ NaCl и 5 мМ CaCl 2 в 100% D 2 O]. Затем белки диализовали против буфера B [20 мМ Mops (pH 7,0), 100 мМ NaCl и 10 мМ EDTA] с последующим диализом против буфера C [20 мМ Mops (pH 7,0) и 100 мМ NaCl] и, наконец, заменяли на буфер С, приготовленный на 100% D 2 O, содержащем три эквивалента диспрозия, перед измерениями ЯМР. Концентрация белка в образцах была примерно 0.5 мМ.

Образцы были протестированы с помощью экспериментов с метил-TROSY ( 19 , 28 ) (рис. S7) при 900 МГц и 1,1 ГГц, а связи J и J + RDC были определены с использованием J -модулированного Эксперимент с метил-TROSY ( 29 ), изображенный на рис. S6 в виде матриц 2048 × 128 комплексных точек данных с 96 переходными процессами на приращение ( t 1 ). Общие использованные задержки модуляции J были следующими: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 и 20 мс (рис.S8). ЯМР-эксперименты проводились с использованием 5-мм TCI (криозонда тройного резонанса с инверсным детектированием) на спектрометре 900 МГц и 3-мм криозонда TCI на спектрометре 1,1 ГГц, оба оснащены консолями NEO (Bruker). Интенсивности (максимальная амплитуда) сигналов были извлечены с помощью CARA (компьютерное определение резонанса) ( 30 ) в экспериментах с обработкой NMRPipe ( 31 ) и проанализированы с помощью скриптов Python (рис. S8), следуя Pederson et al. ( 29 ).

Расчет парамагнитного тензора

Мы взяли парамагнитный тензор из комплекса кальмодулин-IQ, связанного с диспрозием, из ( 18 ) и рассчитали суммарный тензор дважды занятого кальцийсвязывающего домена TnC. Сайт связывания кальция 1 TnC перекрывается с сайтом связывания лантанидов кальмодулина (CaM N60D). Мы повернули матрицу выравнивания с сайта связывания кальция из CaM на второй сайт связывания кальция TnC и добавили его к тензору сайта связывания кальция 1, таким образом получив общий тензор TnC.Затем этот тензор использовался для расчета RDC из парамагнитных белков Twitch ACaM = (1,05 10−31−1,92 10−322,04 10−31−1,92 10−32−1,22 10−316,46 10−322,04 10−316,46 10−321,67 10−32 ) ATwitch = (1,46 10-318,39 10-323,46 10-318,39 10-32-1,06 10-312,26 10-323,46 10-312,26 10-32-3,92 10-32)

Тензоры даны в м 3 M −1 .

Генерация ансамбля

Сначала мы индивидуально смоделировали все возможные двугранные углы основной цепи (ϕ и ψ; выборка с шагом 60 °) линкерных остатков (от Arg 229 до Gln 231 для mCerulean3 и Met от 311 до Gly 313 ​​ для cpVenus), что не привело к стерическому конфликту между одним из модифицированных доменов флуоресцентного белка и доменом TnC. Каждую из двух линкерных областей моделировали независимо. Из всех возможных комбинаций ϕ, ψ (117 649) вращение mCerulean3 привело к 477 возможным конформациям, в то время как cpVenus допустил 84 конформации, обеспечивая в целом 40 086 возможных конформаций.

Во-вторых, мы случайным образом объединили возможные структуры для mCerulean-TnC и TnC-cpVenus в ансамбли из шести членов. Мы произвольно отобрали 1 миллион шестичленных ансамблей из 40 068 возможных ϕ, ψ комбинаций линкеров между mCerulean и TnC и между TnC и cpVenus, чтобы гарантировать правильное исследование конформационного пространства Twitch.

В-третьих, мы рассчитали диапазон RDC (используя тензор, полученный, как описано выше) и FRET ансамблей и сравнили их с экспериментальными значениями, определив коэффициент качества ансамбля Qens = ∑i = 1i = 6 (RDCi − RDCeRDCe) 2+ (FRETi-FRETeFRETe) 2, где RDC i — диапазоны распределения, субиндекс e указывает экспериментальное значение, а i указывает значение из члена ансамбля. Такое значение добротности отличается от 0, если согласования предсказанных откликов RDC и FRET от ансамбля отклоняются от экспериментальных данных, и 0 в случае полного согласия.Наконец, ансамбли были отсортированы по их Q ens , и был выбран самый низкий из них.

