2170 лада фото: GPVN.RU / Автомобили ВАЗ / Приора / ВАЗ 2170


0
Categories : Разное

Содержание

GPVN.RU / Автомобили ВАЗ / Приора / ВАЗ 2170

Фото ВАЗ 2170

Автомобиль Лада Приора (ВАЗ 2170), который пришел на смену «десятке», впервые был представлен на 6-м Российском международном автомобильном салоне «Автосалон-2003». Это седан класса «С», базовая модель нового семейства переднеприводных автомобилей, разработанных на платформе ВАЗ 2110. В «Приоре» около 350 оригинальных деталей и узлов, что позволяет говорить об этом автомобиле как о новой модели, сообщается в пресс-релизе.
Отчасти идеи, используемые в оформлении ВАЗ 2170, были обкатаны на модернизированных ВАЗ 2110Т и ВАЗ 2110М. Главное отличие рестайлингового автомобиля от стандартного заключается в измененной внешности, причем основной упор сделан на передней части, где появились новые фары от Шеви-Нивы. У автомобиля новый капот и передние крылья, которые получили расширенные арки с жесткой ребордой, чтобы шины не задевали за крыло. Облицовка радиатора разработана заново, окрашена в цвет кузова с накладными хромированными деталями. Задний бампер тоже новый.
Приора получила 1,6-литровый 16-клапанный двигатель увеличенной мощности. Кроме того, на машину может быть установлен двигатель 1,5 литров или 1,8 литров, мощностью 107 л.с.

Характеристика ВАЗ 2170

Автомобиль ВАЗ 2170
Кузов
Тип кузова седан
Число мест 5
Число дверей 4
Габариты
Длина, мм
4350
Ширина, мм 1680
Высота, мм 1420
Колесная база, мм 2492
Колея колес спереди, мм 1410
Колея колес сзади, мм 1380
Шины 185/65 R14; 175/65 R14; 185/60 R14
Снаряженная масса, кг 1088
Полная масса, кг 1578
Объем багажника, л 430
Объем топливного бака, л 43
Двигатель
Модель двигателя 1,6 л. 16-кл. (Евро-3)
Тип двигателя бензиновый, четырехтактный
Объем двигателя, см³ 1596
Мощность, л.с./об.мин 72/5600
Крутящий момент, Н·м/об.мин 145/4000
Наддув
Клапанов на цилиндр 4
Система питания распределенный впрыск с электронным управлением
Скорость
Максимальная скорость, км/ч 183
Топливо
Марка топлива неэтилированный бензин АИ-95
Расход, л/100 км 7,2
Привод
Тип привода передний
КПП
Механическая 5
Автоматическая

Ваз приора (lada 2170) фото, технические характеристики

Лада Приора: характеристики и описание

Лада Приора является отечественным автомобилем в хэтчбек-кузове. Данный тип кузова среди покупателей пользуется далеко не меньшим спросом, чем седаны. Лада Приора характеристики имеет практически такие же, как и её собрат седан. В чем же разница?

Лада Приора, технические характеристики которой отличаются от седана только типом кузова, имеет иную отделку салона. В хэтчбеке багажник больше, особенно если разложить сиденья, которые находятся сзади. Машины не отличаются по характеристикам и типу двигателей. Хэтчбек Приора комплектуется лишь одним двигателем в 1,6 литра (16-ти клапанным), он может выжать 98 лошадиных сил мощности. Данный показатель очень неплох для автомобиля, вес которого немного меньше чем 1,5 тонны.

Приора, технические характеристики которой находятся на достаточно высоком уровне, увидела свет в 2007 году. Этот автомобиль был создан на платформе «десятки», и от неё отличается не только приятным салоном и более современным дизайном, но и многими другими, не менее важными деталями. К примеру, кузов данного агрегата стал более жестким, а это улучшило и управляемость, и безопасность. Увеличился также список дополнительного оснащения. В нем появилась подушка, предназначенная для переднего пассажира, плюс тормозная антиблокировочная система (сокращенно ABS) и помощь, которая используется при экстренном торможении. Также нельзя не отметить в автомобиле Лада Приора характеристики центрального замка с дистанционным управлением, многофункциональные датчики света и дождя. Эта машина предлагается покупателям в нескольких комплектациях, и потому базовое оснащение различается (все зависит от уровня исполнения).

В Российской Федерации для модели заранее предусмотрены две силовые бензиновые установки, а также 81-сильный так называемый восьмиклапанник. Но на рынок в Украине автомобиль был выпущен только с шестнадцатиклапанным модернизированным агрегатом (его объем – 1,6 литра). Трансмиссия же ручная, рассчитана на пять передач. Если смотреть паспортные данные автомобиля Лада Приора, характеристики указывают, что указанный агрегат разгоняется до ста километров в час за одиннадцать с половиной секунд, а бензина на сто километров потребуется около десяти литров.

До того как на автомобильном рынке появился автомобиль Ларгус, Приора являлась одной из самых просторных машин среди разработок этой марки. Этот седан обладает четырехсоттридцатилитровым багажником, а также практичным клиренсом в 165 миллиметров.

Лада Приора характеристики имеет хорошие, и среди самых ярких плюсов можно выделить следующие: расход топлива весьма достойный, также машина надежная, доставляет своему обладателю сравнительно немного хлопот. Хорошая подвеска, на трассе очень комфортно входить в повороты. По скорости и разгону машина может конкурировать даже с иномарками! И к тому же стоит отметить дизайн – отлично отделана передняя панель, плюс центральная консоль прилично выглядит.

fb.ru

Комплектации Лады Приора ВАЗ 2170 и других модификаций

ВАЗ 2170 известен в таких комплектациях:

  • «Стандарт» – самая бюджетная комплектация. В ней отсутствуют: аудиомагнитола, динамики, кондиционер, подголовники заднего дивана, иммобилайзер, центральный замок, обогрев передних сидений, электропривод и обогрев наружных зеркал, противотуманные фары, дистанционное открывание замка багажника. Передние стеклоподъемники – электрические, задние – механические. Двигатель – 81 л.с., который с 2013 года уже не выпускается, и в настоящий момент заказы на такую комплектацию больше не поступают;
  • «Норма», которая оснащается 87-, а после рестайлинга – только 98 и 106-силовым двигателем. В наличии: аудиподготовка, бортовой компьютер, электрообогрев и электропривод наружных зеркал, иммобилайзер, противоугонная сигнализация и все элементы комплектации «стандарт» плюс кое-какое новое оборудование. Эта комплектация пользуется самым большим спросом из-за своей ценовой ниши. Когда автомобиль нужен «уже вчера», то приходится покупать то, на что хватает денег сейчас, а всем остальным дооборудовать машину уже в процессе.
  • «Норма ». По сути, это та же норма, на которую установлено одно или несколько наименований оборудования: кондиционер, аудиомагнитола с колонками, ABS BAS, крепления для детских сидений, обогрев передних сидений и лобового стекла;
  • «Люкс» – наиболее насыщенная функционалом. Имеет все то же, что и «норма », а кроме того: боковые подушки безопасности, подушку для переднего пассажира, задние и передние электроподъемники стекол, навигатор, мультимедийную систему, круиз-контроль, парктроник, противотуманные фары, датчик дождя, климатическую систему, литые диски, обогрев передних сидений;
  • «Спорт» – специальная комплектация увеличивающая «спортивную» составляющую. Это аэродинамический обвес кузова: выраженный бампер со спойлером, боковые пороги, диффузорный задний бампер, и антикрыло на крышке багажника. Отличаются и колесные диски с узкопрофильным покрышками. Уменьшены дорожный просвет, снаряженный (до 1080 кг) и максимальный (до 1500 кг) вес. Интерьер тоже преображен: добавлены боковые поддержки по краям сидений с красным шитым швом, вставки под карбон, кожаный руль. Кондиционер, магнитола, полный набор электрических стеклоподъемников прилагаются. Однако, выпуск спортивных Приор был ограничен и сегодня они сняты с производства, хотя их кое–где можно встретить на трассе, и чаще всего это Приора в кузове купе.

https://www.youtube.com/watch?v=ytdevru

Конечно же, это не полный, а лишь ориентировочный обзор комплектаций Лады Приоры, который в пределах одной статьи вряд ли возможно привести целиком. Кроме того, комплектация несколько отличается также от типа кузова. Например:

  • У Приор-универсалов имеются рейлинги на крыше, скобы на колесных арках багажника, за которые можно стропить груз;
  • Для кузова купе разработаны складные спинки и усиленный каркас передних сидений.

Как узнать какой мотор стоит на Приоре

Узнать модификацию ДВС Лада Приора можно по металлической табличке. На этой табличке выбит номер мотора, а также автовладелец может понять 16 клапанов у мотора или нет. Находится металлическая табличка на левом стакане стойки.

На каких двигателях приоры гнет клапана

Лишь на одном двигателе Лада Приора не гнет клапана срыв цепи ГРМ. Это ВАЗ 21114. На всех остальных загибает клапана после срыва. Даже мелкая трещинка, пропущенная автовладельцем при осмотре, может стать началом пути к капитальному ремонту. А может даже к полной замене двигателя на Лада Приора.

Этому есть одно объяснение. Производитель стремится облегчить мотор. Увеличить экономию траты топлива. Увеличение мощности с уменьшением веса приводит к тому, что нарушается надежность и безотказность ГРМ.

Мало того, не только срыв может погнуть клапана на движке ВАЗ21126. Даже просто перескакивание цепи с одного зуба на три приводит к загибанию всех впускных клапанов.

Увидеть, как происходит загибание клапанов в действии можно на вот этом видео.

На каких двигателях не гнет клапана при обрыве ремня ГРМ

Единственный движок внутреннего сгорания, на котором не гнет клапана – это 21114. На всех остальных двигателях 126 или 127 (127 – это усовершенствованный 126), а также на некоторых других, которые устанавливаются на Лада Приора, гнет клапана, после срыва цепи ГРМ автомобиля.

Похожая статья Где на 16 и 8 клапанной Приоре находится номер двигателя

Безопасность

В комплектации «Люкс» автомобиль оснащается подушкой безопасности водителя и пассажира. Кузов автомобиля усилен с целью повышения пассивной безопасности. Также возросла жесткость кузова на кручение, особенно во второй фазе кузова (начиная со второй половины 2008 года). С мая 2008 года автомобиль «Лада-Приора» выпускается в комплектации «Люкс», которая включает подушку безопасности переднего пассажира, преднатяжители передних ремней безопасности, АБС и систему безопасной парковки автомобиля.

