2130 лада: 2130 — двигатель ВАЗ 1.8 литра


0
Categories : Разное

Содержание

Что надо знать про мотор 2130 перед покупкой Лада 4×4 5D|Слабый мотор

Прародителем ДВС ВАЗ 2130 объемом 1.8 стал ДВС 21213. Конструкторы брали за основу данный мотор, поэтому он получился очень похож по свои характеристикам на него. По задумке конструкторов в ДВС применили блок с увеличенной высотой и коленчатый вал с увеличенным соответственно радиусом кривошипа. Такое нововведение в конструкции позволило мотору увеличить объем и крутящий момент. Применен в сборке автомобиля Лада 4×4 5D, у которого до 2006 года было название ВАЗ 2131 «Нива», а также 21312.

Период серийного производства1993 – н. в.
Материал блокаЧугун
Наличие гильз в цилиндрахНе предусмотрено
Варианты системы питанияКарбюратор/инжектор
Количество цилиндров, шт4
Количество клапанов на цилиндр, шт2
Ход поршня, мм84
Диаметр цилиндра, мм82
Степень сжатия9,4
Объем мотора, см³1774
Мощность, л.с.82 (при 5200 об.мин)
Крутящий момент, нм139 (3200 об.мин)
ТопливоАИ93
Норма расхода топлива, л на 100 км:
в городе16.5
на трассе9.7
в смешанн.12.1
Норма расхода масла, гр на 1000 км700
Вес, кг122
Геометрические размеры, мм560х350х710
Масло в двигатель5W-30, 5W-40, 10W-40, 15W-40
Заправочный объем масла, л3.75 (заливать 3.5 до отметки на щупе «max»)
Ресурс заданный заводом, км80 000

Слабые места двигателя ВАЗ 2130

Водяной насос (помпа). После того, как вы проедете 2000 км, вы начнете замечать шум со стороны помпы при работе двигателя. К сожалению, у данного ДВС наблюдается быстрый износ подшипника водяного насоса. В итоге, насос выходит из строя, соответственно циркуляция охлаждающей жидкости не происходит, что чревато для

мотора перегревом, клином, то есть выходом из строя. Чтобы избежать данных проблем, желательно менять помпу так же часто, как и ремень ГРМ. Можете делать это одновременно. Стук и скрежет говорит о подшипнике помпы.

Сальники двигателя, МКПП и раздаточной коробки. В двигателе 2130 используются сальники низкого качества. Поэтому желательно менять их гораздо чаще, чем это указано в руководстве по эксплуатации.

 

Генератор. Даже после покупки нового автомобиля у владельцев происходило неприятное событие — под капотом начинал гудеть и шуметь двигатель. К сожалению, все классические двигатели ВАЗ имеют одну и ту же проблему — разрушение подшипника генератора. В двигателе не предусмотрена конструкция регулировки натяжения ремня. Поэтому уже через 4000-10000 км после ремонта скорее всего вы снова получите сгоревший генератор.

 

Стартер. Еще одна извечная проблема — автомобиль заводится достаточно проблематично, а порой вообще не заводится. Связано это с низким ресурсом работы без ремонта. Для исправления проблемы достаточно увеличить ресурс узла. Можно поставить реле на стартер. Так замок зажигания будет жить долго.

 

Коробка передач. На большом пробеге вашего авто появляется новый дефект — вылет пятой передачи. На четвертой передаче на скорости 80+ появляется гул, когда педаль газа находится в средней фазе между полным отпусканием педали и началом подачи нагрузки. Причин может быть много, но основные: износ или поломка блокирующего кольца синхронизатора;износ вилки переключения;ослабление затяжки гайки хвостовика вторичного вала; и другое.

 

Термостат. Эта проблема появляется достаточно часто. Термостат перестает обеспечивать тепловой режим охлаждающей жидкости системы охлаждения двигателя. Проблема отказа термостата кроется внутри него самого. Если вы хотите проверить, исправно ли работает термостат, вам нужно запустить двигатель, и положить ладонь на нижний шланг. По нему бежит тосол, необходимый для охлаждения ДВС. Если спустя некоторое время шлаг остается холодным, то замену термостата необходимо провести как можно скорее.

 

Вакуумный усилитель тормозов. Спустя некоторое время после начала эксплуатации водитель сталкивается с проблемой плавающих оборотов, если выжимать педаль тормоза. Также это может сопровождаться шипением. Еще одним признаком проблемы является тугость педали тормоза при нажиме. Обычно из строя выходят резинотехнические изделия и хомуты в соединениях. Проблема решается их заменой.

 

Поршневые пальцы и шатунные подшипники также очень часто дают сбой. Если под капотом вы слышите металлический стук, то проблема наверняка в них. Срочно нужно ехать в сервис. Доехать туда можно самостоятельно на небольшой скорости.

 

Коренные подшипники также являются слабым местом двигателя.При их износе наблюдается стук в нижней части двигателя и падение давления масла. Об этом говорит специальный индикатор на приборной панели. В таком случае, работу двигателя необходимо прекратить и ехать для ремонта в сервис при помощи буксира.

 

Цепь ГРМ с механизмом натяжения слабые места и расходные элементы, подлежащие одновременной замене через 80 000 км, то есть при капитальном ремонте после окончания ресурса. Скрип в двигателе ВАЗ 2130 говорит о проблеме с успокоителем и натяжением цепи ГРМ.

Недостатки двигателя ВАЗ 2130

Заводской брак блока цилиндров. К огромному сожалению Нивоводов, в начале эксплуатации автомобилей возник массовый дефект ДВС 2130 (дефект касается и других моделей 2121, 21213, 21214, 2131). Дефект проявляется в виде лужицы масла на коллекторе. Этот дефект встречается практически у всех автомобилей Нива примерно после 5000 км пробега. Замена прокладки, заливной крышки проблему не решает. Полный разбор двигателя показывает, что отверстие под шпильки коллектора просверлены больше, чем нужно. Но и это еще не самое страшное. Дело в том, что эти отверстия попадают под шпильку распредвала. Из-за этого образуется сквозной канал в форме буквы Г. В ответ на многочисленные претензии автовладельцев ВАЗ сделал официальное заключение, где признали данный дефект производственным. Причина кроется в несоблюдении технологического процесса при сверлении отверстий под две средние шпильки впускного коллектора. Завод рекомендует выкрутить шпильки, обезжирить их и резьбовые отверстия, нанести на шпильку герметик УГ-10, Локтайт 638 или другие подобные герметики в соответствии с инструкциями применения герметиков. Дефект критический, но устраняется просто с минимальными трудовыми и материальными затратами.

 

Необходимость регулировки клапанов. Очень часто владельцы автомобилей с ДВС ВАЗ 2130 сталкиваются со стуком, шумом, перегревом двигателя. При работе двигателя на холостых оборотах может появится неожиданный стук. Это говорит о том, что пришло время регулировать клапаны в двигателе. Делать это обязательно нужно каждые 10 000 км.

 

Своевременная и качественная замена масла — основной способ увеличить срок жизни двигателя ВАЗ 2130. Если вы будете использовать низкокачественное масло, либо несвоевременно менять его, то это непременно приведет к увеличению диаметра цилиндров. После пробега 60 000 км диаметры цилиндров увеличатся на 0,15 мм.
Чистка жиклеров карбюратора — обязательная процедура для сохранения нормальной работоспособности. Проводите чистку как можно чаще, во избежание неполноценной работы двигателя. Если ДВС начинает задыхаться на холостых оборотах или вовсе глохнет, то рекомендуется отрегулировать воздушную заслонку. Решить в данном случае проблему можно только в сервисе. Здесь виноваты система питания или зажигания. Это что касается карбюраторных модификаций.

 

У инжекторных ДВС ВАЗ 2130, также встречается проблема с нестабильной работой на холостых оборотах (работает неустойчиво и с перебоями). Также появляется проблема хлопков в выхлопной трубе. Это из-за того, что затрудняется пуск через загрязненные форсунки, и топливо не сгорая попадает в цилиндр. Прочищать форсунки в инжекторных моделях ДВС желательно каждые 50 000 км.

Ресурс до капитального ремонта очень низкий, как и у других классических моторов ВАЗ он составляет 80 000 км.

 

Вывод. Надежность карбюраторных и инжекторных модификаций ВАЗ 2130 осталась на одном уровне с надежностью моторов ВАЗ 21213 и 21214 и предыдущих моделей классики. В «хороших руках» в эксплуатации движок ходит в среднем до 150 000 км пробега.

P. S. Уважаемые нивоводы! Ваши отзывы о слабых местах и недостатках ДВС ВАЗ 2130, его плюсах и минусах станут частью данной статьи и помогут многим заинтересованным людям в выборе автомобиля для покупки.

Похожие записи:

Головка блока (ГБЦ) ВАЗ 21300-1003011-20 V=1800. Для инжекторных двигателей.

Головка блока цилиндров (ГБЦ)  ВАЗ 2130-1003011-20 «голая».

Купить 

Головка блока (ГБЦ) ВАЗ 2130-1003011-20 V=1800 инж.

Рассчитать стоимость доставки по России или получить консультацию 
Вы можете по телефону (495) 960 94 60 или в онлайн консультанте на сайте https://lada-autodetal.ru/

Головка блока ВАЗ 2130-1003011-20 используется на инжекторных двигателях V=1800.

Головка цилиндров ВАЗ 2130-1003011-20 конструктивно не отличается от головки 21214, но имеет увеличенную камеру сгорания. Камера сгорания выполнена с размером 81х53 мм и объемом 34,3 см куб. В отверстии камеры просматриваются две фрезерованные ступеньки высотой около 1 мм.  
Головка 2130-1003011-20, делается из отливки 21214 (поэтому на ней номер 21214), путём фрезеровки камер сгорания.

  • 2130-   (1,8 л., 84,7 л.с.)

Применяемость:

  • ВАЗ «Нива»: 21214, 2131; «Надежда» 2120 и их модификации.

Двигатель ВАЗ 2130 карбюраторный

1. Оформление заказа

После выбора товара нажмите кнопку Купить — товар добавится в вашу корзину.

Далее, если вы закончили выбирать товар, нажмите кнопку ваша корзина.

На странице ваша корзина будут перечислены все выбранные вами товары.

В поле Количество вы пожете изменить количество товара для покупки. После изменения количества товара необходимо нажать кнопку Обновить для пересчета итоговой суммы заказа.

Также можно ввести код скидки в соответствующее поле.

2. Оформление и подтверждение заказа

После ввода необходимой информации для оформления заказа вам нужно нажать кнопку Оформить заказ  Ввести все данные 

в колонках заказа (ФИО получателя, адрес доставки, контактные данные, вариант доставки, способ оплаты и т.д) 

Копия заказа будет выслана на ваш e-mail, указанный при оформлении заказа.

Внимание! Неправильно указанный номер телефона, неточный или неполный адрес могут привести к дополнительной задержке! Пожалуйста, внимательно проверяйте ваши персональные данные при регистрации и оформлении заказа.

Через некоторое время (обычно в течение часа) после оформления покупки, с вами свяжется наш менеджер по контактным данным, указанным при оформлении заказа. С менеджером можно будет согласовать точное время и сроки доставки, а также уточнить детали.

Примечание: Для постоянных клиентов на сайте магазина есть Регистрация. В своем кабинете вы можете просмотреть содержимое корзины, историю своих заказов,узнать количество скидочных баллов а также повторить или отказаться от заказа, подписаться на рассылку новостей магазина.

3. Оплата и цены

Внимание! Указанные на сайте цены не являются публичной офертой и на момент оплаты могут быть изменены. 