Измерения SAXS

Данные SAXS были собраны на канале BM29 Европейского центра синхротронного излучения (ESRF) в Гренобле, Франция, с использованием автоматического устройства смены образцов ( 32 ). Белок диализовали либо против буфера A [20 мМ Mops (pH 7,0), 100 мМ NaCl и 5 мМ CaCl 2 ] (связанное с кальцием состояние), либо против буфера B [20 мМ Mops (pH 7,0), 100 мМ NaCl и 10 мМ ЭДТА] (без кальция).Перед измерением белок центрифугировали для удаления более крупных частиц. Образцы измеряли при концентрациях 2,5, 10 и 20 мг / мл. Буфер для диализа использовали для коррекции эталонного буфера. Данные собирали при 293 К с использованием длины волны 0,995 Å и расстояния от образца до детектора 2,867 м. Загружали сто микролитров каждой концентрации образца, собирали и объединяли 10 кадров. Образцы непрерывно подавались в кювету, чтобы свести к минимуму эффекты радиационного повреждения.Изображения детектора были объединены и преобразованы в одномерные кривые рассеяния, а вклады буфера в рассеяние были вычтены с использованием программного обеспечения BsxCuBE. Дальнейшая обработка данных выполнялась автоматически с использованием онлайн-конвейера EDNA ( 33 ) для оценки качества образца и эффектов радиационного повреждения. Агрегации белков или радиационного повреждения не наблюдалось.

Данные были дополнительно проанализированы с помощью программного пакета ATSAS ( 34 ). Вкратце, первичная обработка и анализ данных были выполнены с использованием программ PRIMUS ( 35 ) и GNOM ( 36 ).

Теоретическое рассеяние от кристаллической структуры было рассчитано с использованием программы CRYSOL ( 37 ) (рис. S2), а молекулярные массы рассчитаны с использованием образца бычьего сывороточного альбумина в качестве стандарта.

Благодарности: Мы благодарим персонал компании SLS, X10SA за поддержку при сборе рентгеновских данных и ESRF, BM29 за поддержку при сборе данных SAXS. Мы благодарим M. Paulat, C. Schwiegk и A. Moritz за техническую помощь в производстве белка и K.Оверкамп для масс-спектров электроспрея. С. благодарит T. Gruene и G. Sheldrick за советы по уточнению кристаллической структуры и структурному анализу. К.Г. и П.Т.-М. поблагодарить R. Kuemmerle (Bruker Biospin) за измерения ЯМР на частоте 1,1 ГГц. Финансирование: Эта работа была поддержана Обществом Макса Планка и DFG SFB 870 (O.G.). П.Т.-М. был поддержан докторской стипендией Гумбольдта. Вклад авторов: P.T.-M. выполнен ЯМР. П.Т.-М. и К.Г. разработал парамагнитный метод ЯМР.П.Т.-М. рассчитаны структурные ансамбли. П.Т.-М. и С. выполнены измерения SAXS. К.Г. рассчитал FRET по рентгеновским структурам. T.T. и O.G. определили экспериментальные эффективности FRET. С. кристаллизовал Twitch-2B и Twitch-6 и решил кристаллические структуры. Рукопись написана всеми авторами. С. разработал проект. Конкурирующие интересы: Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов. Доступность данных и материалов: Структуры депонированы с кодом 6GEL для биосенсора Twitch-2B и 6GEZ для мутанта Twitch-2B N532F (Twitch-6).Все данные, необходимые для оценки выводов в статье, представлены в документе и / или дополнительных материалах. Дополнительные данные, относящиеся к этой статье, могут быть запрошены у авторов.

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно.Ниже приведены наиболее частые причины:

  • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки вашего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
  • Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
  • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
  • Дата на вашем компьютере в прошлом.Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
  • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файле cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта.Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

Контроль связывания дофамина с помощью нового аптамера для биосенсора на основе FRET

Основные моменты

Требования к структуре и последовательности для нового аптамера дофамина, охарактеризованного ITC.

Измерено буферное и температурно-зависимое связывание дофамина.

Разработан складной датчик FRET, и эта информация полезна для разработки других типов биосенсоров, использующих этот аптамер.