В результате краш-теста, проведенного «Авторевю» по методике ARCAP, «Приора Фаза 1», выпускавшаяся до середины 2008 года, получила 5,7 баллов из 16 возможных за фронтальный удар и 9 за боковой, то есть может претендовать максимум на две звезды («Люкс» — на три), что по уровню сравнимо лишь с немногочисленными устаревшими моделями американского и корейского происхождения. В первой половине 2008 года, с целью повышения безопасности, была завершена модернизация кузова для всех модификаций автомобиля, которая получила название «Фаза 2». Краш-тест над «Приора Фаза 2», на данный момент проводился только специалистами АвтоВАЗа, с приглашением различных журналистов. По результатам этого краш-теста автомобиль набрал 10.56 баллов из 16 возможных за фронтальный удар, 13 баллов за боковой удар. Чтобы получить общую оценку в 4 звезды автомобилю нужно набрать в общей сумме 24 балла, Lada Priora набрала 23,56. Европейское агентство по безопасности в таких случаях пользуется обычным методом арифметического округления, то есть в итоге уровень пассивной безопасности Lada Priora соответствует 4 звёздам.

Тюнинг

Хотя внешность «Лады» уже давно не выглядит откровенно старой, да и внутри после очередного обновления повысился уровень комфорта, многие владельцы машин стремятся выделить свой автомобиль из толпы. Другие же хотят повысить динамические показатели российского авто.

Тюнинг мотора

Невзирая на то, что машина имеет 16-клапанные двигателя, которые намного динамичнее и мощнее прошлых версий, все-таки хочется сделать свое транспортное средство более быстрым. На выручку приходит компрессор-суперчарджер, увеличивающий мощность и тягу «движка» на 30-50 процентов. Установку можно произвести с помощью крепежных узлов, закрепленным на шкив коленвала. Мощность увеличивается из-за обогощения топливно-воздушной смеси.

Однако не стоит забывать, что после этого, существенно вырастит «аппетит» мотора, поэтому топливная система будет быстрее изнашиваться и накапливать парафин. Можно прибегнуть к турбонаддуву. В таком случае повышается коэффициент полезного действия, но затрачивается больше топлива. Механический нагнетатель (суперчарджер) отбирает часть мощности у двигателя, а турбокомпрессор функционирует только за счет энергии выхлопных газов.

Также есть возможность увеличить расчетный объем цилиндров – получится повысить мощность силового агрегата без каких-то трудностей. Такие работы производят после расточки блоков цилиндра.

Тюнинг внешности

Данное поколение является довольно новым, поэтому во многих случаях авто не требует доработки, но машину можно преобразовать при помощи тюнинга. Некоторые водители решают установить вместо устаревшего капота с «кочергой», капот на упорах, что очень удобно. Многие знают, что весь АвтоВАЗ «болеет» шумоизоляцией, преимущественно в дверях.

Предусматривается замена замков с вибропоглащающей структурой, где в комплекте поставляются болты шумопоглощающего типа. Чтобы усилить эффект, можно использовать материал шумопоглощающего типа, смягчающий удар после закрытия дверей. Владельцы Лада Приора, чтобы украсить свою внешность используют виниловую основу, очень популярную в наше время. Если есть возможность потратить больше средств, можно приобрести аэрографию.

Некоторые владельцы приобретают хромированную основу. Пленка с карбоновым покрытием выглядит хорошо на любом автомобиле, особенно пленка нового поколения. Теперь есть наличие новой карбоновой пленки 3D, имитирующей углепластиковое покрытие по всему кузову. Более молодое поколение прибегает к стильным обвесам своей машины. Сюда можно отнести спойлер, придающий седану спортивного вида и улучшающий аэродинамические показатели.

Любителям качественного звука выхлопной системы можно посоветовать установить новый глушитель, обладающий мощностью и звериным видом. Также можно установить улучшения, касающиеся фар, например, ангельские глазки, реснички и так далее.

Тюнинг внутренней части

Можно поставить более удобные сидения спортивного типа, светодиодное освещение различных частей интерьера, купить новые чехлы и так далее. Некоторые водители устанавливают кнопки на трнасмиссионный тоннель.

Многие автовладельцы недовольны штатным освещением салона, поэтому можно демонстировать стандартные лампы и поместить туда светодиодную ленту

Важно не переусердствовать, иначе весь салон будет в ярких красках и это может даже отвлекать

Технические характеристики

Ниже поговорим о каждом элементе Лады Приоры отдельно, а именно рассмотрим в отдельности кузов, двигатель, багажник и т.д.

Кузов

Приора выпускалась в нескольких кузовах. В 2007 году появился только седан, позже уже в 2008 году с конвейера сошел первый хэтчбэк и универсал.

Седан 2170

Данный кузов получился весьма симпатичным и наиболее популярным среди молодежи. Приору начали покупать молодые люди и подвергать ее различному тюнингу. Это стало своего рода молодежным движением.

Универсал 2171

Этот вид кузова является отличным решением для семейных людей. Универсал оснащён огромным багажником.

Хэтчбэк 2172

Хэтчбэк не отличается от седана по техническим характеристикам и фронтальной частью кузова, но является короче на несколько сантиметров, что заметно не вооруженным глазом.

Двигатель

На Ладу устанавливалось несколько типов двигателей с разной мощностью и количеством клапанов. Ниже в таблице приведены все устанавливаемые двигателя и их характеристики.

Модель 21126 21127 21116
Число клапанов 16 16 8
Мощность (л.с.) 98 106 87
Тип Бензиновый Бензиновый Бензиновый
Крутящий момент,

145/4000
148/4200
140/3800
Количество цилиндров
4
4
4

Расположение цилиндров
Рядное
Рядное
Рядное

Объем (куб. см.)
1596
1596
1596

Топливо
Бензин АИ 95
Бензин АИ 95
Бензин АИ 95

Тип питания
Электронный впрыск
Электронный впрыск
Электронный впрыск

Максимальная скорость, км/ч
183
183
172

Время разгона до 100 км/ч
11,5
11,0
12,5

Средний расход топлива на 100км
7,2
7,2
7,6

Коробка переключения передач

Приора оснащалась несколькими КПП в зависимости от комплектации и года выпуска автомобиля. Все КПП является 5-ти ступенчатыми

КПП с кулисой

Данная коробка передач устанавливалась на автомобили с 2007 года до 2013 г.в. Является довольно надежной и неприхотливой КПП, основная ее «болячка», слабая вторая передача, которая со временем начинает вылетать.

Тросиковая КПП

Устанавливалась на автомобили с 2014 года выпуска. Получила большое количество положительных отзывов, изменилось положение передач, а именно задней передачи. Снизились вибрации, передаваемые в салон от КПП.

Роботизированная КПП

В 2014 году на люксовых комплектациях автомобиля начали устанавливать роботизированную КПП. Является очень надежной и неприхотливой, но ощутимо теряет в динамике по сравнению с механической КПП.

Лада модификации седан автомобиля Приора – это первооткрыватель марки, код 2170. Российский бюджетный городской автомобиль, выпускавшийся автоВАЗом с 2007 по 2018 годы. За все время автомобиль серийно выпускался в четырех кузовах: седан, хэтчбек, универсал и купе. Каждая из этих версий нашла своего покупателя у отдельных групп автолюбителей, а седан Лада Приора – даже в популярной культуре. Помните песню: Лада Седан баклажан!

Автомобиль имеет сбалансированную массу от 1088 до 1185 кг и мощность двигателя, благодаря чему он динамичен. При этом потребление топлива не превышает 9-10 литров. Что является подходящим для города! Цена всего автомобиля, тоже попала в яблочко. Со временем люди предпочитали взять новую машину, вместо иномарки 20 лет.

Приора седан, стала вариантом первой машины для молодых водителей. Все впечатления сводятся к тому, что для своего класса автомобиль удобен, эргономичен и, к тому же, плавно проходит неровности и недорог по запчастям.

Двигатель

На автомобиль устанавливаются бензиновые четырёхцилиндровые двигатели ВАЗ-21116 объёмом 1.6 л, с 8-клапанной и ВАЗ-21127 с 16-клапанной головками блока цилиндров это дальнейшие развитие ВАЗ-21126.

ВАЗ-21127 двигатель связан с применением более современной и совершенной системой впрыска топлива. Теперь под декоративным кожухом можно увидеть установленный ресивер, который регулирует подачу воздуха в зависимости от оборотов двигателя.

В отличие от двигателя ВАЗ-21124 и ВАЗ-21114 который устанавливался на автомобиль ВАЗ-2112 и ВАЗ-2110, новые двигатели имеют облегчённую шатунно-поршневую группу, повышенную на 10,5 % мощность и увеличенный ресурс работы (+50000 км).

Отзыв о Лада Приора 217030 — 2008 года

Я приобрёл свой автомобиль в ноябре 2008г., пробег на сегодня составляет 26000км. Почему Приора, да потому что денег на иномарку не хватило, как, я думаю, и другим счастливым обладателям этого самодвижущегося шасси. Первое впечатление было довольно-таки неплохое, всё-таки новый автомобиль, но чувство радости омрачали два неприятных скрипа. Один раздавался из пассажирской двери (для устранения пришлось снять обшивку с двери и надеть кембрики на все тяги)Другой скрип раздавался откуда-то сзади, и на его поиски мне пришлось потратить какое-то время. Оказалось, все дело в задней полке. Слава отечественному автопрому и гениальным конструкторам, ибо только в России могут догадаться положить пластмассовую полку на пластмассовый кронштейн и надеяться на тишину в салоне. Сейчас скрипы в машине живут сами по себе, они то появятся непонятно откуда, то исчезнут, и бороться с ними это, по-моему, бесполезная трата время.

Проехав примерно 1000 км, я заметил одну закономерность, при резком опускании любого переднего колеса (переехал через ж/д переезд или просто в ямку заехал), раздаётся неприятный удар по кузову. Поехал на СТО, там сказали, что это нормальная работа отечественных стоек, и снова слава отечественному корытостроению и гениальным конструкторам.

Так как я езжу только за рулём, то и салон могу обсудить, как водитель, хотя кого я подвозил, все жаловались на недостаток места. Итак салон — в целом неплохо, а что вы хотели за 308.000, но что касается отдельных деталей, то есть тема для дискуссий. Во-первых, почему-то все саморезы торчат шляпками наружу, нельзя что-ли заклёпки какие-нибудь поставить, и во время эксплуатации они выворачиваются и падают на коврик, потом приходится искать, откуда они вывалились и заворачивать.

А бардачок, о ужас, закройте и никогда его не открывайте, все потроха в нём торчат на всеобщий осмотр, да и положить в него толком нечего не получится, какой-то он несуразный. А вот бортовой компьютер мне нравится, много всякой информации, очень удобно.