Для каждого отдельного заказа возможен только один способ оплаты на ваш выбор. Оплата заказа по частям различными способами невозможна.

Возможные способы оплаты:

  • Наличный расчет. 
    Оплата производится наличными курьеру при доставке или в магазине при самовывозе. Вместе с товаром передается не обходимые документы.
  • Оплата банковскими картами. 
    Оплата картами МИР, VISA, MASTERCARD, MAESTRO
    Оплата через Сбербанк Онлайн, Яндекс.Деньги, Qiwi Valet, Альфа-Клик, Промсвязьбанк.
  • Оплата через Сбербанк. 
    Вы можете оплатить заказ в любом отделении Сбербанка. За услугу по переводу денег с вас возьмут от 3 до 7% от стоимости заказа, в зависимости от региона.

Премьер-министр Фиджи отвергает совет «переходить на более высокие места», поскольку Австралия обеспокоена климатом

СИДНЕЙ (Рейтер) — Премьер-министр Фиджи в среду нанес ответный удар по высказываниям австралийского политика о том, что фиджийцам следует искать более возвышенные позиции в ответ на повышение уровня моря. по результатам опроса, показывающего, что австралийские избиратели считают глобальное потепление своей главной угрозой.

Премьер-министр Фиджи Франк Байнимарама выступает на конференции ООН по изменению климата COP24 2018 в Катовице, Польша, 3 декабря 2018 года.REUTERS / Kacper Pempel

Изменение климата привело к расколу между основными партиями Австралии в преддверии выборов 18 мая, опросы которых показывают, что правительство проиграет, но в Тихоокеанском регионе проблема представляет собой экзистенциальную проблему безопасности, поскольку повышение уровня воды уже вызывает деревни переехать.

В своем выступлении в Мельбурне премьер-министр Фиджи Фрэнк Байнимарама сказал, что климатический кризис должен по праву играть роль в принятии решений избирателями, а затем обратил внимание на комментарии Джона Александера, ставшего чемпионом по теннису, а ныне действующим в правительстве.

The Sydney Morning Herald сообщила, что Александр сказал на форуме избирателей на прошлой неделе, что, хотя Баинимарама сказал, что Австралия должна прекратить сжигать уголь, приоритетом должна быть помощь в перемещении поселений на Фиджи и ее соседях на более возвышенные места.

«Я чувствую себя вправе дать ответную подачу», — сказал Байнимарама в среду. «Решение о переселении фиджийской общины может показаться простым. Но бросить дом — это не какое-то холодное и расчетливое деловое решение.

«Для пострадавших это глубоко эмоциональная потеря… Я очень хочу услышать, что (Александр) считает, что народ Кирибати должен делать перед лицом поднимающегося уровня моря, где самая высокая точка в их стране находится всего на высоте 1,8 метра (6 футов) над уровнем моря ».

Речь прозвучала, когда предвыборная кампания в Австралии достигла апогея.

Оппозиционная Лейбористская партия пообещала установить цель по возобновляемым источникам энергии, увеличить внедрение электромобилей и заставить загрязнителей покупать кредиты для компенсации выбросов. Правящая Либерально-национальная коалиция назвала политику слишком дорогостоящей, а также пообещала сократить выбросы в Австралии.

Сиднейский аналитический центр Lowy Institute заявил, что австралийцы считают изменение климата главным в списке возможных угроз национальным интересам согласно опросу 2130 взрослых, опубликованному в пятницу.

Опрос показал, что 61% австралийцев считают, что этим следует заниматься, даже если это требует значительных затрат. Это на два процентных пункта больше, чем годом ранее, в основном за счет людей в возрасте от 18 до 44 лет.

«Я думаю, что австралийцы реагируют на политический вакуум в отношении изменения климата в Австралии, а также изменения погодных условий, — сказала Рейтер Наташа Кассам, научный сотрудник Института Лоуи.

Отчетность Тома Уэстбрука; Редакция Ника Макфи

Отец размышляет — моим детям 2130

Тед Браун

Более 111 лет назад отцы поступали так, как отцы сегодня.

Беспокойство о семье; жена и дети
Размышляют о своих финансах.
Не уснуть из-за событий в мире.
И т.д., сейчас и навсегда…

Между тем и сейчас нет большой разницы в отцовстве.Да, я сижу здесь, в доме, который был перевезен грузовиком на участок земли, восстановленной под паром, и использую какое-то гибридное сжатое устройство, похожее на пишущую машинку, размером с простой лист бумаги, чтобы порождать слова в теории двоичной энергии, протекающей через воздух. к случайному набору машин, потерянных на складе где-то в мире, в то время как какой-то искусственный интеллект подсказывает мне, как исправить и настроить мой язык, чтобы он был идеальным по словам, пить кофе из далекого места за столом из псевдодревесины на неизменный вечный стул.В отличие от моего векового соотечественника, который в своем собственном доме, за столом и стулом читает газету, каракулями на бумаге чернилами и пером, гадая, выдержит ли погода, пока он благополучно доставит свою семью в церковь в Форде.

Но да, не сильно отличается…

На протяжении тысячелетий мы с ним задавали вопрос: «Что значит быть отцом?» «Как мне сегодня ориентироваться в мире, чтобы обеспечивать свою семью?» «Почему так сложно убедиться, что все работает правильно?» «Смогу ли я обеспечить своих детей тем, что им нужно?»

Тед и его жена Кимберли.

«Что мне делать?»

Это последнее, что меня поймало. Я смотрю на этот экран, как на страшные статьи с эссе прошлых лет, не зная, что сказать. Глубокие мысли о великой мудрости пробегают по синапсам в моем мозгу, но каким-то образом их уничтожают кролики в виде незанятых мусорных баков, грязной одежды, моей работы и отношений между мной и моими детьми, все время отвлекаясь на суету моей неописуемо привлекательной жены вокруг кухни.

Focus, человек…

Они не выходят.Слова мудрости то есть. По крайней мере, не так, как я хочу. Я печатаю, удаляю, снова печатаю, снова удаляю. Я борюсь с мыслью, что отцовство — это какое-то благородное дело, которое должно быть признано массами. Написанная Мудростью звучала как какая-то дрянная коммерческая валентинка. Удалить. Снова кролики…

На самом деле, отцов нужно праздновать. Тихое стремление к отцовству — трудная вещь. Чтобы стать отцом, нужен кобель особой породы. Теперь я понимаю, что мне нужно уточнять слово «отец».Любой мужчина Homosapien может произвести потомство, чтобы стать отцом. Обычно это занимает около 5 минут, в идеале — желающая самка. Слово «отец», о котором я говорю, является результатом многих лет сознательного и преднамеренного образа жизни, который способствует долгосрочному осуществлению жизни в других. Поколение за поколением накопленная мудрость передавалась от отца к сыну, создавая жизнь, достойную прожитой жизни. Я говорю об «отце».

Если (и это большой IF) я мог бы свести то, что я почерпнул из поколений отцов моей родословной, я думаю, это могло бы быть заключено в двух нематериальных активах: честности и ответственности.

Эти две идеи кажутся повсеместными в человеческом существовании и специфичны для каждого часа тяжелой работы.

Честность, а не моралистическая функция слова, проистекает из идеи, что «человек хорош лишь на слове». С самого начала отцовства я дал слово обеспечивать и защищать от болезней и здоровья до конца своих дней. Принятие на себя ответственности за эту семью, независимо от обстоятельств и вопреки всему, имеет первостепенное значение.Роль отца заключается в том, чтобы быть очень гибкой, но прочной опорой, связанной и синхронной со своим супругом, в ответственности за свою семью и за нее. Честность — ключ, а ответственность — это замок, открывающий дверь к самореализации в жизни. Без этого в семье ничего не получится.

Вот и все, по сути.

Нет простого способа сказать это. В мире недостаточно сахара, чтобы это лекарство пошло на убыль. Я остро борюсь с этим каждый день. Это то, что нужно делать, но никогда не может быть сделано последовательно и полностью закончено.

Тем не менее, для меня большая радость и честь попробовать. Я не могу дождаться следующей возможности заняться этими вещами; достойные аспекты этого начинания. Я люблю пробовать «если». Я люблю это приключение…

Я надеюсь, что, когда я отмечаю 110-ую годовщину Дня отца, вы ощутите гордость за честность и ответственность.

Interbase FRET в РНК: от А до Я | Исследование нуклеиновых кислот

Абстрактные

Interbase FRET может предоставить очень подробную информацию о расстоянии, ориентации и динамике нуклеиновых кислот, дополняя существующие методы структуры и динамики.Здесь мы сообщаем о первой паре аналогов основания РНК FRET, состоящей из донора tC O и неэмиссионного акцептора tC nitro . Акцепторный рибонуклеозид здесь синтезирован и впервые включен в РНК. Эта пара FRET точно сообщает среднюю структуру РНК A-формы, и ее полезность для исследования структурных изменений РНК демонстрируется путем мониторинга перехода от A- к Z-форме РНК. Наконец, измеренные данные FRET сравнивали с теоретическими паттернами FRET, полученными из двух ранее описанных структур Z-RNA PDB, чтобы пролить новый свет на эту неуловимую конформацию РНК.

ВВЕДЕНИЕ

Биологические роли различных РНК жизненно важны и разнообразны и включают кодирование, регуляцию и экспрессию генов, а также катализ. Это отражает важность вторичной и третичной структуры и динамики для их функции, что подчеркивает необходимость разработки инструментов, которые могут исследовать такие параметры (1). Фёрстеровский резонансный перенос энергии (FRET) — это процесс, в котором энергия передается без излучения между донорным и акцепторным хромофором.Эффективность этого процесса сильно зависит как от расстояния, так и от ориентации между хромофорами; следовательно, может быть получена информация о структуре и / или относительном положении различных меченных донорами и акцепторами биомолекул в физиологических условиях in vitro, или даже в живых клетках (2, 3). FRET особенно ценен для изучения больших и гибких структур, таких как РНК и комплексы РНК-белок, которые трудно поддаются традиционным методам высокого разрешения, таким как ЯМР и рентгеновская кристаллография (4).Этот метод также можно использовать для получения более подробной информации о структуре и динамике, например, путем объединения измерений FRET одиночных молекул с подробным анализом и моделированием (5).

На сегодняшний день внешние хромофоры с (предположительно) случайной ориентацией использовались в большинстве исследований FRET для исследования совместной локализации и расстояний, что означает, что используется только зависимость от расстояния. Например, индуцированное ионами сворачивание изгибов в РНК было исследовано с использованием мечения концов флуоресцеином и Cy3 (6).Одним из способов повышения уровня информации, получаемой от FRET в системах РНК, могло бы быть использование аналогов флуоресцентных оснований, которые прочно расположены внутри нуклеиновой кислоты и, следовательно, сообщают как о расстоянии, так и об относительной ориентации между донором и акцептором. Было показано, что это позволяет с высокой точностью исследовать структурные изменения в ДНК (7,8). До сих пор сообщалось об ограниченном количестве FBA для РНК, например tC O (9), тиено [3,4- d ] пиримидины ( th A, ​​ th C, th G и th U) (10) и изотиазоло [4,3 — d ] пиримидинов ( tz A, ​​ tz C, tz G и tz U) (11), суррогат U с приложениями в исследованиях связывания малых молекул РНК (12), аналог пиримидина для Исследования G-квадруплекса (13) и нуклеозидов расширенной РНК (кРНК) (14).Однако межосновной FRET был исследован только для ДНК с использованием либо неэмиссионного акцептора (FRET-пары tC O –tC nitro (15), qAN1 – qA nitro (8) и pA – qA nitro ). (16)) или эмиссионного акцептора ( th dG – tC) (17). Использование эмиссионного акцептора теоретически может обеспечить простое колориметрическое считывание и прямой и полезный внутренний контроль эффективности FRET при условии, что полосы эмиссии донора и акцептора существенно разделены.Однако большинство FBA с высокой эмиссией излучают в довольно узком диапазоне длин волн (400–500 нм), и результирующее перекрытие эмиссии может добавить дополнительный уровень сложности и неопределенности к анализу FRET. Напротив, неэмиссионный акцептор позволяет количественно оценить эффективность FRET просто как уменьшение флуоресценции (или времени жизни) донора по сравнению с флуоресценцией одного донора, что значительно упрощает анализ данных и повышает точность.