Abstract

Дофамин — один из важнейших нейромедиаторов. В 2018 году было сообщено о высококачественном ДНК-аптамере дофамина. Однако фундаментальное понимание его связывания и фолдинга отсутствует, что имеет решающее значение для конструкции соответствующего биосенсора.Здесь мы провели тщательные анализы, используя метод без меток, называемый изотермической титрационной калориметрией (ITC), для изучения его вторичной структуры. Мы разделили этот аптамер на четыре области и индивидуально исследовали каждую из них. Мы подтвердили наличие двух стержней, но считается, что третий стержень является частью петли. Затем аптамер был усечен. Исходный аптамер имел K d 2,2 ± 0,3 мкМ при 25 ° C. Укорочение структуры на одну или две пары оснований увеличило K d до 6.9 и 44,4 мкМ соответственно. Связывание дофамина стимулировалось как увеличением концентрации Mg 2+ , так и снижением температуры. При 5 ° C достигается K d 0,4 ​​мкМ. Основываясь на этом понимании, мы разработали два биосенсора тушения с резонансным переносом энергии флуоресценции (FRET), которые отличаются только парой оснований. Более короткий сенсор имел в 3 раза большую чувствительность и предел обнаружения 0,9 мкМ. В 1% фетальной бычьей сыворотке датчик сохранил аналогичный предел обнаружения 1.14 мкМ. Также был продемонстрирован ратиометрический датчик FRET с двумя флуорофорами с низким пределом обнаружения 0,12 мкМ. Эта работа показала возможность разработки складных сенсоров для дофамина, и эта конструкция может быть распространена на другие методы измерения, такие как электрохимия и колориметрия.

Ключевые слова

Аптамеры

Мутация

Изотермическая калориметрия титрования

Дофамин

Флуоресцентный резонансный перенос энергии

Рекомендуемые статьи Цитирующие статьи (0)

Полный текст

© 2020 Elsevier B. V. Все права защищены.

Рекомендуемые статьи

Ссылки на статьи

Молекулярные детерминанты контактов ЭР – Гольджи, идентифицированные с помощью новой системы FRET – FLIM | Журнал клеточной биологии

Затем мы исследовали молекулярные механизмы, лежащие в основе потребности идентифицированных хитов в поддержании ERTGoCS и, в частности, зависело ли это от их активности переноса липидов. ORP10 ассоциируется с микротрубочками, но также и с комплексом Гольджи (рис.5 А; Nissilä et al., 2012), и хотя он не обладает каноническим доменом FFAT, он может взаимодействовать с VAP (Weber-Boyvat et al., 2015; Murphy and Levine, 2016). ORP10 принадлежит к подсемейству ORP, в которое входят члены, которые могут переносить PS (Maeda et al., 2013), такие как ORP5 и ORP8, которые передают PS в обмен на PI4P между ER и PM (Chung et al., 2015), в то время как Было показано, что сам ORP10 связывает и извлекает PS (Maeda et al., 2013). Мы наблюдали, что остатки оксистерин-родственного домена (ORD) ORP5 / ORP8, которые участвуют в обмене PS / PI4P (Chung et al., 2015) очень хорошо законсервированы в ORP10 (Fig. 5 B). Чтобы выяснить, обусловлена ​​ли потребность в ORP10 в поддержании ERTGoCS структурной ролью или его активностью переноса липидов, устойчивый к siRNA ORP10 реэкспрессировался в клетках с истощенным ORP10 как в его WT-форме, так и в формах, где сайты ORD участвуют в Связывание PS (L418D) и PI4P (H535 / 536A) было мутированным (фиг. 5B). Мы обнаружили, что WT, но не мутантные формы ORP10, которые были правильно нацелены на комплекс Гольджи (рис.5 C), может восстанавливать ERTGoCS в истощенных по ORP10 клетках (фиг. 5 D и фиг. S3, A и B), указывая на то, что активность ORP10 по переносу липидов необходима для стабильности этих MCS. PS синтезируется в ER, но обогащается PM, TGN и эндосомами (Leventis and Grinstein, 2010; Fairn et al., 2011), где он асимметрично распределяется между двухслойными листочками, ограничиваясь цитозольным листком. Таким образом, мы проверили возможность того, что ORP10 может участвовать в переносе PS из ER в цитозольный листок мембран TGN, изучая влияние истощения ORP10 на субклеточное распределение PS с использованием двух различных генетически кодируемых зондов: PS-связывающего домена лактадгерина. (Домен C2; Yeung et al., 2008; Рис. 5 E) и эвектина (домен PH; Uchida et al., 2011; рис. S3 C). Мы обнаружили, что истощение ORP10 индуцировало снижение PS в Гольджи, что было оценено по распределению двух зондов PS (Рис. 5 E и Рис. S3 C), которое показало заметное сокращение пула Гольджи (но не PM пул) в клетках ORP10-KD и наблюдением, что меньшее количество мембран TGN из клеток ORP10-KD сохраняется на PS-аффинных гранулах по сравнению с контрольными клетками (фиг. S3 D).