Багажник просто до неприличия огромный, 4 колеса влезают свободно, да ещё можно сложить сиденья и сделать одно пространство с салоном, это тоже плюс, но при установки сидений назад опять вспомним наших гениальных конструкторов, куда там японцам, только наши догадались для открытия замков, удерживающих спинки сидений, привязать какие-то верёвочки, которые надо постоянно поправлять при установки спинки.

В противном случае 2 часа головоломки по выколупыванию верёвочки вам обеспеченно (проверено на себе), куда там японцам со своими кнопками. Несмотря на размеры багажника, не торопитесь загружать в него кирпичи, сначала изучите, куда можно ставить, в противном случае всё провалится в потайные ниши, особенно по краям, там всё на честном слове держится.

Как-то решил сам поменять колёса с зимних на летние, в принципе ничего сложного, на Жигулях 1000 раз менял, но это на Жигулях, тогда конструкторы были не такие гениальные, как сейчас. Во-первых домкрат вообще не подходит и постоянно норовит сбросить машину, но с такой-то матерью машину всё-таки поднял и хотел было открутить колесо, но не тут-то было, и ещё выражу признательность АвтоВАЗу — мировому лидеру по производству металлических корыт, только в России могут болты поставить на 17, а ключ положить на 19.

Что касается шумоизоляции, то ничего плохого сказать не могу, как и хорошего, ибо как можно обсуждать вещь, которой попросту нет!!! Теперь двигатель. Двигатель мне нравится, ещё ни разу меня не подводил. Расход топлива примерно 6-7 литров на сотню. 98 лошадок — это почти 100, но налог меньше.

В -30 заводится легко. Но нагреть двигатель зимой до 90 не получится, 80 — это придел, и то это я полностью закрыл радиатор, а так 60-70, и дело тут не в исправности термостата, а в особенности его работы, как мне сказали на СТО. А вот глушитель ни о чем, тарахтит, как трактор.

Итак мой вердикт: если вам нужно семейное автомобиль для длительных поездок, берите какую-нибудь иномарку, а если вам нужно авто для работы, чтобы тупо ездить, не обращая внимания на небольшие скрипы, то дерзайте!

Добавить отзыв

avtovolgograda.ru

Эксплуатационные недостатки

Как и большинство отечественных автомобилей, Приора обладает достаточно слабым лакокрасочным покрытием, в результате чего кузов подержанных автомобилей покрыт сколами и царапинами. Однако куда более остро стоит проблема с низким качеством металла и уровнем антикоррозийной обработки. Как следствие, автомобиль быстро начинает покрываться ржавчиной, демонстрируя очаги в самых разных местах. Наиболее подвержены коррозии колесные арки, двери, пороги и капот.

Двигатель

Оба бензиновых мотора неплохо зарекомендовали себя за время эксплуатации и неприхотливы в обслуживании. Больше всего хлопот доставляют электронные датчики, которые не могут служить эталоном долговечности. Довольно часто выходят из строя дроссельная заслонка и прокладка между головкой и блоком цилиндров, ввиду низкого качества бензина. При ее загрязнении автомобиль глохнет и теряет тягу. В процессе эксплуатации машины необходимо уделять достаточно внимания работе системы охлаждения. Довольно быстро, особенно в летнее время, может выйти из строя термостат, что может привести к перегреву двигателя со всеми вытекающими последствиями. Не порадует автолюбителей долгим сроком службы катушка зажигания и топливный насос. Автомобиль имеет ременной привод ГРМ и по словам производителя срок его службы составляет 200 тысяч километров. Однако не стоит забывать о том, что в результате обрыва ремня гнет клапана и приходится делать капитальный ремонт мотора. Поэтому владельцы ЛАДА Приора 2008 рекомендуют менять его вместе с роликами и помпой не реже, чем каждые 100 тыс. км.

Трансмиссия

Несмотря на то, что автомобиль безальтернативно укомплектован механической трансмиссией, данная коробка передач не может служить эталоном надежности. Главным недостатком являются слабые синхронизаторы, что, впрочем, характерно для МКПП, установленных на всех моделях АвтоВАЗа. Главным признаком их выхода из строя является характерный хруст, который отчетливо слышен при переключении скоростей. Приора получила усиленное сцепление от фирмы «LUK», однако при этом проблема ограниченного срока службы выжимного подшипника так и не была решена. Продлить срок службы трансмиссии можно за счет качественного масла и регулярной замены жидкости в коробке, которую необходимо проводить не реже одного раза каждые 75 тысяч километров.

Ходовая и рулевое управление

Наверняка многим автолюбителям знакомы проблемы отечественных автомобилей, связанные с коротким сроком службы подвески. Однако ЛАДА Приора в этом компоненте может на равных соперничать с большинством бюджетных иномарок, представленных на вторичном рынке. Быстрее всего выходят из строя втулки стабилизаторов. Как правило, происходит это уже на 10 – 20 тыс. км. пробега. Следом за ними придется менять и стойки стабилизатора. Рулевые наконечники и ступичные подшипники прослужат порядка 40 – 50 тыс. км. Замена шаровых опор и опорных подшипников потребуется при пробеге 60 – 70 тыс. км. Амортизаторы, ШРУСы и сайлентблоки передних рычагов могут пройти 100 – 120 тыс. километров. Оригинальные тормозные колодки могут не пережить первые 10 тыс. км., поэтому водителю придется довольно быстро заменить их на более качественные аналоги.

Определенные неприятности может доставлять некачественная работа электроусилителя руля. Главными сигналами такой неисправности являются, рывки и тяжесть при поворотах рулевого колеса. Устранить проблему можно путем чистки контактов электрической проводки узла.

Другие неисправности

Больших нареканий заслуживает как качество материалов, используемых для отделки салона, так и сам уровень сборки, в результате чего автолюбителям придется на протяжении всего срока эксплуатации мириться с многочисленными посторонними звуками. Причем, с каждым годом их будет становиться все больше. Не помогают избавиться от них и дополнительно установленная шумоизоляция, и оклейка элементов вибропоглащающими материалами. Постоянно водителю придется сталкиваться со сбоями в работе электрооборудования, которые происходят в основном из-за окисления контактов.

Особенности модификации Лонг

Основное, самое заметное изменение коснулось внешнего вида. Если с производством более длинных дверей на автоВАЗ вопрос был улажен, то производством более длинных стекол никто не хотел озадачиваться, сзади пришлось дополнительно поставить стеклянную секцию, отделив ее стойкой. Электропривод приводит в движение только основную часть стекла. Кстати, электропривод всех зеркал – это часть базовой комплектации.

Базовая комплектация также включает в себя:

  • Электропривод зеркал;
  • Климат-контроль;
  • Обогрев передних сидений;
  • ГУР;
  • Шумовиброизоляция;
  • Сигнализация системы APS;
  • Дополнительный плафон освещения в салоне;
  • Подушки безопасности водителя и переднего пассажира;
  • Система ABS.

Большой машине – большие колеса! Приора Премьер так же, как люкс ВАЗ-2170, передвигается только на колесах 15 радиуса. Этот автомобиль вместо обычной Приоры берут из-за тех впечатлений, которые он дарит. Когда, казалось бы, усиленный «движок» ставится для того, чтобы тянуть на себе большую массу, разгоняет машину до почти 200 км/ч, и при этом не теряет устойчивости на дороге, — это повод, ради которого стоит переплатить. Базовая комплектация уже включает многие «фишки» Приоры люкс и в качестве бонуса дает деревянные вставки, так что Премьер является уникальным автомобилем.

Lada Priora — История создания автомобиля

В последнее десятилетие главным конкурентом ВАЗа стали корейские автомобили. И когда была представлена Lada Priora, стиль ее дизайна свидетельствовал: тольяттинские специалисты избрали азиатских производителей своими учителями. Priora очень напоминает корейскую продукцию. По сравнению с ВАЗ-2110 облик менее противоречив… и менее выразителен — большие фары неопределенной формы, скругленные грани, исчезли и оригинальные арки задних колес. Такая машина вполне соответствовала бы стилю Hyundai, KIA или Daewoo 10-летней давности.

Главное преимущество корейских автомобилей — сочетание скромной цены и высокого качества. ВАЗ смог подтянуть качество. Швы между панелями кузова Priora в два раза меньше, чем у предыдущей модели, что говорит о более высокой культуре сборки и точности изготовления.

Улучшилась пассивная безопасность. Появились подушки безопасности, ABS, EBD, жесткость кузова усилили, так что первые экземляры Priora уже набирали две звезды в краш-тестах по методике Euro NCAP — больше, чем любая другая модель ВАЗа. Однако для продаж в Европе этого мало, и кузов усилили дополнительно, после чего автомобиль немного не дотянул до четырех звезд Euro NCAP (данные внутренних испытаний лаборатории ВАЗ).

В целом Priora получила около 950 изменений по сравнению с семейством ВАЗ-2110, было изменено около 2 тыс. деталей. Появился электроусилитель руля; двигатель прошел модернизацию, получив облегченную шатунно-поршневую группу американской компании Federal-Mogul. Мощность повысилась на 10 %, а благодаря ряду импортных ключевых узлов (таких как ремень ГРМ) ресурс увеличился на 50 тыс. км. Усилили тормоза, для лучшей управляемости немного модифицировали подвеску.

Следующим преимуществом корейских автомобилей была комплектация. Lada Priora — первый автомобиль ВАЗ, который практически не отстает от них. В списке опиий базового оборудования — мультимедийная система с Bluetooth, парктроник, встроенный футляр для очков и другие элементы.

В свое время корейские компании стали широко нанимать европейских конструкторов и дизайнеров, чтобы догнать японских и европейских производителей по эстетичности, управляемости и комфортабельности своих автомобилей. Пошел по этому пути и ВАЗ. Так, интерьер салона Priora разработан итальянским ателье Carcerano.

Выводя Priora на конвейер, ВАЗ отошел также от традиции постепенного вытеснения более старой модели. С началом выпуска Priora семейство ВАЗ-2110 было сразу снято с производства и передано для сборки по лицензии на другие заводы в России и Украине — как поступает большинство ведущих производителей.

Priora находит определенный спрос в Европе. Журналисты хотя и не хвалят ее, критикуя вялые тормозные и разгонные характеристики и слабую (по европейским меркам) комплектацию и качество, но отдают машине должное: один из самых дешевых автомобилей на континенте является честным товаром.

Усилия дали свой результат: сейчас продажи продукции Волжского автозавода вновь начали расти. Благодаря Priora завод вышел из кризиса, получил прибыль и нашел средства на самую глубокую модернизацию за последние десятилетия.

Должна быть модернизирована и Priora — в ближайшие годы ее безопасность улучшится, появится автоматическая коробка передач. А ориентировочно в 2015 г. выйдет второе поколение модели, которое будет разработано вместе с Renault — новым владельцем автозавода.