Здесь мы сообщаем о первых исследованиях межосновного FRET в РНК с использованием пары FRET tC O –tC nitro (Рисунок 1).Неэмиссионная акцепторная молекула tC nitro синтезирована и впервые охарактеризована для использования в контексте РНК. В сравнительном исследовании мы видим отличное соответствие между наблюдаемыми и теоретически предсказанными значениями эффективности FRET для РНК А-формы без существенных признаков структурных нарушений по сравнению с дуплексом РНК естественной формы А, что указывает на то, что эту пару FRET можно использовать для исследования структурные изменения внутри РНК с высокой точностью. Более того, общее использование межосновного FRET для исследования структурных изменений в РНК продемонстрировано здесь с использованием конформационного изменения от A- к Z-форме.

Рисунок 1.

Структура эмиссионного донора FRET tC O и неэмиссионного акцептора FRET tC nitro .

Рисунок 1.

Структура эмиссионного донора FRET tC O и неэмиссионного акцептора FRET tC nitro .

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Синтез и характеристика фосфорамидита рибо-tC нитро представлены в дополнительных данных.Фосфорамидит рибо-tC O был синтезирован согласно литературным данным (9). Твердофазный синтез олигорибонуклеотидов, модифицированных tC O / tC nitro , и их характеристики описаны в дополнительных данных.

Все использованные образцы, если не указано иное, были приготовлены в 10 мМ натрий-фосфатном буфере, pH 7,4, с добавлением 100 мМ NaCl и 1 мМ EDTA. Все образцы были смешаны и обработаны в стерильной среде, свободной от РНКазы. Концентрацию олигонуклеотида определяли путем измерения поглощения при 260 нм.Молярную поглощающую способность немодифицированных одиночных цепей олигонуклеотидов при 260 нм рассчитывали с использованием онлайн-анализатора олигонуклеотидов IDT (Integrated DNA Technologies; http://eu.idtdna.com/calc/analyzer). Молярная абсорбционная способность модифицированных цепей была рассчитана таким же образом с заменой модифицированного основания на цитозин и с поправкой на разницу молярной абсорбции между цитозином (ϵ = 7400 M -1 см -1 ) и tC O ( ϵ = 11000 M −1 см −1 ) или tC nitro (ϵ = 9700 M −1 см −1 ) на длине волны 260 нм.

Гибридизация образцов РНК А-формы, используемых для УФ-плавления и кругового дихроизма, была достигнута путем смешивания каждой донорной цепи с равным количеством акцепторной цепи при 22 ° C с последующим быстрым нагреванием до 95 ° C и, через 10 мин, охлаждение до 5 ° C при 7,5 ° C h −1 . Концентрация донорных нитей при отжиге составляла 4 мкМ. Образцы РНК в форме A – Z, используемые для УФ-плавления и кругового дихроизма, были приготовлены аналогичным образом, за исключением того, что каждая донорная цепь была смешана с 30% избытком ее комплементарной цепи (для обеспечения полной гибридизации донорных цепей) и что концентрация доноров при отжиге составляла 5.08 мкМ.

Образцы для эталонного исследования A-РНК FRET были гибридизованы, как указано выше, с 30% избытком его комплементарной цепи (для обеспечения полной гибридизации донорных цепей) и концентрацией донорной цепи 2 мкМ во время отжига.

Гибридизация образцов для исследования FRET от A- до Z-РНК была достигнута путем смешивания каждой донорной цепи со 100% избытком ее комплементарной цепи при 22 ° C с последующим быстрым нагреванием до 75 ° C и, через 10 мин, охлаждением. до 55 ° C при 1,7 ° C h -1 с последующим охлаждением до 5 ° C при 60 ° C h -1 .Концентрация донорной нити во время отжига составляла 20 мкМ (была выбрана более высокая концентрация, чтобы способствовать гетеродуплексному отжигу по сравнению с самоотжигом в шпильки).

Все образцы, использованные для измерения РНК A-формы, были впоследствии разбавлены до 2 мкМ фосфатным буфером, тогда как образцы Z-формы были разбавлены фосфатным буфером и достаточным количеством NaClO 4 · H 2 O (Sigma-Aldrich) для получения результата. в желаемой концентрации NaClO 4 (8 M, если не указано иное), принимая во внимание результирующее изменение плотности раствора (18), а также корректируя разницу в концентрации образца (определяемую поглощением при 260 нм) .

Все образцы измеряли сразу после отжига или хранили при -20 ° C между измерениями.

РНК УФ-плавление и круговой дихроизм

Кривые плавления

РНК в УФ-диапазоне регистрировали на приборе Cary 4000 (Varian Technologies) с программируемым многопозиционным температурным блоком при нагревании от 20 ° C до 90 ° C и последующем охлаждении до 20 ° C со скоростью 0,5 ° C мин. -1 . Поглощение при 260 нм регистрировали каждые 0,5 ° C в течение двух циклов. Концентрация дуплекса во всех измерениях составляла 2 мкМ.Температуры плавления рассчитывались как максимум первой производной кривых плавления в УФ-диапазоне после сглаживания с помощью FFT-фильтрации.

Спектры кругового дихроизма (КД) регистрировали на спектрометре КД Chirascan (Applied Photophysics), сканирование которого составляло от 200 до 600 нм, с использованием времени интегрирования 0,5 с и трех повторов. Концентрация дуплекса составляла 2 мкМ, и все спектры корректировались на фоновый вклад.

Измерения флуоресценции

Спектры стационарного излучения регистрировали на SPEX Fluorolog 3 (Jobin Yvon Horiba) с длиной волны возбуждения 377 нм.Концентрация дуплекса во всех образцах составляла 2 мкМ в стационарном режиме и при измерении срока службы. Эмиссия регистрировалась между 385 и 745 нм при скорости сканирования 600 нм мин -1 .

Квантовые выходы были измерены для дуплексов только с tC O (т.е. без tC nitro ) с длиной волны возбуждения 356 нм с использованием сульфата хинина (Φ f = 54,6%) в 0,5 MH 2 SO 4 в качестве справки. Эмиссия регистрировалась в диапазоне от 360 до 690 нм при скорости сканирования 600 нм мин. -1 .

Время жизни флуоресценции определяли с помощью коррелированного по времени подсчета одиночных фотонов (TCSPC). Образцы возбуждали импульсным лазерным диодом PicoQuant (10 МГц), излучающим на длине волны 377 нм, а эмиссионный монохроматор был установлен на 460 нм. Подсчет проводился с помощью фотоумножителя с микроканальной пластиной R3809U-50 (Hamamatsu) и вводился в многоканальный анализатор Lifespec (Edinburgh Analytical Instruments) с 2048 каналами. Условие остановки было установлено на 10 000 отсчетов в верхнем канале. Реконволюционная подгонка к двух- или трехэкспоненциальным функциям выполнялась с помощью Fluofit Pro v.4 (PicoQuant GmbH). Средние времена жизни были взвешены по амплитуде в соответствии с уравнением (1):

$$ \ begin {уравнение *} \ langle \ tau \ rangle = \ frac {{\ mathop \ sum \ nolimits_i {\ alpha _i} {\ tau _i}} } {{\ mathop \ sum \ nolimits_i {\ alpha _i}}} \ end {формула *} $$

(1) где | $ \ langle \ tau \ rangle $ | — среднее время жизни, | $ {\ tau _i} $ | — это i -е время жизни и | $ {\ alpha _i} $ | — амплитуда и -го времени жизни. Измерения были продублированы. Эффективность FRET рассчитывалась исходя из времени жизни стационарного излучения и флуоресценции в соответствии с уравнениями (2 и 3):

$$ \ begin {уравнение *} E = 1 — \ frac {{{I _ {{\ rm DA }}}}} {{{I _ {\ rm D}}}} \ end {уравнение *} $$

(2)

$$ \ begin {уравнение *} E = 1 — \ frac {{{\ tau _ {{\ rm DA}}}}} {{{\ tau _ {\ rm D}}}} \ end {формула *} $$

(3) где I — интегральная интенсивность донора, а τ — среднее время жизни донора.6}} \ end {формула *} $$

(5) где η — показатель преломления среды (1,4 для биомолекул), Φ D — квантовый выход донора, Дж ( λ ) — интеграл перекрытия, R DA — расстояние между донором и акцептором, а κ 2 — фактор ориентации, описывающий относительную ориентацию дипольных моментов перехода донора и акцептора. Зная фотофизические свойства пары FRET (Φ D и J ( λ )), а также относительное положение и ориентацию донора и акцептора ( R DA и κ 2 ), Ожидаемая эффективность переноса рассчитывалась с помощью программы FRETmatrix на основе MATLAB (19).Протокол немного отличался для A- и Z-формы РНК (рис. 2A), как описано ниже.

Рисунок 2.

( A ) Общие трехмерные структуры A- и Z-формы РНК. ( B ) Иллюстрация шести основных ступенчатых параметров, используемых при построении структур нуклеиновых кислот. Рисунок адаптирован из Lu et al. (20).

Рисунок 2.

( A ) Общие трехмерные структуры A- и Z-формы РНК. ( B ) Иллюстрация шести основных ступенчатых параметров, используемых при построении структур нуклеиновых кислот.Рисунок адаптирован из Lu et al. (20).

А-форма
Средние базовые параметры шага для A-формы были взяты из Olson et al. (21) На рис. 2В показаны шесть различных параметров основного шага, которые используются для построения моделей нуклеиновых кислот. Чтобы создать плавную кривую, которая направляет взгляд, каждый базовый шаг был разделен на 10 шагов одинакового размера, для которых было вычислено гипотетическое значение FRET. В расчетах использовалась ориентация дипольных моментов перехода tC O и tC nitro (22,23), а также экспериментально наблюдаемый квантовый выход tC O в контексте каждой последовательности: 19.1% для эталонного исследования A-РНК и 20,9% для исследования A- в Z-РНК (дополнительные таблицы S4 и S8). Используя уравнение (6), интеграл перекрытия, J DA , был экспериментально определен как 1,7 · 10 14 нм 4 M −1 см −1 для эталонного исследования A-RNA и 1,5 × 10 14 нм 4 M -1 см -1 для A-формы РНК в исследовании A- в Z-РНК. {\ rm {4}}} {\ rm {d}} \ lambda \ end {формула *} $$

(6) где I D — это зависящий от длины волны спектр излучения донора, нормированный для интегрирования к единице, ϵ A — зависящая от длины волны молярная поглощающая способность акцептора, а λ — длина волны в нм.
Z-образная форма