Таким образом, ORP10 необходим для защиты содержания PS в TGN и, в то же время, в ERTGoCS (рис.4, А – Е; Рис. 5 E; и фиг. S3, C и D), что указывает на то, что липидный состав TGN и, в частности, его содержание PS, имеет решающее значение для создания / поддержания этих структур. Подтверждая эту гипотезу, добавление экзогенного PS частично восстанавливает ERTGoCS в ORP10-истощенных клетках (Fig. 5 F). Аналогичные результаты были получены, когда продукция PS была увеличена за счет сверхэкспрессии мутантной (P269S) формы PS-синтазы 1, которая нечувствительна к ингибированию продукта (Sousa et al., 2014; Sohn et al., 2016; Рис. 5 G и Рис. S3 E).

Мы рассмотрели тот же вопрос (т.е. структурная роль в сравнении с зависимой от активности переноса липидов ролью в поддержании ERTGoCS) для OSBP1, который, как было обнаружено, является обязательным партнером ORP9 в поддержании ERTGoCS. С этой целью мы изучили влияние итраконазола, ингибитора активности обмена липидов OSBP1 (Strating et al., 2015), на стабильность ERTGoCS и обнаружили, что он не оказывает ингибирующего действия ни на контрольные клетки, ни на ORP9-KD. ячеек (рис.5 H).

Тернер и его коллеги используют двумерную электронную спектроскопию для изучения сигналов FRET

В статье «Двумерная электронная спектроскопия выявляет спектральную динамику переноса энергии резонанса Фёрстера», опубликованной в CHEM (том 5, выпуск 8, август 2019 г. ), Дэниел Тернер и его коллеги разрабатывают модель подписей FRET в 2D ES, которая помочь отличить их от других сигналов. Первым автором является аспирант химии Нью-Йоркского университета Брайан Петков, к нему присоединились другие докторанты Нью-Йоркского университета Тобиас Геллен, Камилла Фарфан, Уильям Карбери и Белинда Хетцлер.В список авторов включены профессор химии Дженис Калтер из Нью-Йоркского университета Дирк Траунер и доцент Нью-Йоркского университета в Шанхае Уильям Гловер и аспирант Синпин Ли, а также Дарин Улнесс из Университета Миннесоты.

Реферат: Двумерная электронная спектроскопия (2D ES) исследует энергии хромофоров и их взаимодействие, поэтому этот метод в настоящее время широко используется для изучения механизмов передачи энергии возбуждения. Повсеместное распространение и важность резонансной передачи энергии Фёрстера (FRET) требуют тщательного изучения его характеристик в 2D ES.Здесь, используя принципы спектроскопии зашумленного света для учета события спонтанного переноса, мы описываем модель сигналов, которые возникают из FRET в 2D ES. Эта модель дает три теоретических результата относительно пика передачи энергии, которые согласуются с нашими лабораторными измерениями. Второе неожиданное открытие заключается в том, что процессы сольватации, которые вызывают динамический стоксов сдвиг акцепторного сигнала, также вызывают относительно более медленное красное смещение сигнала передачи энергии, обнаруживая фундаментальное различие в релаксации сольватации между фотовозбужденными и возбужденными FRET молекулами акцептора.Подписи, полученные из модели, служат эталоном для текущей работы над механизмами передачи энергии.

Здесь Тернер и его коллеги разрабатывают модель FRET в 2D ES, основанную на шумном свете, чтобы учесть вибрации, которые ее активируют. Что особенно важно, они обнаруживают несколько неуказанных особенностей, которые отличают FRET от других сигналов. Эти сигнатуры являются фундаментальными и сразу же применимы к текущей работе над фотосинтетическими комплексами, солнечными наноматериалами и другими ключевыми моментами в области возобновляемых источников энергии. Будущая междисциплинарная работа, начиная от исследований передачи энергии в организмах и заканчивая медицински применимыми методологиями биовизуализации, будет использовать преимущества этих спектральных и временных сигнатур.