Двигатель

Над двигателем «Супер-Авто» особенно постарались, он получил код ВАЗ-21128. Премьер одарили шестнадцатиклапанным двигателем с рабочим объемом 1,8 л и мощностью 98 л.с. На реальных тестах двигатель выдавал на 2-4 лошадиные силы больше. В смешанном цикле он потребляет 7,2 л на 100 км. Объем бензобака – 43 л, октановое число бензина – 95.

На машину были установлены форсунки Siemens и дроссельный патрубок с широким проходным сечением – это дало большую стабильность работы двигателя. Разгоняется до 100 км/ч этот «аппарат» за 11,5 секунд, а заявленная максимальная скорость – 195 км/ч. Выдает 162 Нм при 3200 оборотах в минуту.

За что упрекают владельцы Ладу Приору в эксплуатации?

Машина оказалась слишком «деревянной», как выражаются многие покупатели в своих комментариях и отзывах. Жесткая подвеска не требует постоянного обслуживания, но и комфорт не предлагает. В комплектациях за доступные деньги были руль, педали и колеса, больше ничего примечательного в машине производитель не реализовал. Также в расширенных отзывах и среди мнений специалистов можно выделить следующие важные минусы авто:

  • роботизированная коробка передач, которая дебютировала в 2020, оказалась не слишком надежной, а ее ремонт выливается владельцам в невероятные суммы, так что это явный недостаток;
  • салон из простейшего пластика, который постоянно скрипит и издает не самый приятный запах, ткань на сидениях быстро изнашивается, нужно покупать какие-то чехлы, на кнопках стираются обозначения;
  • качество двигателей сложно оспорить, но надежность моторов оказалась под вопросом, некоторые владельцы 16-клапанных агрегатов столкнулись с необходимостью капремонта очень рано;
  • автомобиль вообще не подходит для дальних поездок, в таких путешествиях нужно выдумывать какие-то улучшения для сидений, иначе спина водителя и пассажиров просто разваливается;
  • машину приходилось серьезно дорабатывать, устанавливая другую оптику, некоторые детали салона, улучшая звукоизоляцию, а также выполняя хороший антикор каждые 3-4 года.

Технические характеристики Лада Приора седан ВАЗ-2170

Модификации автомобиля

2170 1.6

2170 1.6 16V

Двигатель

Расположение двигателя

Спереди поперечно

Объем двигателя

1596 см3

Количество цилиндров / Клапанов на цилиндр

4 / 2

4 / 4

Система питания

Распределенный впрыск

Мощность (л.с / об. мин)

80 / 5200

98 / 5600

Крутящий момент (Нм / об.мин)

120 / 2700

145 / 4000

Тип топлива

АИ-95

Трансмиссия

Колесная формула / ведущие колеса

4Х2 / передние

Коробка передач

механическая

Число передач

5

Рулевое управление

Тип

Реечного типа

Усилитель

Есть

Тормозная система

Передние тормоза

Дисковые

Задние тормоза

Барабанные

Кузов

Тип кузова / количество дверей

Седан / 4

Кол-во посадочных мест

5

Длина

4210 мм

Ширина

1680 мм

Высота

1435 мм

Колесная база

2492

Колея передних колес, мм

1410

Колея задних колес, мм

1380

Клиренс

160 мм

Объем багажника

360 / 705

Снаряженная масса

1088

Допустимая масса

1578

Эксплуатационные характеристики

Время разгона до 100 км / ч

14 с

11.5 с

Максимальная скорость

172 км / ч

183 км / ч

Размер шин

R14 (175 / 65) (185 / 65)

Расход топлива городской цикл (л / 100 км)

8.3

8.5

Расход топлива загородный цикл (л / 100 км)

6.6

6.7

Объем бака

43

 

Усилитель кузова «ТехноМастер» ВАЗ 2110, 2170 /Лада-Приора/

Описание: Усилитель кузова «ТехноМастер» ВАЗ 2110, 2170 /Лада-Приора/

Применяемость: ВАЗ 2110, 2170 (Лада-Приора) и их модификации.

Повышает крутильную жёсткость кузова на 20-25% в зависимости от типа кузова. Значительно улучшает ходовые качества автомобиля.

Сертифицирован, защищён патентом.

Испытан, одобрен и разрешён к производству АВТОВАЗом. Сохраняет гарантии ВАЗа.

Усилитель кузова разработан с использованием математического моделирования специально для устранения эффекта »вальяжности» поведения этих автомобилей. Увеличение жёсткости кузова влечёт за собой улучшение управляемости и устойчивости автомобиля, повышение долговечности кузова и увеличение пассивной безопасности автомобиля.

При движении по прямой:
— повышается устойчивость автомобиля, особенно на высоких скоростях или при движении по дорогам с некачественным покрытием;

— становится более чёткой корректировка траектории движения при объезде неровностей.

При движении в повороте:
— улучшается реакция автомобиля на поворот рулевого колеса, что придаёт водителю уверенность при управлении автомобилем, позволяет двигаться в поворотах с более высокой скоростью;
— снижается трудоёмкость управления автомобилем в сравнении с серийным, так как уменьшается угол поворота руля при прохождении виражей одинаковых радиусов;
— поведение автомобиля становится более предсказуемым, что позволяет водителю выбирать различные режимы и траектории безопасного движения;

— сохраняется плавность хода автомобиля при одновременном улучшении устойчивости и управляемости.

Не рекомендуется устанавливать усилитель на автомобиль, если на нём установлен только задний стабилизатор поперечной устойчивости (т.е. передний стабилизатор оставлен серийным).

Технологическая инструкция по монтажу усилителя на ВАЗ-2110.

Отзывы о Усилитель кузова «ТехноМастер» ВАЗ 2110, 2170 /Лада-Приора/

Справочник : Lada Priora 2170 ( каталог 2007г.) (Лада Приора: 2170)- описание, характеристики, история.

Модель Cедан 1,6 л. 16-кл. (Евро-3) Хэтчбек 1,6 л. 16-кл. (Евро-3)
Длина, мм 4350 4210
Ширина, мм 1680 1680
Высота, мм 1420 1420
База, мм 2492 2492
Колея передних колес, мм 1410 1410
Колея задних колес, мм 1380 1380
Объем багажного отделения, куб. дм. 430 400
Масса в снаряженном состоянии, кг 1088 1088
Полная масса автомобиля, кг 1578 1578
Допустимая полная масса буксируемого прицепа с тормозами, кг 800 800
Допустимая полная масса буксируемого прицепа без тормозов, кг 500 500
Колесная формула / ведущие колеса 4 х 2 / передние 4 x 2 / передние
Компоновочная схема автомобиля переднеприводный переднеприводная, расположение двигателя переднее, поперечное
Тип кузова / количество дверей седан / 4 хэтчбек / 5
Тип двигателя бензиновый, четырехтактный бензиновый, четырехтактный
Система питания распределенный впрыск с электронным управлением распределенный впрыск с электронным управлением
Количество и расположение цилиндров 4, рядное 4, рядное
Рабочий объём двигателя, куб. см 1596 1596
Максимальная мощность, кВт / об.мин. 72/5600 72/5600
Максимальный крутящий момент, Нм при об/мин 145/4000 145/4000
Топливо неэтилированный бензин АИ-95 (min) неэтилированный бензин АИ-95 (min)
Расход топлива по ездовому циклу, л/100 км 7.2 7,2
Максимальная скорость, км/ч 183 183
Коробка передач с ручным управлением с ручным управлением
Число передач 5 вперед, 1 назад 5 вперед, 1 назад
Передаточное число главной пары 3,7 3,7
Рулевое управление типа »шестерня-рейка», рулевой привод с электроусилителем типа »шестерня-рейка», рулевой привод с электроусилителем
Шины 185/65 R14 86(H) 185/65 R14 86(H), 175/65 R14 82(H), 185/60 R14 82(H)
Емкость топливного бака, л 43 43

Лада Приора 2022 Шанс на появление нового поколения! Фото и цены


В 2009-м и 2012-м годах самым продаваемым автомобилем на территории России была LADA Priora. Казалось бы, Волжский автозавод создал вполне достойную замену легендарной «десятке», но в отсутствие серьезных доработок эта модель подошла к концу истории своего существования морально устаревшей.

Конечно, Лада Приора была ориентирована исключительно на потребности российского рынка, а в регионах Северного Кавказа даже в последние годы выпуска (2017-2018 гг.) оставалась в ТОП-3 по продажам, уступая лишь Весте и Гранте. Более того, уже после прекращения сборки Лада Приора сразу захватила другой рынок – российский рынок подержанных машин, где она солировала не меньше года.

Рендеры нового поколения
На странице все подробности и последние новости о новом кузове Лады Приоры 2022 модельного года:

  • Выйдет ли новое поколение?
  • Какой могла быть новая модель?
  • История модели;
  • Цены;
  • Технические характеристики;
  • Видео тест-драйв.

Шансы на появление нового поколения в 2022 году


В 2012 году, когда до прекращения сборки этой машины оставалось еще 6 лет, и когда Лада Приора подвергалась своему последнему рестайлингу, представители автозавода намекали, что обновление действительно окажется последним, а в 2016-ом на рынок выйдет наследник модели, который примерит на себя новый фирменный стиль. Сообщалось, что новая Приора будет похожей на Lada XRAY и даже получит от этого компактного хэтча новые двигатели.
Существовала и альтернативная точка зрения, авторы которой утверждали, что Lada Priora 2022 перейдет на платформу Renault-Nissan и после смены поколения станет перелицованным Логаном. Напомним, что все это происходило в 2012-ом – почти за 10 лет до того, как бренд LADA все-таки окажется в собственности французского концерна, готовящегося перевести на базу Логана другие российские модели.

Дальше — больше?

Места для ступней ног в «Приорах» совсем мало. В старой, нажимая газ, я часто задевал педаль тормоза. Из-за этого приходится отводить ногу вправо и выворачивать ступню.

О том, что произойдет с ногой в случае аварии, даже не хочется думать. В обновленной машине сидеть лучше благодаря тому, что расстояние между педалями газа и тормоза увеличили примерно на 7 мм (до 47 мм).

ПЛЮС: Хороши светодиодные фонари, машина сделалась заметнее. Экран борткомпьютера четкий и понятный.

МИНУС: Ватные, неинформативные тормоза, и все так же тесно сзади.

Благодарим автосалоны «Темп Авто Балашиха» и «Авторезерв» за предоставленные на тест автомобили.

Рестайлинг проведен малой кровью. Машина явно стала лучше, но от долгожителя российского рынка не стоит ждать чудес. Недостатки, требующие серьезной доработки кузова и ходовой части, остались. Надеемся, их устранят в новой модели, которая придет на смену «Приоре» в конце 2015 года.