Для обеспечения возможности сравнения между тремя ранее описанными Z-образными структурами (1T4X, 2GBX и 1QBJ), которые являются 6-мерными, и нашей структурой, которая представляет собой 14-мерную структуру, мы использовали метод, в котором мы расширили 6меров ранее описанных PDB- файлы на 14меров с использованием усредненных параметров базового шага. PDB-файлы сначала были проанализированы с помощью Web 3DNA для получения параметров базового шага для каждой структуры (24). Каждый параметр был усреднен для создания усредненных параметров базового шага GC и CG для конкретной структуры.Используя эти параметры, для каждой структуры был создан новый файл базовых шагов, содержащий 14 вместо исходных 6 базовых пар. Наконец, используя эти базовые файлы, стандартные геометрии пар оснований Уотсона-Крика, квантовый выход tC O в Z-РНК (Φ f = 21,3%) и спектральное перекрытие между эмиссией tC O и абсорбция tC nitro в Z-РНК ( J DA = 1,4 × 10 14 нм 4 M -1 см -1 ), теоретическая эффективность FRET при различных разделениях для каждой структуры рассчитывались с помощью FRETmatrix (19).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Синтез tC

нитро

Мы недавно сообщили о синтезе и включении в РНК tC O -рибонуклеозида и пришли к выводу, что рибо-tC O сохраняет дуплекс A-формы, поддерживает высокий квантовый выход независимо от контекста последовательности и, следовательно, является отличным FRET. кандидат в доноры для межосновного FRET в РНК (9). В данной работе мы сообщаем о синтезе неэмиссионного акцептора FRET tC нитро -рибонуклеозида и его фосфорамидитного субстрата 5 (схема 1).2′-O-TBS-защищенный рибонуклеозид tC nitro ( 4 , схема 1) был синтезирован в масштабе нескольких граммов по пятиэтапному протоколу. Силильная защитная группа соединения 1 , включая защиту 2′-OH TBS, необходимую для конечного строительного блока, была введена на первом этапе на основе ранее опубликованной методологии (25). Затем соединение 1 было подвергнуто кросс-сочетанию CS-катализатора с тиолом 2 , что позволило селективно формировать связь CS при сохранении защитных групп и стереохимии нуклеозидного фрагмента с получением соединения 3 в Доходность 81%.Трициклическая ароматическая система tC nitro была сконструирована с конденсацией с замыканием цикла, для которой PyBOP оказался уникально активным. В мягких условиях продукт внутримолекулярной конденсации был получен с высокой селективностью по межмолекулярной реакции. Затем с полученного полностью защищенного нитро рибонуклеозида tC была снята защита с получением соединения 4 . Две стандартные стадии защиты (26,27) дали желаемый строительный блок из нитро -фосфорамидита tC 5 для включения олигорибонуклеотида.

Схема 1.

Синтез tC нитро фосфорамидита 5 . Реагенты и условия: ( A ) t -Bu 2 Si (OTf) 2 , DMF, 0 ° C, 1 ч; затем имидазол, 0 ° C, 30 мин; затем TBS-Cl, RT, 12 ч. ( B ) NH 2 NH 2 (водн.), EtOH, КТ, 18 ч. ( C ) CuI, Cs 2 CO 3 , ДМСО, 60 ° C, 24 ч. ( D ) PyBOP, DBU, MeCN, 0 ° C, 1 ч; затем КТ, 4 ч.( E ) Py · (HF) x , CH 2 Cl 2 , 0 ° C -> RT, 6 ч. ( F ) DMTr-Cl, Py, 0 ° C, 30 мин; затем КТ, 4 ч. ( G ) CEP-Cl, DIPEA, THF, RT, 20 ч.

Схема 1.

Синтез tC нитро фосфорамидита 5 . Реагенты и условия: ( A ) t -Bu 2 Si (OTf) 2 , DMF, 0 ° C, 1 ч; затем имидазол, 0 ° C, 30 мин; затем TBS-Cl, RT, 12 ч. ( B ) NH 2 NH 2 (водн.), EtOH, КТ, 18 ч. ( C ) CuI, Cs 2 CO 3 , ДМСО, 60 ° C, 24 ч. ( D ) PyBOP, DBU, MeCN, 0 ° C, 1 ч; затем КТ, 4 ч. ( E ) Py · (HF) x , CH 2 Cl 2 , 0 ° C -> RT, 6 ч. ( F ) DMTr-Cl, Py, 0 ° C, 30 мин; затем КТ, 4 ч. ( G ) CEP-Cl, DIPEA, THF, RT, 20 ч.

Тест FRET А-формы РНК

Для изучения FRET в РНК с использованием tC O и tC nitro , мы синтезировали три донорные последовательности, содержащие tC O , и четыре комплементарных акцепторных последовательности, содержащие tC nitro (рис. 3A), а также их немодифицированные аналоги, названные D0 и A0 соответственно.Эти нити позволяют образовывать дуплексы с 2–13 п.н., разделяющими донор и акцептор. Спектры КД дуплексов, модифицированных tC nitro , очень похожи на спектры соответствующего немодифицированного дуплекса, что указывает на то, что tC nitro не нарушает A-форму (дополнительный рисунок S1). Кроме того, свойства УФ-плавления дуплексов, модифицированных tC nitro , показывают, что tC nitro , как и tC O , оказывает немного стабилизирующее действие на A-форму РНК, причем степень стабилизации зависит от ближайших соседей (1 .4–1,7 ° C для 5′-C tC nitro U-3 ‘; 3,9–4,2 ° C для 5’-U tC nitro C-3 ‘; Дополнительная таблица S1) (9).

Рисунок 3. Последовательности

( A ) РНК, используемые для исследования характеристик межосновного FRET в А-форме РНК. ( B ) Последовательности РНК, используемые для исследования перехода от A- к Z-форме РНК. Обозначения последовательностей DX и AY отражают положения донора, tC O (синий), и неэмиссионного акцептора, tC nitro (оранжевый), в последовательности, считая от ( A ) 5′- конец или ( B ) 5′-конец GC-повтора донорсодержащей последовательности.Каждая комбинация последовательностей содержала только один донор и максимум один акцептор. Абазовые сайты обозначены нижним подчеркиванием. Полный список всех дуплексов, используемых в этом исследовании, см. В дополнительных таблицах S1 и S7.

Рисунок 3. Последовательности

( A ) РНК, используемые для исследования характеристик межосновного FRET в А-форме РНК. ( B ) Последовательности РНК, используемые для исследования перехода от A- к Z-форме РНК. Обозначения последовательностей DX и AY отражают положения донора, tC O (синий), и неэмиссионного акцептора, tC nitro (оранжевый), в последовательности, считая от ( A ) 5′- конец или ( B ) 5′-конец GC-повтора донорсодержащей последовательности.Каждая комбинация последовательностей содержала только один донор и максимум один акцептор. Абазовые сайты обозначены нижним подчеркиванием. Полный список всех дуплексов, используемых в этом исследовании, см. В дополнительных таблицах S1 и S7.

Флуоресцентные свойства tC O и tC nitro в A-форме РНК суммированы в таблице 1. Важно отметить, что tC O сохраняет высокий и стабильный квантовый выход флуоресценции независимо от контекста последовательности (9), и там представляет собой отличное перекрытие длинноволновой полосы излучения tC O с полосой поглощения tC nitro (рис. 4).Предполагая свободное вращение дипольных моментов перехода (κ 2 = 2/3), теоретическое расстояние Фёрстера для пары tC O –tC нитро FRET в РНК составляет 28 Å, что соответствует почти одному полному обороту спираль А-формы РНК.

Таблица 1.

Абсорбционные и флуоресцентные свойства tC O и tC nitro внутри двухцепочечной А-формы РНК

. λ абс., ​​Макс. [нм] . ϵ макс. [M −1 см −1 ] . λ em, макс. [нм] . Φ f [%] . 〈τ〉 [нс] .
tC Oa 368–373 (370) 7400–9700 (8300) 452–460 (456) 20–25 (22) 3,8–4,7 (4,3)
tC нитро b 449–458 (454) 6400–7100 (6800)
9057 .
λ абс., ​​Макс. [нм] . ϵ макс. [M −1 см −1 ] . λ em, макс. [нм] . Φ f [%] . 〈τ〉 [нс] .
tC Oa 368–373 (370) 7400–9700 (8300) 452–460 (456) 20–25 (22) 3.8–4.7 (4,3)
tC nitro b 449–458 (454) 6400–7100 (6800)
p Таблица 1.

Поглощающий флуоресцентные свойства tC O и tC nitro внутри двухцепочечной А-формы РНК

. λ абс., ​​Макс. [нм] . ϵ макс. [M −1 см −1 ] . λ em, макс. [нм] . Φ f [%] . 〈τ〉 [нс] .
tC Oa 368–373 (370) 7400–9700 (8300) 452–460 (456) 20–25 (22) 3,8–4,7 (4,3)
tC нитро b 449–458 (454) 6400–7100 (6800)
9057 .
λ абс., ​​Макс. [нм] . ϵ макс. [M −1 см −1 ] . λ em, макс. [нм] . Φ f [%] . 〈τ〉 [нс] .
tC Oa 368–373 (370) 7400–9700 (8300) 452–460 (456) 20–25 (22) 3.8–4.7 (4,3)
tC нитро b 449–458 (454) 6400–7100 (6800)

Рис. 4.

Спектральное перекрытие между испусканием tC O и поглощением tC nitro в А-форме РНК. Спектры нормированы на их длинноволновые максимумы. Измерения проводили при комнатной температуре в фосфатном буфере, pH 7,4, 123 мМ Na + .

Рис. 4.

Спектральное перекрытие между испусканием tC O и поглощением tC nitro в А-форме РНК. Спектры нормированы на их длинноволновые максимумы. Измерения проводили при комнатной температуре в фосфатном буфере, pH 7,4, 123 мМ Na + .

Чтобы исследовать применимость межосновного FRET с использованием tC O и tC nitro в РНК-системах, измеренная эффективность FRET сравнивалась с теоретическим значением для A-формы РНК, которое было рассчитано на основе установленной структуры РНК и свойств зонда.Для сравнения также были рассчитаны теоретические значения, основанные на B-форме РНК. В этом исследовании эффективность FRET как функция расстояния донор-акцептор была измерена с использованием измерений стационарного излучения и времени жизни флуоресценции tC O в дуплексах с tC nitro и без него (дополнительные таблицы S2 и S3; дополнительный рисунок S2). На рис. 5 показана средняя эффективность переноса этих двух методов вместе с теоретической эффективностью FRET для tC O –tC nitro внутри статической A-формы и B-формы нуклеиновой кислоты.Пунктирные кривые, показывающие эффективность переноса также при неестественном нецелочисленном разделении, добавлены к рисунку для направления взгляда. Локальные минимумы этих кривых происходят от разделений, где диполи перехода донора и акцептора должны быть перпендикулярны друг другу и, следовательно, составляют геометрию, в которой передача энергии не может происходить в этом статическом теоретическом представлении структуры нуклеиновой кислоты.

Рисунок 5.

Эффективность FRET между tC O и tC nitro в А-форме РНК как функция разделения пар оснований.Голубые ромбы обозначают усредненные данные измерений в установившемся режиме и в течение срока службы. Черные ромбы обозначают прогнозируемую эффективность FRET для tC O –tC nitro внутри А-формы РНК, а пунктирная кривая показывает прогнозируемую эффективность FRET при нецелочисленных разделениях. Серые ромбы обозначают прогнозируемую эффективность FRET для tC O –tC nitro внутри B-формы нуклеиновой кислоты, а пунктирная кривая показывает прогнозируемую эффективность FRET при нецелочисленных разделениях. Измерения проводили при комнатной температуре в фосфатном буфере, pH 7.4, 123 мМ Na + .

Рис. 5.