Это исследование было поддержано Национальным научным фондом и Фондом Альфреда П. Слоана.

Кевин Фрет, открытый гей-исполнитель латинских ловушек, застрелен и убит в Пуэрто-Рико

Кевин Фрет, звезда социальных сетей из Пуэрто-Рико, объявивший себя первым открыто гомосексуальным латинским исполнителем ловушек, был смертельно ранен в Сан-Хуане рано утром в четверг. в полицию и местные новостные репортажи.

Г-н Фрет, 25 лет, ехал на мотоцикле в районе Сантурсе около 5:30 утра, когда он получил два выстрела: в голову и бедро, сообщила полиция. Его доставили в ближайшую больницу, где констатировали мертвым.

Полиция еще не сообщила имя человека, в которого стреляли, ожидая опознания тела, но менеджер г-на Фрета, Эдуардо Родригес, подтвердил его смерть в заявлении для Billboard.

Его смерть наступила на фоне всеобщей обеспокоенности по поводу преступности в Пуэрто-Рико; в среду топ F.Б.И. тамошний чиновник заявил, что остров столкнулся с «кризисом насилия».

В статье, опубликованной в апреле, журнал Paper Magazine назвал мистера Фрета «первым открыто гомосексуальным пионером латинской ловушки». В том же месяце он выпустил сингл под названием «Soy Así» или «I’m Like This».

Видео «Soy Así», которое было просмотрено более 500 000 раз на YouTube, начинается с того, что мистер Фрет одет в блестящий укороченный топ и обтягивающие брюки в тон, с винтовкой (предположительно поддельной) в руке. Окруженный женщинами в откровенных нарядах, он хвастается своей внешностью, макияжем и дизайнерской одеждой и называет себя «реинкарнацией Фриды Кало».

«Я человек, которому все равно, что говорят», — сказал он журналу.

«Молодые геи или молодые лесбиянки, которые смотрят на меня сейчас как на образец для подражания, типа вау, если он это сделал, и ему все равно, что скажут другие, я могу это сделать».

Латинский трэп возник на Карибах в середине 2000-х, смешивая южный хип-хоп с местными звуками. Плохой Банни, Мессия и Озуна — все они работали с Карди Би — являются одними из самых известных ее практикующих.

В заявлении для Billboard г-н.Менеджер Fret, г-н Родригес, сказал, что его клиент был «артистической душой и большим мечтателем».

«Его страстью была музыка, — добавил он, — и ему еще многое нужно было сделать».

В июле г-н Фрет появился в видео художника Майка Дюрана на песню «Diferente». Были знакомые образы — деньги, бикини, — но внешность мистера Фрета, одетого в сетчатую футболку с радугой в джакузи, а затем в белоснежной рубашке с блестящей короной и невероятно длинными ресницами, на самом деле была очень красивой. разные.

Сами Немир Оливарес, пуэрториканский писатель и активист, живущий в Нью-Йорке, сказал, что г-н Фрет олицетворяет надежду для таких людей, как он сам, которые столкнулись с издевательствами и домогательствами из-за своей сексуальной ориентации.

«Кевин Фрет представил свежий взгляд на музыкальный жанр, который очень гомофобен и очень мачистичен», — сказал он.

Г-н Фрет использовал хвастовство и перформативность жанра, чтобы обосновать инклюзивность, утверждал г-н Немир Оливарес.

«В Пуэрто-Рико это акт сопротивления», — добавил он.

Но не всегда все шло гладко. Г-н Фрет решительно отреагировал после того, как стал объектом гомофобных угроз в лирике конкурирующего артиста, что заставило некоторых усомниться в том, было ли его убийство мотивировано ненавистью.

Полиция искала другого мужчину на мотоцикле, который был с г-ном Фретом, когда его нашли, но быстро скрылся. Пока нет никаких указаний на мотив.

Г-н Фрет также жил в Майами в последние месяцы. В июне он был заряжен батареей после драки в районе Брикелл.Г-н Фрет сказал, что на него напали из-за своей сексуальности.

У него было много подписчиков в Instagram, но в четверг сообщений не было видно, что указывает на то, что он, возможно, удалил предыдущие сообщения.

Leave a Reply

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

2019 © Все права защищены.