Если вас интересует Лада Приора 2021 года (новая модель), фото, цена, характеристики, самые свежие новости о ней, ближайшие конкуренты, иная полезная информация – эта статья для вас. Мы осветим новинку, расскажем, чем она будет отличаться от предыдущей версии, какие особенности будет иметь каждая комплектация.

Последние новости о Lada Priora 2022

Известно, что новые хозяева российской марки готовятся выпустить на своей бюджетной платформе не менее пяти моделей, которым не обязательно достанутся новые имена. Вполне возможно, среди них окажется и Priora, ведь это название среди широкой прослойки российских автолюбителей все еще пользуется уважением, поэтому сможет прорекламировать само себя.

Не исключено, что новая Лада Приора 2022 заинтересует поклонников отечественной техники, а если потенциальные покупатели вновь увидят в ней все те достоинства, которыми могла похвастать Приора образца 2021 года, то модель наверняка будет ждать заслуженный успех и «народная» любовь.

Аудиосистема

Штатная аудиосистема ВАЗ не соответствует высоким требованиям. Поэтому следует задуматься о приобретении качественной мультимедийной системы с выходом на монитор. Для объемного и чистого звука добавляются шестнадцатидюймовые динамики в двери, твиттер и сабвуфер в багажник. Для установки динамиков в дверях необходимо аккуратно выпилить отверстия под них.

Как видно из описания, можно сделать недорогой тюнинг салона Лады Приора своими руками, без переплат и обращения в автоателье. Приобрести модифицированные детали салона и кузова можно как у официальных дилеров, так и у частных продавцов. ВАЗ-2170 – это целое поле для экспериментов.

История модели

Первая Приора сошла с конвейера в 2007 году, заменив на нем ВАЗ-2110, а производитель сразу взялся делать все от себя зависящее, чтобы поддерживать повышенный интерес к новой модели. Постепенно расширялся список комплектаций, а машины получали новые опции и декор.

Не отставали и многочисленные тюнинг-ателье, которые экспериментировали над кузовом Приоры, предлагая свои варианты пластикового обвеса. В разные годы на рынок выходили модификации в виде хэтчбеков, универсалов, седанов, была подготовлена би-топливная Lada Priora CNG, спортивная Priora Sport, удлиненная Priora Premier и даже Priora Coupe, для которой АвтоВАЗу пришлось с нуля разработать свыше 150 оригинальных деталей и узлов, чтобы установить их на базовом пятидверном хэтчбеке, шедшем в комплектации Люкс.

В меру своих возможностей тольяттинцы развивали модель, поэтому в ее истории был момент, когда Приора смогла получить роботизированную коробку передач отечественного производства. Произошло это в сентябре 2014 года, когда на седаны стали ставить первые экспериментальные «роботы», созданные на основе стандартной механической пятиступки, но с электроактуаторами и позаимствованным у ZF электронным блоком управления. Эксперимент завершился не совсем удачно: уже со следующего года Приора вернулась к привычным механическим «коробкам».

По словам самих же тольяттинских инженеров, для своего времени этот автомобиль был очень успешным и пользовался хорошим спросом, благодаря чему фактически помог предприятию избежать банкротства. Но не остается сомнений и в том, что Приора была «приговорена» выходом новых ВАЗовских моделей – более современных, комфортных и безопасных, т. е. сильно поменявших прежнее восприятие бренда. Резкое падение продаж Приор в целом по России стало тем «звоночком», который подсказал руководителям АвтоВАЗа, что проект необходимо закрывать.

Лада Приора 2018 года (новая модель): фото Лада

Автоваз решил обновить относительно старую, но все еще популярную модель, сделав ее более комфортной, при этом доступной по сравнению с более дорогими своими моделями. Внешний облик остался узнаваемым и не особенно изменился, однако выделить можно следующее:

  • Внешность автомобиля останется в целом привычной. Основными отличительными чертами станет появление новых опций и дополнений, которые раньше не ставились на Приору.
  • Слегка изменена передняя часть автомобиля, была заменена решетка радиатора, теперь она имеет новую форму, смотрится более стильно. Ее площадь увеличилась, ширина стала больше.
  • На капоте появились специальные отверстия, которые нужны для того, чтобы не перегревался двигатель при интенсивной работе.
  • Форма противотуманных фар заметно изменилась, улучшился свет. Окантовка фар украшена хромированной линией, благодаря чему автомобиль смотрится более привлекательно; добавился блеск.

  • Если посмотреть на новую Приору сзади, то изменения можно заметить только в фонарях, они получили светодиоды, в целом же дизайн не изменился, и авто выглядит привычно.
  • Изменилась форма крыши, теперь она больше напоминает купол.
  • Кроме этого, угол наклона стекла сзади стал больше.
  • Если посмотреть на автомобиль сбоку, можно заметить схожие черты с Ладой Веста, так как появились Х-образные элементы.
  • Добавились складывающиеся зеркала с повторителями поворотов.

Фото

Лада Приора 2015 фото салона

Более подробная информация о Лада Приора 2015 появится в следующем году. Напомним, выпуск новой рестайлинговой версии стартует следующей осенью. Что касается цены обновленного автомобиля, то в руководстве “Автоваза” уверены, что автомобиль существенно не подорожает.

Перетяжка салона

Салон «Приоры» обычно перетягивают только после нескольких лет эксплуатации автомобиля, или после какого-нибудь серьёзного повреждения оригинальной обивки салона. В других ситуациях автолюбители предпочитают с перетяжкой не связываться, поскольку это невероятно трудоёмкая, хотя и несложная процедура. Вот что потребуется для работы:

  • нож;
  • универсальный клей;
  • строительный фен;
  • ножницы;
  • маркер;
  • валик резиновый;
  • обивочный материал.

Отделка своими руками

Первое, что нужно сделать — это определиться с типом материала. Самый долговечный вариант — кожа. Но он же и самый дорогой, так что позволить его себе может далеко не каждый автолюбитель. На втором месте кожзаменитель. Служит вдвое меньше по сравнению с кожей, но и стоит вдвое дешевле. Наконец, можно использовать велюр или карпет. Это самые дешёвые и недолговечные материалы. Но именно они способны сделать тюнинг салона Приоры невероятным.

Кожа — долговечный, красивый и очень дорогой материал для отделки салона

  1. С автомобиля снимается вся старая обивка. Снимать её следует очень аккуратно, так как элементы этой обивки (начиная от чехлов с сидений и заканчивая потолочной обивкой) в дальнейшем будут использоваться в качестве основы для выкройки.
  2. После снятия обивки все поверхности в салоне тщательно очищаются от грязи и пыли.
  3. На основе выкроек, сделанных по старой обивке, из выбранного материала вырезаются новые элементы салонного покрытия. Затем в них прорезаются все необходимые отверстия (под дверные ручки, потолочные плафоны и т. д.).
  4. Новая обивка всегда сначала ставится на двери. На материал, приготовленный для дверей, наносится универсальный клей. Ему необходимо дать подсохнуть в течение минуты. После этого материал наклеивается на дверь и тщательно приглаживается резиновым валиком.
  5. Аналогичные операции выполняются с потолочной обивкой и с подлокотниками. Все возникшие под материалом воздушные пузыри удаляются с помощью валика.
  6. После наклеивания всех элементов обивки салон должен просохнуть. На это требуется 48 часов. Для ускорения процесса можно воспользоваться строительным феном. Но работать он должен на минимальной мощности.

Лада Приора 2: салон имеет минусы и плюсы

Салон Приоры 2 всем своим видом говорил о том, что автоВАЗ меняется. Больше не было однообразности из деталей, которые ставились на более старые модели автомобилей. Все, что было представлено широкой публике, затем добавлялось более свежим моделям автоВАЗа, выпуск которых начался позднее рестайлинга ВАЗ-2170.

Новый интерьер получился более ярким. Во-первых, новый серый руль с обновленной блестящей эмблемой стал более крупным, а приборная панель почти стала цифровой. Конечно же, панель приборов получилась поинтереснее первой версии, но качество материала все-же хуже, тверже, жестче.

Новая панель стала значительным продвижением вперед – никаких больших серых вставок, только гармоничное сочетание нескольких оттенков чёрного цвета из разных материалов. Появились вставки в двери, которые стали «заделом» для полета фантазии мастеров. Интересная эргономика нового автомобиля является действительно удобной – все, что нужно, находится перед глазами.

Технические характеристики Лада Приора хэтчбек

Что касается размеров, то хэтчбек короче седана на 140 мм и на 1,5 сантиметра выше. Ширина и колесная база автомобилей одинакова. Что касается размеров колес, то на всех Приорах штатными являются диски размером 14 дюймов. Клиренс хэтчбека Lada Priora составляет 165 мм. Стоит отметить, что багажное отделение у хэтча меньше, чем у седана, однако при сложенных задних сидениях погрузочное пространство увеличивается практически в два раза. Далее подробные габариты и размеры машины.

Размеры, багажник, габариты Лада Приора хэтчбек

  • Длина – 4210 мм
  • Ширина – 1680 мм
  • Высота – 1435 мм
  • Снаряженная масса/ полная масса – 1185 / 1578 кг
  • Колея передних колес/задних – 1410 / 1380 мм
  • База, расстояние между передней и задней осью – 2492 мм
  • Объем багажника – 360 литров
  • Объем багажника при сложенных сидениях – 705 литров
  • Объем топливного бака – 43 литров
  • Размер шин – 175/65 R14 или 185/60 R14 или 185/65 R14
  • Клиренс хэтчбека Лада Приора – 165 мм

ВАЗ 2170 Лада Приора технические характеристики


ЭКСПЛУАТАЦИОННЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ ВАЗ 2170 Лада Приора

Максимальная скорость: 183 км/ч
Время разгона до 100 км/ч: 11.5 c
Расход топлива на 100км по городу: 9.8 л
Расход топлива на 100км по трассе: 5.6 л
Расход топлива на 100км в смешанном цикле: 7.2 л
Объем бензобака: 43 л
Снаряженная масса автомобиля: 1095 кг
Размер шин: 185/65 R14

ХАРАКТЕРИСТИКИ ДВИГАТЕЛЯ

Расположение: спереди, поперечно
Объем двигателя: 1596 см3
Мощность: 98 л.с.
Количество оборотов: 5600
Крутящий момент: 145/4000 н*м
Система питания: Распределенный впрыск
Турбонаддув: нет
Газораспределительный механизм: Не комплектуется
Расположение цилиндров: Рядный
Количество цилиндров: 4
Количество клапанов на цилиндр: 4
Рекомендуемое топливо: АИ-95
Экологический стандарт: EURO III

ТОРМОЗНАЯ СИСТЕМА

Передние тормоза: Дисковые
Задние тормоза: Барабанные

РУЛЕВОЕ УПРАВЛЕНИЕ

Тип рулевого управления: Шестерня-рейка
Усилитель руля: Электроусилитель

ТРАНСМИССИЯ

Привод: Передний
Количество передач: механическая коробка — 5

ПОДВЕСКА

Передняя подвеска: Винтовая пружина
Задняя подвеска: Поперечный стабилизатор

КУЗОВ

Тип кузова: Седан
Количество дверей: 4
Количество мест: 5
Длина машины: 4350 мм
Ширина машины: 1680 мм
Высота машины: 1420 мм
Колесная база: 2492 мм
Колея передняя: 1410 мм
Колея задняя: 1380 мм
Объем багажника: 430 л

ПРОИЗВОДСТВО

Год выпуска: с 2007

FRET-повышенная фотостабильность позволяет улучшить отслеживание отдельных молекул белков и белковых комплексов в живых клетках млекопитающих. Программное обеспечение Chimera также использовалось для создания рисунков для этой статьи. Список проанализированных белковых структур выглядит следующим образом: mEos3.2 (идентификатор PDB: 3P8U)

56 , HaloTag (идентификатор PDB: 4KAA) 57 , тег SNAP (идентификатор PDB: 3KZZ) 58 и CENP. -Нуклеосома (идентификатор PDB: 3AN2) 44 .