Эффективность FRET между tC O и tC nitro в А-форме РНК как функция разделения пар оснований. Голубые ромбы обозначают усредненные данные измерений в установившемся режиме и в течение срока службы. Черные ромбы обозначают прогнозируемую эффективность FRET для tC O –tC nitro внутри А-формы РНК, а пунктирная кривая показывает прогнозируемую эффективность FRET при нецелочисленных разделениях. Серые ромбы обозначают прогнозируемую эффективность FRET для tC O –tC nitro внутри B-формы нуклеиновой кислоты, а пунктирная кривая показывает прогнозируемую эффективность FRET при нецелочисленных разделениях.Измерения проводили при комнатной температуре в фосфатном буфере, pH 7,4, 123 мМ Na + .

Измеренные данные точно соответствуют предсказанному паттерну FRET А-формы, показывая, что аналоги оснований прочно укладываются внутри РНК, и настоятельно предполагают, что они не вызывают значительного возмущения структуры РНК. Таким образом, это эталонное исследование показывает, что пара tC O –tC nitro FRET отлично подходит для измерения межосновного FRET в РНК, особенно при разделении 4–12 п.н. Ранее мы показали, как связывание нетропсина с ДНК и переход от B к Z в ДНК можно изучать с помощью межосновного FRET (7,8).Поскольку фотофизические свойства tC O и tC nitro хорошо известны (см. Таблицу 1 выше), аналогичные исследования внутри РНК теперь должны быть возможны, что делает межосновной FRET с использованием tC O –tC nitro мощным дополнением к существующие методы изучения структуры РНК, конформационных изменений и динамики.

Форма от A до Z FRET

Чтобы проиллюстрировать потенциал этого метода, мы разработали исследование, в котором tC O –tC нитро FRET применяли для исследования конформационных изменений в РНК, в данном случае перехода от A- к Z-РНК.Структура правой B-формы ДНК и A-формы РНК хорошо охарактеризована. Однако и ДНК, и РНК также могут принимать левую структуру, называемую Z-формой. Z-форма ДНК была впервые кристаллизована и охарактеризована с помощью рентгеновской кристаллографии в 1979 г. (28), тогда как первая левосторонняя структура РНК была описана в 1984 г. (29). Как и в случае с Z-формой ДНК, переход от A- к Z-форме РНК происходит предпочтительно в чередующихся GC-повторах, но для индукции трансформации необходимы более экстремальные солевые условия.Биологическая роль Z-формы РНК до сих пор неясна, но окрашивание антителами к Z-РНК указывает на ее присутствие в цитоплазме и ядрышке (30), а некоторые белки интерферонового ответа имеют домены, которые могут стабилизировать Z-форму РНК (31). Однако не хватает инструментов, которые могли бы контролировать структурные изменения Z-РНК в системах живых клеток, а структурные исследования Z-РНК немногочисленны; только две 6-мерные структуры были представлены в базе данных PDB: исследование ЯМР, где Z-форма индуцируется высокой концентрацией соли (6 M NaClO 4 , PDB ID: 1T4X), и кристаллографическое исследование Z-формы РНК вместе с фермент ADAR1 (PDB ID: 2GXB) (31,32).

Чтобы сравнить структуры, депонированные в PDB, и структуры, использованные в этом исследовании, мы применили теорию FRET для прогнозирования паттернов FRET, ожидаемых от tC O –tC nitro при вставке в разные положения в два олигорибонуклеотида, каждый из которых имеет структура, соответствующая одной из упомянутых выше записей PDB (рисунок 6A). Поскольку некоторые исследования указывают на сильное сходство между Z-формой ДНК и РНК, теоретический паттерн FRET, полученный с использованием структуры Z-формы ДНК, связанной с ADAR1 (PDB ID: 1QBJ), был включен в качестве дополнительного сравнения (31,33).Как видно на рисунке 6A, теоретический паттерн FRET для трех указанных структур демонстрирует общее сходство, но также и значительные различия из-за структурных различий между ними. Поскольку Z-форма в основном встречается в GC-повторах, наши аналоги цитозина предоставляют прекрасную возможность изучить конформационные изменения от A- к Z-форме РНК. Наша цель в этом исследовании РНК из A- в Z-форму была двоякой: во-первых, установить, можно ли использовать FRET между основаниями для исследования перехода РНК из A- в Z.Это конформационное изменение обычно контролируется с помощью CD, для чего требуются приборы, которые реже используются в научно-исследовательских лабораториях, значительно более высокие количества образцов, чем при измерениях флуоресценции, и несовместимы с измерениями в целлюлозе . Во-вторых, чтобы получить новую структурную информацию о Z-РНК и поместить ее в контекст ранее определенных структур Z-РНК.

Рисунок 6.

( A ) Измеренная эффективность FRET между tC O и tC nitro для GC-повтора в Z-форме (зеленые кружки), вместе с прогнозируемыми значениями FRET ранее описанных структур Z-формы. : Записи PDB 1T4X (синие треугольники, структура ЯМР Z-формы РНК в 6 M NaClO 4 ), 2GXB (оранжевые ромбы, кристаллическая структура Z-формы РНК, связанная с ADAR1) и 1QBJ (красные квадраты, кристаллическая структура Z -форма ДНК, связанная с ADAR1) (31–33).( B ) Измерена эффективность FRET между tC O и tC nitro для GC-повтора в A-форме (черные квадраты) и Z-форме (зеленые кружки). Стрелки указывают направление изменения при переходе с A- на Z-форму. Измерения проводили при комнатной температуре в фосфатном буфере, pH 7,4, 123 мМ Na + (A-форма) или с добавлением 8 M NaClO 4 (Z-форма) и представляют собой усредненные данные из измерений в стационарном состоянии и в течение срока службы.

Рисунок 6.

( A ) Измеренная эффективность FRET между tC O и tC nitro для GC-повтора в Z-форме (зеленые кружки) вместе с прогнозируемыми значениями FRET ранее сообщенной Z-формы структуры: записи PDB 1T4X (синие треугольники, структура ЯМР Z-формы РНК в 6 M NaClO 4 ), 2GXB (оранжевые ромбы, кристаллическая структура Z-формы РНК, связанная с ADAR1) и 1QBJ (красные квадраты, кристаллическая структура Z-форма ДНК, связанная с ADAR1) (31–33).( B ) Измерена эффективность FRET между tC O и tC nitro для GC-повтора в A-форме (черные квадраты) и Z-форме (зеленые кружки). Стрелки указывают направление изменения при переходе с A- на Z-форму. Измерения проводили при комнатной температуре в фосфатном буфере, pH 7,4, 123 мМ Na + (A-форма) или с добавлением 8 M NaClO 4 (Z-форма) и представляют собой усредненные данные из измерений в стационарном состоянии и в течение срока службы.

Последовательности с GC-повторами очень склонны к самодимеризации и образованию шпилек, и поэтому требуют другого и более тщательного дизайна последовательности по сравнению с нашим первоначальным эталонным исследованием (рис. 3A).Чтобы уменьшить помехи от образования шпильки, GC-повтор был как можно короче (14-мерный), при этом позволяя исследовать полный виток спирали, то есть донорно-акцепторное разделение до 10 п.н., без истирания концов. Кроме того, GC-повтор фланкирован одним базовым сайтом и восемью основаниями с каждой стороны. Восемь фланкирующих оснований были введены, чтобы удерживать концы вместе в А-форме на протяжении всего эксперимента и для повышения стабильности согласованного дуплекса в рамке считывания, тогда как базовые сайты служат гибким линкером, позволяющим формировать GC-повтор. Z-РНК, пока концы остаются в А-форме.

Для этого исследования использовали 8 M NaClO 4 для индукции Z-формы. Исследования CD показывают, что Z-форма стабильна при комнатной температуре в течение> 18 часов в этих условиях и что донор и акцептор не препятствуют ее образованию (дополнительный рисунок S3), что является дополнительным признаком того, что модифицированные основания РНК служат хорошими аналогами их естественные аналоги цитозина. Чтобы исследовать разницу между FRET в A- и Z-форме РНК, измерения с использованием времени жизни как стационарного излучения, так и флуоресценции были выполнены для обеих конформаций (Рисунок 6B, дополнительный рисунок S4 и дополнительные таблицы S5 и S6).Поскольку донор и акцептор в последовательностях GC находятся в одной и той же цепи для нечетных разделений и в противоположных цепях для четных разделений, паттерн FRET GC-повтора в A-форме отличается от эталонного исследования, в котором донор и акцептор являются в противоположных прядях для всех разделений (дополнительный рисунок S5). В данных Z-формы имеется несоответствие между эффективностями FRET в установившемся режиме и на основе срока службы для седьмого и девятого разделения (дополнительная таблица S7). Эти два разделения были измерены с использованием последовательностей, меченных одной и той же цепью, где образование шпильки может сблизить донор и акцептор в пространстве (0–2 п.н.).На таких коротких расстояниях тушение донора может иметь непосредственный контакт (например, перенос электронов по Декстеру) и, следовательно, происходить во временном масштабе, который невозможно разрешить при использовании нашей настройки времени жизни флуоресценции. При таких обстоятельствах только время жизни правильно свернутой фракции образца, то есть дуплексов Z-формы РНК, будет видно в затухании флуоресценции, в то время как стационарное излучение будет дополнительно подавляться и, следовательно, приведет к кажущемуся более высокому FRET. ценить. Поскольку наши результаты показывают разницу между установившимся режимом FRET и FRET на протяжении всей жизни на седьмом и девятом разделении и, следовательно, указывают на частичное образование «темных частиц» (например,грамм. шпильки) в этих образцах, для этих точек данных в последующей оценке использовались только значения эффективности FRET на основе срока службы (рисунок 6).

Во-первых, мы исследовали, можно ли использовать FRET между основаниями РНК для исследования перехода РНК от A- к Z. Разница в паттерне FRET между A- и Z-формами РНК поразительна, с изменением эффективности переноса на 25% -87% для семи из восьми исследованных разделений (рис. 6B), что указывает на то, что система достаточно чувствительна для изучения изменений между РНК в A- и Z-форме путем отслеживания изменения FRET только при одном или нескольких разделениях.Квантовый выход tC O по существу одинаков в обеих конформациях (дополнительная таблица S8), что убедительно свидетельствует о том, что наблюдаемые изменения в эффективности переноса обусловлены структурными изменениями в РНК, а не вариациями в микроокружении зонда. Взятые вместе, это показывает, что межосновная РНК FRET между tC O и tC nitro , разделенными 4–10 п.н., может с высокой чувствительностью исследовать структурные изменения A- в Z-РНК, что дополнительно иллюстрирует общую адаптивность этого метода для исследование структурных изменений нуклеиновых кислот.Существенные различия в продолжительности жизни флуоресценции между соответствующими дуплексами РНК в A- и Z-форме указывают на возможные применения микроскопии для визуализации времени жизни флуоресценции (FLIM), в которой РНК конкретно в Z-форме может контролироваться с помощью микроскопии живых клеток.