Экспрессия белков mEos3.2-HaloTag и HaloTag-SNAP-tag Glu-Gly-Ser) и встраивали в вектор экспрессии pET30a, расщепленный EcoRI/HindIII, с использованием набора для клонирования In-Fusion HD (Clontech). Таким же образом клонировали конструкцию HaloTag-SNAP. Затем проводили сайт-направленный мутагенез вектора mEos3.2-HaloTag для получения слитой конструкции с другой длиной линкера (ΔARRELEGSE).

His-меченые конструкции mEos3.2-HaloTag и HaloTag-SNAP экспрессировали в клетках E. coli BL21(DE3)pLysS путем выращивания литра клеток из 50 мл стартовой культуры до OD 600 нм 0,7–1,0 в среде LB, содержащей 35 мкг/мл канамицина и 34 мкг/мл хлорамфеникола, перед индукцией экспрессии с использованием 1 мМ IPTG (Melford Laboratories Ltd) в течение 4 часов при 25 °C. Клетки осаждали и хранили при -20 °С. Для очистки белка клетки быстро оттаивали при 37°С и ресуспендировали в трех объемах буфера для лизиса (50 мМ Hepes pH 7.5, 300 мМ NaCl, 5% глицерина и смеси ингибиторов протеазы (Roche)) на объем гранулы. Затем клеточную ресуспензию обрабатывали ультразвуком в течение 13 мин при амплитуде 33% (5 с при включении и 10 с при выключении) с использованием Sonic Dismembrator (модель 505, Fisher Scientific), клеточный дебрис осаждали, а белковый лизат собирали и фильтровали через 0,45-макс. мкм фильтр.

Слитые белки сначала очищали с помощью аффинной хроматографии с никелем. Белковый лизат ресуспендировали в 5 мл 50% суспензии шариков Ni-нитрилотриуксусной кислоты (Ni-NTA) (Qiagen), которая была предварительно уравновешена в буфере (50 мМ NaH 2 PO 4 , 300 мМ NaCl, рН 8.0) и вращали в течение ночи при 4 °C. Слитый белок очищали с использованием гравитационной колонки объемом 20 мл (Bio-Rad), промывали в трех объемах колонки промывочного буфера (50 мМ NaH 2 PO 4 , 300 мМ NaCl, 5 мМ имидазола, pH 8,0) и наконец, элюировали в 10 мл элюирующего буфера (50 мМ NaH 2 PO 4 , 1 М NaCl, 250 мМ имидазола, рН 8,0). Затем белок подвергали диализу (в 50 мМ NaH 2 PO 4 , 1 М NaCl, pH 8,0) для удаления имидазола с использованием Vivaspin 500 с порогом молекулярной массы (MWCO) 5 кДа (Sartorius Stedim Biotech).Затем слитый белок дополнительно очищали гель-фильтрацией в буфере, состоящем из 50 мМ NaH 2 PO 4 и 1 М NaCl (75 мл колонка Sephadex200, GE Healthcare). Масс-спектрометрию проводили для проверки массы белка (65096,8 Да), а аминокислотный анализ использовали для определения его концентрации. Белок хранили в аликвотах по 500 мкл с концентрацией 1 мг/мл при -80°C и повторно очищали с помощью эксклюзионной хроматографии перед мечением красителем. Слитые белки (5–10 мкМ) метили лигандами красителя HaloTag или SNAP путем их реакции в эквимолярном соотношении при комнатной температуре в течение 1 часа перед очисткой с использованием гравитационной колонки Illustra Nap-5 (GE Healthcare). ).Масс-спектрометрия подтвердила, что мечение близко к 100%.

Красители HaloTag или SNAP-tag PA-JF 549 и JF 646 были любезным подарком от Люка Д. Лависа (HHMI) 60 .

Характеристика массовых спектров флуоресценции

Массовые спектры флуоресценции были получены с использованием mEos3.2 или PA-JF 549 с красителем JF 646 или без него (15–25 мкМ) с использованием флуоресцентного спектрофотометра (Cary Eclipse). Образец помещали в кварцевую кювету (Hellma Analytics, 3×3 мм).Чтобы определить фактическую эффективность FRET белков mEos3.2-HaloTag с различными красителями, спектры излучения собирали после возбуждения на длине волны 532 нм и регистрации флуоресценции в диапазоне длин волн (550–800 нм). Эффективность FRET ( E ) была рассчитана с использованием стандартного уравнения (уравнение 1):

$$E = 1 — \frac{{I_{\rm D}\prime}}{{I_{\rm D}} },$$

где \(I_{\rm D}\) — интенсивность флуоресценции только донорного флуорофора (mEos3.2), а \(I_{\rm D}\prime\) — интенсивность флуоресценции донор в присутствии акцептора (mEos3.2\) — фактор ориентации диполя (\(\frac{2}{3}\) для свободно вращающихся донорных и акцепторных флуорофоров), \(Q_{\rm D}\) — квантовый выход донора mEos3.2 или флуорофоры PA-JF 549 (0,55 и 0,88 соответственно), n — показатель преломления среды (1,33), J — интеграл спектрального перекрытия между донорами mEos3.2 или PA-JF 549 и акцептора JF 646 спектры рассчитаны для различных длин волн λ с использованием коэффициента экстинкции \({\it{\epsilon }}_{\rm A}\) акцепторного красителя JF 646 (максимальное значение 152 000   M −1   см −1 ) (ур.4\mathrm{d}\lambda.$$

Визуализация времени жизни флуоресценции

Измерения подсчета одиночных фотонов с временной корреляцией (TCSPC) проводились на системе Leica SP8 STED 3×, дополнительно оснащенной программным обеспечением Single Molecule Detection (SMD) (SymPhoTime версия 5.3.2.2) и оборудование (PicoHarp 300; PHR 800) от PicoQuant. Возбуждение флуоресценции в этой системе осуществлялось с помощью импульсного (80 МГц) перестраиваемого лазера белого света (WLL; Super-K; NKT Photonics), а детектирование флуоресценции осуществлялось с помощью внутреннего гибридного одномолекулярного детектора (Leica HyD SMD).Возбуждение донора проводили на длине волны 561 нм с полосой детектирования 570-620 нм и с использованием водно-иммерсионного объектива 20 × 0,75 NA (HC PL APO CS2) с коэффициентом масштабирования 1× и скоростью сканирования 400 Гц. , так и с накоплением кадров из 25 изображений. Фотоактивацию/преобразование осуществляли с использованием лазера с длиной волны 405 нм в течение 1 мин при мощности активации 1,75 кВт/см 2 в фокальной плоскости объектива перед измерением времени жизни. Как и ожидалось, увеличение эмиссии донора произошло после активации/конверсии.Измерения FLIM проводились в трех повторностях до и после активации/преобразования очищенного белка в 50 мМ NaH 2 PO 4 , 1 М NaCl, pH 8,0 в 8-луночных стеклянных стеклянных днах μ-слайды (iBidi). Белок прикрепляли к покровному стеклу путем инкубации с поли-L-лизином (Sigma Aldrich) в течение 30 мин, а затем с 5–10 мкМ белка в течение 10 мин. Буфер заменяли для удаления плавающего белка, а затем проводили визуализацию прикрепленного белка, фокусируясь на покровном стекле.{ — t/\tau _i}$$

, где I Bkgd — смещение интенсивности для фоновых отсчетов, а \(\alpha _i\) и \(\tau _i\) — значения амплитуды и времени жизни для i -й экспоненты, где мы сравнивали подгонки для 1 ≤  i  ≤ 3 (т.е., моно-, би- и триэкспоненциальные подгонки). Впоследствии мы определили относительную вероятность для каждой модели для каждого набора данных с помощью Байесовского информационного критерия (BIC) 62,63 . Короче говоря, используя этот подход, мы рассчитали BIC для каждой модели из (уравнение 6)

$$\mathrm{BIC} = \ln [n](p + 1) + n\left( {\ln \left [ {\frac{{2\pi {\rm RSS}}}{n}} \right] + 1} \right),$$

, где n — количество точек данных, p — количество свободных параметров для подбора, а RSS — остаточная сумма квадратов подбора.Впоследствии мы определили относительную вероятность для каждой модели для каждого набора данных из (уравнение 7):

\frac{{{\mathrm{BIC}}_{{\mathrm{Min}}}{\mathrm{(модель) — }}{\mathrm{BIC(модель)}}}}{2}} \right] .$$

Данные для mEos3.2 с JF 646 и без него, а также для PA-JF 549 с JF 646 и без него можно описать двумя временами жизни. Мы определили эффективность FRET ( E ), используя среднее время жизни флуоресценции (уравнение8):

$$E = 1 — \frac{{\tau _{{\rm DA}}}}{{\tau _{\rm D}}},$$

, где \(\tau _ {\rm D}\) — средневзвешенное по амплитуде время жизни флуоресценции только донорного флуорофора (mEos3.2 или PA-JF 549 ), где \(\tau _{{\rm DA}}\) — амплитуда средневзвешенное время жизни флуоресценции донора в присутствии акцептора (mEos3.2–JF 646 или PA-JF 549 –JF 646 ).

Микроскопическая установка

В этой работе использовались две сделанные на заказ микроскопические установки, каждая из которых описана ниже.Таблицу с подробным описанием конкретных параметров, используемых для каждого эксперимента, можно найти в дополнительной информации.