Во-вторых, мы сравнили наши данные FRET с теоретически полученным паттерном FRET из нескольких существующих структур PDB. Паттерн FRET, который мы получили для Z-формы РНК, хорошо согласуется с паттернами ранее описанных структур на коротких и длинных расстояниях (рис. 6А).Однако на промежуточных расстояниях (6–8 п.н.) наблюдаемая эффективность FRET значительно ниже, чем значения, рассчитанные на основе опубликованных средних параметров 6-мерных структур PDB. Одним из объяснений этих расхождений может быть то, что структура Z-РНК отличается для ранее описанной короткой и по своей природе менее стабильной 6-членной РНК по сравнению с нашей 14-мерной системой, где концы удерживаются на месте фланкирующими основаниями РНК A-формы. Структуры 6-мерной Z-РНК, определенные с помощью методов ЯМР или рентгеновского излучения, также могут немного отличаться от структуры в растворе при более физиологически значимых концентрациях РНК.Учитывая очень мало отчетов, содержащих структурную информацию для Z-формы РНК, слишком рано давать подробные комментарии о структурной однородности этой дуплексной формы РНК. Это потребует большего количества сравнительных исследований, посвященных таким аспектам, как длина олигорибонуклеотида и тип связывающего белка.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Мы показали, что пара tC O –tC nitro FRET хорошо подходит для мониторинга межосновного FRET в дуплексах РНК.Зонды прочно расположены внутри РНК, и паттерн FRET точно соответствует предсказанным значениям для A-РНК. Мы наблюдаем большое изменение эффективности FRET, поскольку Z-РНК образуется из А-формы с использованием высокой концентрации NaClO 4 , что показывает, что, как и в ДНК, межосновное FRET РНК может использоваться для исследования структурных изменений в физиологических условиях. с высокой чувствительностью, а также универсальностью в отношении шага tC O –tC nitro . При сравнении нашего измеренного паттерна FRET с несколькими существующими структурами PDB Z-формы РНК, мы обнаруживаем общие сходства, но также и существенные различия.Сходные по величине различия также могут быть обнаружены между структурами PDB, подразумевая, что необходимо исследовать больше структур Z-РНК, чтобы определить, имеет ли РНК Z-формы одну однородную структуру с уникальным набором параметров для извлечения. Учитывая более высокое структурное разнообразие и динамику РНК и комплексов РНК-белок по сравнению с ДНК, это представляет собой значительный шаг вперед не только для межосновного FRET как общей методологии нуклеиновых кислот, но, что важно, для быстрорастущей области структуры и динамики РНК. исследования в частности и исследования РНК в целом.В отличие от большинства методов исследования структуры и динамики, межбазовый FRET может выполняться в физиологических условиях. Следовательно, мы предполагаем, что основная полезность этого метода заключается в мониторинге структурных изменений РНК в системах живых клеток, либо отдельно, либо в гибридных подходах вместе с рентгеновскими лучами или ЯМР, для выявления ценной новой информации об основных молекулах жизни, РНК. .

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ДАННЫЕ

Дополнительные данные доступны в NAR Online.

БЛАГОДАРНОСТИ

Мы благодарим Афаф Х. Эль-Сагира и профессора Тома Брауна (Оксфордский университет, Великобритания) за обучение A.F.F. и М. в очистке РНК.

ФИНАНСИРОВАНИЕ

Шведский фонд стратегических исследований [SSF, IS14-0041, IRC15-0065 до L.M.W., ID14-0036 до M.G.]; Шведский исследовательский совет [VR, 2017-03707 к L.M.W.]. Финансирование платы за открытый доступ: Шведский исследовательский совет [VR, 2017-03707].

Заявление о конфликте интересов .Ничего не объявлено.

ССЫЛКИ

1.

Dethoff

E.A.

,

Chugh

J.

,

Mustoe

A.M.

,

Аль-Хашими

Х.М.

Функциональная сложность и регуляция через динамику РНК

.

Природа

.

2012

;

482

:

322

330

.2.

Harpur

A.G.

,

Wouters

F.S.

,

Bastiaens

P.I.H.

Визуализация FRET между спектрально подобными молекулами GFP в отдельных ячейках

.

Nat. Biotechnol.

2001

;

19

:

167

169

.3.

Hillger

F.

,

Hanni

D.

,

Nettels

D.

,

Geister

S.

,

Grandin

M.

,

Textor

M. Шулер

Б.

Исследование взаимодействий белок-шаперон с помощью флуоресцентной спектроскопии одиночных молекул

.

Angew. Chem. Int. Эд.

2008

;

47

:

6184

6188

.4.

Губаев

A.

,

Klostermeier

D.

Klostermeier

D.

,

Hammann

C.

Структура и складывание РНК: биофизические методы

.

2013

;

Берлин

Де Грюйтер

181

214

.5.

Peulen

T.O.

,

Опанасюк

О.

,

Зайдель

C.A.M.

Сочетание графических и аналитических методов с молекулярным моделированием для точного анализа измерений FRET меченых макромолекул с временным разрешением

.

J. Phys. Chem. В

.

2017

;

121

:

8211

8241

.6.

McPhee

S.A.

,

Huang

L.

,

Lilley

D.M.

Критическая пара оснований в k витках, которая придает характеристики сворачивания и коррелирует с биологической функцией

.

Nat. Commun.

2014

;

5

:

5127

.7.

Dumat

B.

,

Larsen

A.F.

,

Wilhelmsson

L.M.

Изучение переходов Z-ДНК и B- в Z-ДНК с использованием аналога цитозина FRET-пары

.

Nucleic Acids Res.

2016

;

44

:

e101

.8.

Wranne

M.S.

,

Füchtbauer

AF

,

Dumat

B.

,

Bood

M.

,

El-Sagheer

AH

,

Brown

T.

,

, H.

Grøtli

M.

,

Wilhelmsson

LM

На пути к полной гибкости последовательности аналога основания нуклеиновой кислоты FRET

.

J. Am. Chem. Soc.

2017

;

139

:

9271

9280

.9.

Füchtbauer

A.F.

,

Preus

S.

,

Börjesson

K.

,

McPhee

S.A.

,

Lilley

J

D.M.

,

Wilhelmsson

L.M.

Флуоресцентный аналог цитозина РНК — внутренний зонд для детальных исследований структуры и динамики

.

Sci. Отчет

2017

;

7

:

2393

.10.

Shin

D.

,

Sinkeldam

R.W.

,

Tor

Y.

Эмиссионный алфавит РНК

.

J. Am. Chem. Soc.

2011

;

133

:

14912

14915

.11.

Ровира

A.R.

,

Fin

A.

,

Tor

Y.

Химический мутагенез алфавита эмиссионной РНК

.

J. Am. Chem. Soc.

2015

;

137

:

14602

14605

.12.

Xie

Y.

,

Dix

A.V.

,

Tor

Y.

FRET позволяет в реальном времени обнаруживать связывание малых молекул РНК

.

J. Am. Chem. Soc.

2009

;

131

:

17605

17614

. 13.

Tanpure

A.A.

,

Srivatsan

S.G.

Конформационно-чувствительные аналоги нуклеозидов в качестве зондов включения флуоресценции, специфичных для топологии, для G-квадруплексов ДНК и РНК

.

Nucleic Acids Res.

2015

;

43

:

e149

.14.

Эрнандес

A.R.

,

Kool

E.T.

Компоненты xRNA: Синтез и флуоресценция полного генетического набора расширенных по размеру рибонуклеозидов

.

Org. Lett.

2011

;

13

:

676

679

. 15.

Börjesson

K.

,

Preus

S.

,

El-Sagheer

A.H.

,

Brown

T.

,

Albinsson

B.

,

Wilhelmsson

L.M.

Аналог основания нуклеиновой кислоты FRET-Pair, облегчающий подробные структурные измерения в системах, содержащих нуклеиновые кислоты

.

J. Am. Chem. Soc.

2009

;

131

:

4288

4293

. 16.

Bood

M.

,

Füchtbauer

A.F.

,

Wranne

M.S.

,

Ro

J.J.

,

Sarangamath

S.

,

El-Sagheer

A.H.

,

Rupért

D.L.M.

,

Фишер

Р.С.

,

Магеннис

S.W.

,

Джонс

A.C.

et al. .

Пентациклический аденин: универсальный и исключительно яркий флуоресцентный аналог основания ДНК

.

Chem. Sci.

2018

;

9

:

3494

3502

.17.

Хан

J.H.

,

Yamamoto

S.

,

Park

S.

,

Sugiyama

H.

Разработка системы Vivid FRET на основе высокоэмиссионной аналоговой пары dG-dC

.

Chem. Евро. J.

2017

;

23

:

7607

7613

. 18.

Миллер

M.L.

,

Доран

M.

Концентрированные солевые растворы.II. Вязкость и плотность тиоцианата натрия, перхлората натрия и йодида натрия

.

J. Phys. Chem.

1956

;

60

:

186

189

. 19.

Preus

S.

,

Kilså

K.

,

Miannay

FA

,

Albinsson

B.

,

Wilhelmsson

LM

метод моделирования и общего анализа FR FRET в нуклеиновых кислотах

.

Nucleic Acids Res.

2013

;

41

:

e18

.20.

Лю

X.J.

,

Олсон

W.K.

3DNA: программный пакет для анализа, восстановления и визуализации трехмерных структур нуклеиновых кислот

.

Nucleic Acids Res.

2003

;

31

:

5108

5121

. 21.

Олсон

W.K.

,

Бансал

М.

,

Берли

S.K.

,

Дикерсон

R.E.

,

Gerstein

M.

,

Harvey

S.C.

,

Heinemann

U.

,

Lu

X.J.

,

Neidle

S.

,

Shakked

Z.

et al. .

Стандартная система координат для описания геометрии пары оснований нуклеиновых кислот

.

J. Mol. Биол.

2001

;

313

:

229

237

.22.

Sandin

P.

,

Börjesson

K.

,

Li

H.

,

Mårtensson

J.

,

Brown

T.

,

Wilhelm2

Albinsson

B.

Характеристика и использование беспрецедентно яркого и структурно не возмущающего аналога флуоресцентного основания ДНК

.

Nucleic Acids Res.

2008

;

36

:

157

167

.23.

Preus

S.

,

Börjesson

K.

,

Kilså

K.

,

Albinsson

B.

,

Wilhelmsson 9 acceptase

FR LM

. нитро

.

J. Phys. Chem. Б.

2010

;

114

:

1050

1056

. 24.

Чжэн

G.H.

,

Лю

X.J.

,

Olson

W.K.

Web 3DNA — веб-сервер для анализа, реконструкции и визуализации трехмерных структур нуклеиновых кислот

.

Nucleic Acids Res.

2009

;

37

:

W240

W246

. 25.

Серебряный

В.

,

Бейгельман

Л.

Эффективный препарат защищенных рибонуклеозидов для синтеза фосфорамидитной РНК

.

Tetrahedron Lett.

2002

;

43

:

1983

1985

0,26.

Sinha

ND

,

Biernat

J.

,

McManus

J.

,

Köster

H.

Полимерная подложка, олигонуклеотидный синтез, синтез β-н-этила 900, N-900, N-900, бета-этилена, 900-C, 900-C, 900 -C32, 900-C , N -Диалкиламино- / N -Морфолинофосфорамидит дезоксинуклеозидов для синтеза фрагментов ДНК, упрощающих снятие защиты и выделение конечного продукта

.

Nucleic Acids Res.

1984

;

12

:

4539

4557

. 27.

Xu

Y.

,

Ishizuka

T.

,

Kimura

T.

,

Komiyama

M.

U-Tetrad стабилизирует структуру теломерной РНК человека 9000 G-3.

J. Am. Chem. Soc.

2010

;

132

:

7231

7233

. 28.

Ван

А.H.J.

,

Quigley

G.J.

,

Колпак

F.J.

,

Crawford

J.L.

,

Vanboom

J.H.

,

Vandermarel

G.

,

Rich

A.

Молекулярная структура левостороннего двухспирального фрагмента ДНК при атомном разрешении

.

Природа

.

1979

;

282

:

680

686

,29.

Холл

К.

,

Cruz

P.

,

Tinoco

I.

,

Jovin

T.M.

,

Vandesande

J.H.

Z-РНК — двойная спираль левой РНК

.

Природа

.

1984

;

311

:

584

586

. 30.

Зарлинг

Д.А.

,

Calhoun

C.J.

,

Feuerstein

B.G.

,

Сена

E.P.

Цитоплазматическая микроинъекция иммуноглобулина Gs, распознающего спирали РНК, подавляет рост клеток человека

.