Микроскоп 1. Использовался инвертированный микроскоп Olympus IX71 с лазерными лучами с круговой поляризацией, выровненными и сфокусированными на задней апертуре масляного объектива Olympus 1,49 NA 60× (Plan Apochromat 60× NA 1,49, Olympus APON 60XOTIRF). Используемые диодные лазерные источники с непрерывной длиной волны включают лазеры с длиной волны 561 нм (Cobolt, Jive 200, 200 мВт) и лазеры с длиной волны 405 нм (Oxxius, LaserBoxx 405, 100 мВт).Полное внутреннее отражение было достигнуто за счет смещения лазера от оси таким образом, чтобы выходной пучок на границе раздела образца был почти коллимирован и падал под углом, превышающим критический угол θ c ~ 67° Изображение TIRF и чуть меньше θ c для изображения освещения под косым углом. Это привело к созданию зоны возбуждения диаметром ~ 50 мкм. Для TIRF плотность мощности на покровном стекле для лазера с длиной волны 561 нм была рассчитана примерно равной 0.4 кВт/см 2 измерено с помощью лазерного луча при эпи-освещении. При косоугольном освещении мощность коллимированных пучков на задней апертуре микроскопа составляла 10 кВт/см 2 и 10–100 Вт/см 2 для лазерных лучей с длиной волны 561 нм и 405 нм соответственно. Лазеры отражались дихроичными зеркалами, которые также отделяли собранное флуоресцентное излучение от пучка ПВО (Semrock, Di01-R405/488/561/635). Флуоресцентное излучение собирали через тот же объектив, а затем дополнительно фильтровали с использованием комбинации длинно- и полосовых фильтров (BLP01-561R и FF01-587/35 для возбуждения 561 нм).Сигнал излучения был расширен через 2,5-кратный ахроматический расширитель луча (Olympus, PE 2,5×125) и, наконец, спроецирован на EMCCD (Photometrics, Evolve 512) с коэффициентом умножения электронов 250 ADU/фотон, работающий в режиме передачи кадров. Прибор был автоматизирован с использованием микроменеджера программного обеспечения с открытым исходным кодом (https://www.micro-manager.org), а данные отображались с использованием программного обеспечения ImageJ 64,65 .

Микроскоп 2: Использовался инвертированный микроскоп IX73 Olympus с лазерными лучами с круговой поляризацией, выровненными и сфокусированными на задней апертуре Olympus 1.Масляный объектив 40 NA 100× (Universal Plan Super Apochrom, 100×, NA 1,40, UPLSAPO100XO/1,4). Используемые источники света диодного лазера с непрерывной длиной волны включают 641-нм (Coherent, CUBE 640–100 C, 100 мВт), 561-нм (Cobolt, Jive 200, 200 мВт) и 405-нм лазер (Stradus, Toptica, 405–100, 100 мВт). Визуализация TIRF и косоугольного освещения выполнялась с идентичными дихроичными зеркалами и эмиссионными фильтрами. Сигнал излучения проецировался на EMCCD (Photometrics, Evolve 512 Delta) с коэффициентом умножения электронов 250 ADU/фотон, работающий в режиме передачи кадров.Прибор был автоматизирован с использованием микроменеджера программного обеспечения с открытым исходным кодом (https://www.micro-manager.org), а данные отображались с использованием программного обеспечения ImageJ 64,65 .

TIRF-характеристика mEos3.2-HaloTag-красителей

Покровные стекла из боросиликата (VWR Int, 22 × 22 мм) очищали от остатков флуоресценции в аргонно-плазменном очистителе (плазма Харрика) в течение 1 часа. К покровному стеклу прикрепляли инкубационные камеры с запаивающей рамкой (Bio-rad) и добавляли 50 мкл 0,1% поли-L-лизина (Sigma Aldrich) в центр камеры на 30 мин; Затем на покровное стекло, покрытое поли-L-лизином, добавляли 50 мкл 10 нМ белка на 10–15 мин.Образец трижды промывали 50 мкл фильтрованной (шприцевой фильтр 0,2 мкм, Whatman, 6780–1302) воды MilliQ и флуоресцентных изображений, собранных в виде фильмов из 500 изображений при экспозиции 500 мс. Фотопреобразование осуществлялось в виде одиночного импульса в первом кадре каждого ролика.

Анализ фотофизических параметров

Эксперимент был повторен в лаборатории дважды на Микроскопе 1 и дважды на Микроскопе 2. Хотя все эксперименты показали одинаковые результаты, мы решили анализировать наборы данных с Микроскопа 1, записанные в один и тот же день, чтобы уменьшить возникающие систематические ошибки. из слегка разных юстировок микроскопа.Мы проанализировали фильмы, снятые в тот же день с микроскопа 1, в которых мы отследили 455 и 454 одиночных молекулы mEos3.2 и mEos3.2–JF 646 без тролокса, 990 и 1568 одиночных молекул mEos3.2 и mEos3.2–JF 646. молекул с 2 мМ Trolox. Учитывая, что 20% одиночных молекул mEos3.2–JF 646 находились во включенном состоянии значительно дольше, чем одиночные молекулы mEos3.2, это подходящий размер выборки для демонстрации наблюдаемых нами изменений. Все гистограммы были созданы с использованием пакета Origin (OriginLab, Нортгемптон, Массачусетс).

Здесь приводится краткое описание программного обеспечения, используемого для анализа данных. Проекция максимальной интенсивности первых двух изображений после фотопреобразования использовалась в качестве основы для обнаружения одиночных молекул. К проекции был применен фильтр Лапласа-Гаусса и найдены локальные максимумы. Скрипты для этого доступны по адресу https://github.com/TheLaueLab/blob-detection, а для всех остальных шагов — по адресу https://github.com/TheLaueLab/blink-analysis. Из каждого изображения была извлечена область с центром на каждом пике с пороговым значением >600 ADU.Эта область состояла из сигнальной области 7 на 7 пикселей и окружающей фоновой области шириной 2 пикселя. Отдельные кадры были упрощены до одномерных трасс путем вычитания среднего значения фона для каждого кадра из соответствующего кадра, а затем взятия среднего значения всех пикселей в этом кадре. Скрытая марковская модель (с использованием пакета hmmlearn python из https://github.com/hmmlearn/hmmlearn) была настроена с четырьмя состояниями: два включенных состояния, одно выключенное состояние и одно обесцвеченное состояние. Переходы были одинаково вероятны между всеми включенными и выключенными состояниями, а вероятность перехода из любого включенного состояния в обесцвеченное состояние составляла 1/10 (переход из обесцвеченного состояния был невозможен).Состояния были инициализированы средним значением 300 ADU для включенных состояний и 0 для выключенного и обесцвеченного состояний с предварительным весом 1e3, присвоенным средним состояниям. Модель была обучена на всех следах от определенного флуорофора, и одна и та же обученная модель использовалась для категоризации всех следов.

Общее время во включенном состоянии каждой молекулы было рассчитано путем подсчета количества изображений во включенном состоянии. Моргание определялось как последовательное выполнение изображений; средняя продолжительность цикла, умноженная на время воздействия, представляет собой время во включенном состоянии, а количество запусков, обнаруженных для конкретной молекулы, представляет собой количество событий переключения.Скорость выключения представляла собой количество миганий, деленное на общее время в состоянии «включено», а частота включения представляла собой количество миганий, деленное на общее время в выключенном состоянии (исключая последнюю серию выключенных кадров, если она продолжалась до конец видео).

Наконец, общее излучение фотонов было рассчитано для каждого изображения путем вычитания среднего значения области фона из области сигнала. Чтобы рассчитать количество испускаемых фотонов на молекулу, общее усиление камеры в единицах аналого-цифровых единиц (ADU)/фотон определялось по (уравнению9)

$$G_{{\rm total}} = \frac{1}{{G_{{\rm camera}}}} \times G_{{\rm EM}} \times {\rm QE}, $$

где G камера — усиление сигнала, присущее ЭМЗУ в единицах ADU/электрон, G EM — отношение заряда на камере с усилением и без него, а QE — Квантовая эффективность — способность камеры производить заряд в результате падающего фотона с единицами электронов на фотон. G Всего 33.1 ADU/фотон и 35,7 ADU/фотон для микроскопов 1 и 2 соответственно.

Измеренный сигнал ( I ) в единицах электронов был преобразован в излучаемые фотоны ( n ) следующим образом (уравнение 10):

$$n = \frac{I}{{G_{{\rm total}} \times {\rm TE}}}.$$

TE определяется как эффективность передачи всех оптических компонентов на пути излучения прибора и может быть описана уравнением (11)

$${ \rm TE} = \eta _{{\rm coll}} \times T \times \eta _{{\rm EMCCD}},$$

где η coll — эффективность сбора объектива, T — пропускание внутренних оптических компонентов микроскопа, а η EMCCD — квантовая эффективность EMCCD 66 .

Культура клеток млекопитающих и создание клеточных линий

ЭС клетки культивировали в стандартных условиях сыворотки и фактора, ингибирующего мышиный лейкоз (mLIF): минимальная основная среда Глазго (Sigma-Aldrich G5154), содержащая 100 мМ 2-меркаптоэтанола (Life tech, кат. 21985023), 1 × Минимальная незаменимая среда, заменимые аминокислоты (Sigma-Aldrich, M7145), 2 мМ L-глютамина (Life tech, кат. 25030024), 1 мМ пирувата натрия (Sigma-Aldrich, S8636-100ML), 10% эмбриональная бычья сыворотка (HyClone FBS, номер партии SZB20006, GE Healthcare Austria SV30180.03) и 10 нг/мл mLIF (предоставлено кафедрой биохимии Кембриджского университета). Их пассировали каждые 2 дня, промывая в PBS (Sigma-Aldrich, D8537), добавляя 0,25% трипсин-ЭДТА (Life tech, кат. 25200072) для отделения клеток, а затем промывая в среде перед повторным посевом в свежую среду. Чтобы помочь клеткам прикрепиться к поверхности, планшеты инкубировали в течение 15 минут при комнатной температуре в PBS, содержащем 0,1% желатина (Sigma Aldrich, G1890). Фоновые линии клеток ES E14tg2a (доступные от Sigma Aldrich, 08021401) были охарактеризованы с помощью количественной ПЦР, секвенирования РНК, секвенирования ChIP и анализов активности, и они подвергались обычному скринингу на загрязнение микоплазмой и дали отрицательный результат.