J. Mol. Биол.

1990

;

211

:

147

160

. 31.

Placido

D.

,

Коричневый

B.A.

,

Lowenhaupt

K.

,

Rich

A.

,

Athanasiadis

A.

Левая двойная спираль РНК, связанная Z-альфа-доменом редактирующего РНК фермента ADAR1

.

Структура

.

2007

;

15

:

395

404

.32.

Popenda

M.

,

Milecki

J.

,

Adamiak

R.W.

Структура высокосолевого раствора двойной спирали левой РНК

.

Nucleic Acids Res.

2004

;

32

:

4044

4054

.33.

Schwartz

T.

,

Rould

M.A.

,

Lowenhaupt

K.

,

Herbert

A.

,

Rich

A.

Кристаллическая структура Z-альфа-домена редактирующего фермента человека ADAR1, связанного с левой Z-ДНК

.

Наука

.

1999

;

284

:

1841

1845

.

Заметки автора

© Автор (ы) 2019. Опубликовано Oxford University Press от имени Nucleic Acids Research.

Eduard Kit No. 2130 — Обзор Kunkadlo от Джона Миллера

Kunkadlo

Эдуард, масштаб 1/72

S г м а р у:

Описание и номер позиции:

Комплект Эдуарда № 2130 — Кункадло

Содержание и носители:

22 детали из серого стирола (используются не все), одна пластина из полиэтилена, ветровое стекло из прозрачного ацетата и один лист декалей с маркировкой для одного планера.

Цена:

14,95 долларов США плюс доставка в интернет-магазине Эдуарда

GBP 8,60 £ Цена в ЕС (7,17 £ экспортная цена) плюс доставка в Hannants

Масштаб:

1/72

Тип обзора:

Первый взгляд

Преимущества:

Небольшое количество деталей и простая, продуманная конструкция позволяют быстро и легко собрать.

Недостатки:

Рекомендация:

Это удивительно простая маленькая модель, в которой собрано множество деталей. Время, потраченное на детальный 2-цилиндровый двигатель и колеса со спицами, окупится очень убедительной сборкой.

Отзыв от Джона Миллера

Богуслав и Владимир Симунек начали строительство Кункадло в 1924 году, когда они были студентами Пражского университета.Самолет был построен в 1926 году и впервые пилотировал майор Скала, который позже станет известен как участник новаторского полета из Праги в Токио. После первого полета крыло Кукадло было приподнято над фюзеляжем и немного сдвинуто назад.

Владимир Симунек пилотировал Kunkadlo на нескольких авиашоу до 1930 года, когда самолет был заземлен из-за проблем с клееной конструкцией. Самолет был восстановлен в 1967 году под руководством братьев Симунек в качестве советников.После реставрации самолет был повешен в Техническом музее Праги, где он выставляется до сих пор.

(Отредактировано из инструкций по набору и Wikipedia Commons )

На одном светло-сером литнике 22 четко отформованных детали с практически отсутствием заусенцев, чего мы и ожидаем от этого производителя.

После того, как кабина из 5 частей (не считая ремней безопасности сиденья) собрана и зажата между половинами фюзеляжа, строителю дается указание собрать 2-цилиндровый двигатель.Отдельно отлитые головки цилиндров вместе с внешними толкателями с фототравлением и выводами свечей зажигания действительно сделают этот маленький двигатель центром конструкции.

Цельное крыло имеет хорошо проработанные ребра жесткости, которые отлично смотрятся под краской и наклейками. Продуманные стойки крыла одновременно входят в прорези в нижней части фюзеляжа и в нижней части крыла. Такая конструкция должна упростить установку крыла от зонта.

Детали фототравления включают поперечные распорки между стойками основных шасси и между фюзеляжем и крылом.Кабели управления и рупоры лифта также выполнены из полиэтилена.

Панели эскизов:

Очень приятным штрихом являются фототравленные колеса со спицами, которые в собранном виде будут выглядеть очень убедительно.


Маркировки:

Декали Эдуарда напечатаны четко, с хорошей цветовой плотностью и совмещением.

Маркировка нанесена на красочную схему серебристого цвета и синего цвета, которую носит самолет.

Это удивительно простая маленькая модель, в которой собрано множество деталей. Время, потраченное на детальный 2-цилиндровый двигатель и колеса со спицами, окупится очень убедительной сборкой.

Настоятельно рекомендуется.

Для получения дополнительной информации об этом обзоре посетите Modelpaintsolutions.com .

Обзорный комплект, снова предоставленный моим пенсионным фондом.


Обзор текста и изображений Авторские права 2020 г., Джон Миллер

Страница создана 29 мая 2020 г.
Последнее обновление 19 июля, 2020

Вернуться на главную страницу HyperScale

Вернуться на страницу отзывов

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности.Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


Настройка вашего браузера на прием файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

  • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить, хотите ли вы принимать файлы cookie.
  • Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, используйте кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
  • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
  • Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
  • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

Fernandez Music_Classical, фламенко, португальские и латиноамериканские гитары

Fernandez Music_Classical, фламенко, португальские и латиноамериканские гитары

Fernandez Music,

P.O. Box 2130, Anacortes, Washington Телефон: 949-856-1537, электронная почта: [email protected] (пересмотрено 1 декабря 2020 г.). Учредил 1985.

Классика и Фламенко-гитары, португальские гитары, гавайские гитары, латиноамериканские Ладные инструменты. Рон Фернандес настраивает каждый инструмент так, чтобы профессиональные стандарты. Эксперт по французской полировке.

В декабре 2015 года мы переехали из Ирвина, Калифорния, и сейчас проживает в Анакортесе (население 18 000 человек) в штате Вашингтон. Анакортесу 90 лет милях к северу от Сиэтла, в 90 милях к югу от Ванкувера, Британская Колумбия, и 2 часа на пароме от Анакортеса до Виктории на острове Ванкувер.Анакортес находится на острове Фидальго, который соединен мостом длиной 1/4 мили. на материк.


ОБЪЯВЛЕНИЕ: Последние несколько лет я устраиваюсь на почти «пенсию». у меня есть не сбавил обороты, скорее я частично сменил направление. у меня есть перестал раздавать дилерам. Однако я продолжаю заниматься небольшим количество хороших инструментов, которые я импортировал, отремонтировал или отполировал по-французски. Рон Фернандес



Рон Фернандес выравнивает лады.

Нажмите здесь, чтобы прочитать и посмотреть ВИДЕО о моей индивидуальной настройке.

Фернандес Музыка была создана в 1985 году, но мой опыт работы с испанскими мастерами восходит к 1965 году, когда мы с отцом начали заниматься гитаристов с его родины. С 1990-х я импортировал более 13 000 гитар, и я лично настроил последние 8 000 из них. Видеть Рональд Луи Фернандес ИГРАЙТЕ НА ФЛАМЕНКО И ПОРТУГАЛЬСКИХ ГИТАРАХ в местной телепрограмме Let It Shine!

СОДЕРЖАНИЕ

Испанская классическая гитара и гитара фламенко

Португальские гитары и фаду

Латинские гитары и уке

Инструмент с латинским ладом s

Принадлежности

DVD Рона Fernndez

Esteve Guitars

Esteve Deluxe / Мануэль Адалид Модели

Хуан Эрнандес Гитары

Vicente Sanchis Guitars

р.Фернандес Модели в разрезе, узкие шеи, с усилителем Фишмана


Гитара Octave и детская гитара 40 см


СТАРЫЕ ИЛИ РЕДКИЕ ГИТАРЫ

Великие фламенко и классические композиции — Продажа

Мигель Родригес Фламенкос

Феликс Мансанеро Классика и фламенко

Португальские гитары (guitarras portuguesas) — на продажу

Португальские гитары высшего качества — для продажи

Строка Заводные барабаны и струнные для португальской гитарыras

Игра на португальской гитарре (лиссабонский стиль) Рона Фернандеса (бесплатный урок в Интернете) — со встроенными видео

СМОТРЕТЬ ВИДЕО об исполнении фаду менор на португальской гитаре (урок 2)

СМОТРЕТЬ ВИДЕО об игре Фаду Майор на португальской гитаре (урок 3)

СМОТРЕТЬ ВИДЕО о создании унхас (пальцев) для португальской гитары: ЧАСТЬ 1

СМОТРЕТЬ ВИДЕО о создании унхас (пальцевых) для португальской гитары: ЧАСТЬ 2


Два сборника песен Амалии Родригес из фадос.Продано

4 сборника песен фаду из Мелодиас де Семпер. Продано

Fado Portugues, песенник Дональда Коэна В НАЛИЧИИ — музыка и слова для 26 великих фадо с CD

Луис Пенедо Компакт-диски — один с исполнителями фаду и один с португальской гитарой. инструментальные. Продано

Португальских гитарных тетрадей для фаду в стиле Лиссабона Эурико Себоло Книги 1. 2, 3. 4 и 5. Также, «Звуки Лиссабона», соло в расшифровке Марсио Сильва.ПРОДАНО


Португальский Коллекция Guitarra. Джу Мигель Андраде Гитара

португальский Guitarra Жоакима Педро дос Рейса 1764

Bandurrias — из Испании

Чаранго из Боливии

Книги по настройке, струнным и методам чаранго

Кавакиньос

Лауда из Испании

Requintos

Tres Cubanos Продажа

трес Книга по кубанским методам и компакт-диск $ 16.95 + доставка

Укулеле Kiwaya на продажу

Cejillas (Spanish Flamenco Capos) — нет в наличии

Фламенко Книги по методам игры на гитаре — метод Костера и Чака Кейера Couirse

Фламенко Тарелки

Гитарные тюнеры Fustero Gold для испанских гитар

Гитарные тюнеры (головки) для классической гитары и гитары фламенко

Гитара Чехлы (Zambra Guitar Cozy)

Гитара Кейсы

Марийские струны: классика, фламенко, басовые наборы, реквинто, детские, чаранго, tres cubano

Мексиканский нож гитарного мастера!

Изготовление классической гитары и гитары фламенко с расширенной версией DVD Бенито Хуэйпе

французский Полировка для гитаристов 2.0

Скрипичный смычок Повторная встреча с Роджером Фостером

ЕСТЬ БОЛЬШЕ НИЖЕ, ЧТОБЫ СКАНИРОВАТЬ.


Если вы хотите связаться со мной по электронной почте, нажмите на мой адрес: [email protected]


Датчики

| Бесплатный полнотекстовый | Визуализация отдельных клеток Ca2 + биосенсора на основе FRET с помощью высокочастотного ультразвука

1.Введение

Кальций — важная сигнальная молекула, играющая важную роль в функции нейронов [1,2], определяющая развитие клеток [3,4,5], контролирующая синаптическую пластичность [6] и регулирующая прогрессирование опухоли [7]. Следовательно, внутриклеточная концентрация Ca 2+ строго регулируется, и точные измерения пространственно-временной динамики Ca 2+ могут выявить важные биохимические активности. Многочисленные индикаторы Ca 2+ были разработаны многими исследовательскими группами.Синтетические флуоресцентные хелаторы использовали для измерения внутриклеточной концентрации Ca 2+ [8,9,10]. Хелаторы легко визуализировать, но они не нацелены на определенные органеллы и менее яркие. Для решения этой проблемы был разработан биосенсор (BS) Ca 2+ на основе генетически кодируемого флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET) с использованием донорных и акцепторных флуоресцентных белков, кальмодулина (CaM) и CaM-связывающего пептида M13 [11]. Как показано на рисунке 1A, четыре Ca 2+ связываются с CaM, что вызывает конформационные изменения в компактную форму.Относительное расстояние и ориентация двух флуорофоров уменьшаются, что приводит к увеличению FRET. FRET BS произвел революцию во многих областях, включая передачу сигналов Ca 2+ , активацию каспаз и оптогенетику in vivo [12,13]. С тех пор визуализация живых клеток FRET Ca 2+ продвинулась вперед [14]. Генетически кодируемые внутриклеточные индикаторы Ca 2+ , основанные на одном флуоресцентном белке (FP), также широко используются, такие как GCaMP [15]. Были достигнуты дальнейшие успехи в разработке индикаторов на основе отдельных флуоресцентных белков.Например, GCaMP6 обладает повышенной чувствительностью и быстрой кинетикой [16], а RCaMP [17] и R-GECO1 [18] совместимы с другими репортерными конструкциями с сигналом GFP. Биосенсоры на основе FRET произвели революцию в области визуализации живых клеток. В качестве неинвазивной спектроскопической техники BS на основе FRET может динамически отслеживать конформационные изменения между донорными и акцепторными флуорофорами, что позволяет визуализировать сигнальные события в живых клетках с высоким пространственно-временным разрешением. Визуализация живых клеток на основе FRET имеет преимущества перед индикаторами на основе отдельных флуоресцентных белков, поскольку изменения FRET представляют собой отношение интенсивности FRET (акцептора) к интенсивности донора.Клетки с BS на основе FRET экспрессируют сильный сигнал флуоресценции на длине волны донорского флуорофора. BS на основе FRET имеет высокое отношение сигнал / шум и подходит для экспериментов с длительными сеансами визуализации, поскольку логометрическая природа визуализации живых клеток на основе FRET снижает влияние изменений формы клеток и флуктуаций возбуждающего света [14, 19]. В частности, активно ведется разработка Ca 2+ BS на основе FRET из-за важности Ca 2+ , как уже описано.Yellow Cameleon версии 3.60 (YC3.60) превосходит другие версии Ca 2+ BS на основе FRET [20]. Включая YC3.60, усиленные голубые и желтые флуоресцентные белки (ECFP / YFP) были наиболее распространенными и чувствительными парами донорных и акцепторных флуорофоров для многих BS на основе FRET [11,19,21,22]. По этой причине возникли трудности с мониторингом внутриклеточной концентрации Ca 2+ при визуализации других молекулярных событий, таких как Src и Fyn, с использованием двойной визуализации живых клеток FRET.Чтобы решить эту проблему, мы разработали новую BS Ca 2+ на основе FRET с парой EGFP и FusionRed [23] (FRET-GFPRed), чтобы реализовать двойную визуализацию живых клеток FRET для одновременного мониторинга Ca 2+ и другие молекулярные события, такие как Src с высоким временным разрешением. В настоящее время химическая стимуляция широко используется для индукции молекулярных событий, которые могут быть обнаружены FRET BS. Однако химическая стимуляция влияет на целые популяции клеток в чашке, и очень трудно вызвать внутриклеточную стимуляцию и вызвать повторные стимуляции одной и той же клетки.Раньше для приложения механической силы использовались оптические пинцеты для передачи силы захвата в клетку или субклеточные участки путем соединения бусинки и поверхности клетки [19,24,25]. Однако устройство для изготовления оптического пинцета очень громоздко и дорого. Бусины — еще одна сложность этого метода. Чтобы решить эти проблемы, мы разработали высокочастотный ультразвук (HFU) 150 МГц для прямого воздействия на отдельные клетки-мишени без шариков или микропузырьков. Электроника для управления HFU намного дешевле компонентов лазерной оптики.Нацеливание на отдельные клетки и манипуляции с ними могут быть реализованы с помощью HFU благодаря его способности фокусировки. Когда частота HFU превышает 150 МГц, размер фокальной области приближается к размеру субклеточной области менее 10 мкм [26,27]. HFU можно использовать для имитации физиологических сигналов, запускающих изменения в экспрессии генов и поведении клеток. Например, HFU может служить для создания микропотоков вокруг клеток, для растяжения липидного бислоя клетки и для прямого проталкивания клеточных мембран в течение длительного времени, не вступая в контакт с клетками.Различные типы клеток испытывают разные механические стимулы. Эритроциты, эндотелиальные клетки и соматосенсорные нейроны испытывают различные типы сил во время кровообращения [28], напряжение сдвига, вызванное кровотоком [29], и тактильные стимулы [30], соответственно. Следовательно, HFU обеспечивает механические стимулы для активации высвобождения Ca 2+ из эндоплазматического ретикулума внутри клетки или введения Ca 2+ через ионные каналы механотрансдукции. Прямое разрушение плазматической мембраны клетки HFU может ввести Ca 2+ и ДНК или белок для внутриклеточной доставки [26,27].Поскольку разрушение плазматической мембраны клетки не происходит в реальной ситуации, мы будем и дальше совершенствовать нашу технику, чтобы напрямую стимулировать органеллы и вызывать открытие каналов через HFU без нарушения в будущем. В этом исследовании мы объединили двойную визуализацию живых клеток на основе FRET, стимуляцию на уровне отдельных клеток и внутриклеточную доставку FRET BS с использованием HFU. Мы продемонстрировали, что новый базирующийся на FRET Ca 2+ BS, который был разработан путем комбинирования EGFP и FusionRed (FRET-GFPRed), может предложить отчетливый и последовательный ответ FRET по сравнению с хорошо известным основанным на FRET Ca 2+ BS с ECFP / YPet (YC3.6 FRET Ca 2+ биосенсор [14], FRET-CFPYPet) в различных условиях. Мы также проверили точный пространственный контроль стимуляции отдельных клеток и доставку разработанного FRET BS с использованием HFU.

4. Обсуждение

Мы разработали биосенсор Ca 2+ на основе FRET с парой флуорофоров EGFP и FusionRed (FRET-GFPRed) для двойной FRET визуализации живых клеток. Мы выбрали FusionRed в качестве акцептора новой пары FRET, потому что это мономерный и менее токсичный красный флуоресцентный белок [23].Новый FRET-GFPRed имеет быструю кинетику отклика при введении Ca 2+ .

FRET-GFPRed показывает изменения FRET на 10–15%, а FRET-CFPYPet изменяется на 200–300% после импульсного HFU, поскольку пара CFP-YPet была наиболее эффективной парой FRET. Новшеством здесь являются спектрально различимые пары FRET под HFU для многомолекулярной визуализации живых клеток.

Спектральное просачивание биосенсоров FRET-GFPRed и FRET-CFPYPet существовало в некоторой степени, когда изменения FRET отображались с использованием настроек фильтра CY и GR (Рисунок 3A, B и дополнительные рисунки S3 и S4).Настройки фильтра GR и CY — это оптимизированные настройки фильтра для биосенсоров FRET-GFPRed и FRET-CFPYPet соответственно (рис. 3). Физически мы оптимизировали настройки фильтра для получения соответствующих флуоресцентных сигналов от доноров (EGFP для FRET-GFPRed и ECFP для FRET-CFPYPet) и акцепторов (FusionRed для FRET-GFPRed и YPet для FRET-CFPYPet). Поскольку есть некоторые спектральные перекрытия между двумя биосенсорами, которые являются основными причинами спектрального просвечивания, мы нашли способ использовать значение отношения донор / FRET для различения разных биосенсоров FRET.Отношение интенсивностей сигналов между FusionRed и EGFP представляет собой сигнал FRET FRET-GFPRed. Для биосенсора FRET-CFPYPet сигнал FRET представляет собой соотношение между YPet и ECFP. Как упоминалось ранее, поскольку относительная яркость EGFP в два раза ярче, чем у FusionRed, начальный сигнал FRET FRET-GFPRed незначителен по сравнению с единицей. Однако сигнал FRET FRET-CFPYPet близок к единице, потому что относительная яркость ECFP и YPet сопоставима. Затем изображения FRET FRET-GFPRed и FRET-CFPYPet можно дифференцировать с использованием различных масштабов коэффициента выбросов, как показано на рисунках 3C, D, 4 и 6.В поддержку этого аргумента, когда коэффициент излучения составляет от 0,06 до 0,1, FRET-GFPRed четко показывает изменения FRET ячейки, обозначенные зеленой стрелкой с красными линиями на рисунке 3C. Изображения с коэффициентом излучения от 0,2 до 8 ясно показывают увеличение FRET только от ячейки с FRET-CFPYPet, что обозначено синей стрелкой с желтыми линиями на рисунке 1F. Перед тем, как начать визуализацию живых клеток, клетки с двумя разными биосенсорами FRET также можно дифференцировать с помощью канала RFP (дополнительный рисунок S2).Таким образом, разработанный FRET-GFPRed может визуализировать внутриклеточные молекулярные сигналы с уникальными флуоресцентными спектрами, отличными от широко используемых биосенсоров FRET с флуорофором ECFP и YPet. Инструментом стимуляции может быть визуализация двух молекулярных событий во время репрограммирования стволовых клеток и исследование ионного канала механотрансдукции в будущем. Мы определили HFU как новый метод механической стимуляции отдельных клеток для добавления точного пространственного разрешения и повторного моделирования для продольного мониторинга отдельных клеток к визуализации живых клеток на основе FRET.Пары клеток для исследований межклеточного взаимодействия могут быть точно установлены, когда различные биосенсоры на основе FRET доставляются в желаемые клетки с использованием HFU. HFU стимулирует одну клетку, не затрагивая окружающие клетки, вызывая множественные сигнальные ответы на целевые клетки, одновременно контролируя соседние клетки. Таким образом, HFU можно использовать для исследований межклеточного взаимодействия на уровне отдельной клетки. Способность HFU нацеливаться на отдельные клетки также может быть использована для исследования распространения межклеточной кальциевой волны [36,37].Быстрый ответ, значительная порация мембраны и медленные активируемые растяжением ионные каналы были идентифицированы по вызванным ультразвуком колебаниям микропузырьков [38]. В этой статье мы исследовали отклик FRET на уровне отдельной ячейки с использованием HFU с центральной частотой 150 МГц. После усовершенствования техники и разработки сверхвысокочастотных преобразователей с центральной частотой более 500 МГц мы представляем себе, что можем манипулировать и стимулировать органеллы в клетке. Мы можем напрямую манипулировать эндоплазматическим реактором или ионными каналами механотрансдукции и визуализировать транспорт Ca 2+ с помощью биосенсора FRET, который решит важные физиологические и патологические проблемы.Будет все более востребован механизм управления с обратной связью для определения фокуса этих типов преобразователей сверхвысоких частот. Новый FRET-GFPRed также имеет ограничения. Во-первых, необходимо повысить эффективность FRET, что может быть достигнуто путем изменения порядка и расстояния флуорофоров. Во-вторых, нам необходимо клонировать эту пару флуорофоров в другие BS FRET, такие как Src и Fyn, для мультиплексной визуализации живых клеток FRET.

Новый биосенсор Ca 2+ на основе FRET с парой флуорофоров EGFP и FusionRed был разработан для различения сигналов FRET от типичных биосенсоров FRET на основе ECFP / YPet.Высокочастотный ультразвук был использован для внутриклеточной доставки биосенсоров FRET и стимуляции отдельных клеток с улучшенным пространственно-временным разрешением. В отличие от химической стимуляции, высокочастотная ультразвуковая стимуляция не требует этапов вымывания между стимуляциями. Здесь мы продемонстрировали, что различные типы биосенсоров FRET были доставлены в отдельные клетки-мишени с помощью высокочастотного ультразвука, а разработанный биосенсор FRET Ca 2+ показал временный и значительный сигнальный ответ Ca 2+ при высокочастотной ультразвуковой стимуляции.

Leave a Reply

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

2019 © Все права защищены.