ES-клетки, экспрессирующие мышиный CHD4, помеченный на С-конце с помощью mEos3.2-HaloTag, были получены путем нокаута кассеты, содержащей mEos3.2-HaloTag и ген селекции пуромицина, на основе CRISPR/Cas9, в один аллель CHD4 клетки ES 37 . Кассету пуромицина затем удаляли с помощью рекомбиназы Dre, чтобы получить аллель CHD4 со слиянием mEos3.2-HaloTag на С-конце. Поскольку нокаут CHD4 смертелен, мы использовали анализы жизнеспособности клеток, чтобы убедиться, что функция меченого CHD4 не пострадала.Линия ES-клеток E14tg2a 67 , экспрессирующая mEos3.2-меченый CENP-A, была описана ранее 59 , но вкратце, была получена путем трансфекции плазмиды, экспрессирующей меченый белок, с последующей селекцией в 500 мкг/мл генетицина (Life tech , кат. 10131019). Через 2 недели селекции генетицина клетки сортировали с использованием проточного сортировщика MoFlo (Beckman Coulter), чтобы убедиться, что они были помечены флуорофором mEos3.2 (возбуждение при 488 нм, испускание при 515 нм). Чтобы протестировать одиночную молекулу FRET между mEos3.2 или PA-JF 549 и JF 646 на разных белках, векторы, экспрессирующие HaloTag-меченный и SNAP-меченный CENP-A, были созданы путем вставки последовательности HaloTag или SNAP-метки в сайт NcoI/XhoI mEos3.2 -меченый вектор CENP-A, описанный выше 59 . Только белок HaloTag также экспрессировался в том же векторе, что и контроль. Вектор, экспрессирующий SNAP-меченый гистон h3B, ранее был описан 45 .

Одномолекулярная визуализация живых и фиксированных клеток млекопитающих

ЭС клетки, экспрессирующие mEos3.CHD4, меченный 2-HaloTag, пассировали за 2 дня до визуализации на 35-мм чашках со стеклянным дном № 1.0 (MatTek Corporation P35G-1.0-14-C Case) в сыворотке без фенолового красного и в условиях mLIF. Непосредственно перед визуализацией, при необходимости, клетки метили 5 мкМ лиганда HaloTag-JF 646 в течение не менее 15 мин с последующими двумя промывками в PBS и 30-минутной инкубацией при 37°C в среде перед визуализацией клеток в свежая сыворотка, не содержащая фенолового красного, и условия LIF, содержащие 5  мМ Trolox. Флуоресцентные изображения in vivo собирали в виде фильмов из 10 000 кадров при экспозиции 500 мс.Непрерывное фотопреобразование было достигнуто с использованием лазера с длиной волны 405 нм при низкой мощности активации ~10 Вт/см 2 .

Для отслеживания белковых комплексов ES-клетки, экспрессирующие SNAP-меченый гистон h3B или mEos3.2-, HaloTag- и SNAP-меченый CENP-A, были созданы путем трансфекции соответствующими векторами экспрессии. Четыре микролитра Lipofectamine® 2000 (Life tech, кат. 11668027), инкубированные в 100 мкл среды с уменьшенной сывороткой OPTI-MEM® I (Thermo Fisher Scientific, кат. 31985070) в течение 5 мин, добавляли примерно к 2–3 мкг векторов экспрессии, также инкубированных в 100 мкл OPTI-MEM® в течение 5 мин.Затем смесь инкубировали еще в течение 15 минут перед добавлением к ЭС клеткам, которые были пассированы в то же время на чашках со стеклянным дном диаметром 35 мм. Через 2 дня клетки метили соответствующими лигандами HaloTag, как описано выше для CHD4. Лиганды метки SNAP также были помечены аналогичным образом, но с начальной инкубацией в течение 30 минут перед промывкой.

FRET был оптимизирован путем обеспечения избытка акцепторного красителя, окружающего донор mEos3.2 или PA-JF 549 . Для FRET между mEos3.CENP-A с 2 метками и CENP-A с меткой JF 646 , это было выполнено путем трансфекции 0,4 мкг CENP-A с меткой mEos3.2 или CENP-A с меткой SNAP вместе с 2 мкг CENP с меткой HaloTag- А. Для FRET между PA-JF 549 -меченым и JF 646 -меченым CENP-A или PA-JF 549 -меченым и JF 646 -меченым h3B это было достигнуто путем маркировки клеток после трансфекции с помощью 0,2 мкМ SNAP-tag PA-JF 549 лиганда и 2 мкМ SNAP-tag лиганда JF 646 . Наконец, для CENP-A/h3B FRET 1  мкг mEos3.2-меченый CENP-A трансфицировали вместе с 1 мкг SNAP-меченого CENP-A и метили 5 мкМ SNAP-tag лиганда JF 646 . Клетки, экспрессирующие конструкцию mEos3.2-CENPA, PA-JF 549 -CENP-A или PA-JF 549 -h3B, идентифицировали по их способности фотоактивировать отдельные молекулы с использованием лазера с длиной волны 405 нм, а клетки, меченные лиганды HaloTag-JF 646 или SNAP-tag JF 646 по их локализации в центромерных очагах или в ядре (для HaloTag-CENP-A или SNAP-меченого h3B соответственно), как определено с помощью визуализации с использованием лазера с длиной волны 641 нм. (1 кВт/см 2 ).Флуоресцентные изображения фиксированных и живых клеток собирали в виде фильмов от 3000 до 5000 кадров при экспозиции 500 мс. Фотопреобразование было достигнуто с помощью воздействия 100 мс лазера 405 нм каждые 6 с при низкой мощности активации ~ 10   Вт / см 2 . Для фиксации клеток клетки промывали PBS, фиксировали при комнатной температуре в PBS, содержащем 4% формальдегида, в течение 15 мин, снова промывали в PBS и затем ресуспендировали в PBS, содержащем 5 мМ Trolox.

Обработка и анализ изображений клеток млекопитающих

Видеоролики одиночных молекул живых клеток и фиксированных клеток были проанализированы с использованием программного обеспечения Rapidstorm, которое определяет локализацию одиночных молекул из фильмов PALM 68 , после использования коррекции фона вращающегося шара изображения с радиусом 5 пикселей.Анализировались только флуоресцентные точки шириной менее 5 или 3 пикселей (для микроскопов 1 и 2 соответственно) и с фиксированным глобальным порогом выше 25000. Чтобы отслеживать отдельные молекулы CHD4, CENP-A или h3B, мы использовали специальный код для соединения локализаций отдельных молекул и извлечения длины их траекторий (сценарий можно найти на https://github.com/TheLaueLab/trajectory-analysis). . Флуоресцентные точки считались одной и той же молекулой, если они находились в пределах 100 нм между кадрами, потому что мы не ожидаем увидеть коэффициенты диффузии выше этого для связанного h3B/CENP-A/CHD4.Молекулы все еще были связаны, если они не были обнаружены в течение 1 кадра, чтобы уменьшить вероятность того, что молекулы ненадолго упадут ниже порога отношения сигнал-шум. Траектории менее 3 локализаций отбрасываются, чтобы уменьшить вероятность обнаружения шума. Средняя интенсивность этих траекторий также была извлечена для расчетов эффективности FRET — мы игнорируем первый и последний кадры, потому что молекула могла не флуоресцировать на всех этих кадрах. Изображения одиночных молекул, показанные на рис.4 были сгенерированы с использованием Peak Fit, так что локализации представляют точность, с которой они были локализованы 69 . Точность локализации была рассчитана после анализа Rapidstorm путем подбора гистограммы парных расстояний ближайших соседей 70 .

Для отслеживания одиночных связанных молекул CHD4 в живых клетках эксперимент был повторен дважды на микроскопе 1 и один раз на микроскопе 2. Мы снова решили проанализировать наборы данных с микроскопа 1, записанные в один и тот же день, чтобы уменьшить систематические ошибки, возникающие из-за слегка отличающихся микроскопов. выравнивания.Мы собрали 772 и 539 одиночных молекульных траекторий из фильмов одиночных молекул mEos3.2- и mEos3.2-JF 646 -меченых молекул CHD4 соответственно (обычно в каждом фильме исследовали две клетки). Учитывая, что 10–30% одиночных молекул mEos3.2–JF 646 находились во включенном состоянии дольше, чем одиночные молекулы mEos3.2, это подходящий размер выборки для демонстрации изменений, которые мы наблюдаем.

Для анализа близости белка CENP-A FRET было собрано больше траекторий из-за относительно небольшого количества mEos3.Ожидалось, что 2-меченые молекулы будут рядом с JF 646 -мечеными молекулами. Эксперимент был воспроизведен один раз на Микроскопе 1 и дважды на Микроскопе 2, и мы проанализировали один из наборов данных с Микроскопа 2, в котором мы собрали 17 953, 17 288 и 21 018 траекторий из фильмов одиночных молекул mEos3.2-CENP-A, mEos3. .2-CENP-A/JF 646 -CENPA и mEos3.2-CENP-A/JF 646 -h3B соответственно (обычно в каждом фильме исследовали четыре клетки). Учитывая, что ~0,1–1% mEos3.2 молекулы в присутствии молекул, помеченных JF 646 , находились во включенном состоянии дольше, чем отдельные молекулы mEos3.2, это подходящий размер выборки для демонстрации наблюдаемого нами изменения.

Для анализа близости h3B FRET эксперимент был повторен дважды на микроскопе 2, и мы проанализировали один из наборов данных, в котором мы собрали 2114 и 3970 траекторий из фильмов одиночных молекул PA-JF 549 -h3B и PA-JF. 549 -h3b/JF 646 -h3B соответственно (обычно в каждом ролике исследовали четыре клетки).Учитывая, что 10% молекул PA-JF 549 в присутствии молекул, меченных JF 646 , находились во включенном состоянии дольше, чем 1% одиночных молекул PA-JF 549 , это подходящий размер выборки. чтобы продемонстрировать изменения, которые мы наблюдаем. Траектории длиной более 1% одиночных молекул PA-JF 549 были идентифицированы и окрашены в синий цвет. Эффективность FRET рассчитывали, используя среднюю интенсивность молекул, меченных только PA-JF 549 . Карты плотности шириной 2 пикселя (312 нм) были созданы, чтобы показать количество молекул, обнаруженных в области, и была ли средняя длина трека ниже (желтый) или выше 12 с (синий), доверительный интервал 1% установлен таким образом, что существует 1% вероятность того, что молекулы, меченные PA-JF 549 , имеют длину трека более 12 с.

Доступность данных

Наборы данных, созданные и проанализированные в ходе текущего исследования, можно получить у авторов по запросу.

Наличие кода

Программное обеспечение, используемое для фотофизического анализа in vitro и отслеживания живых клеток, можно найти по адресу https://github.com/TheLaueLab/blink-analysis и https://github.com/TheLaueLab/trajectory-analysis. , соответственно. Другое используемое программное обеспечение включает микроменеджер с открытым исходным кодом (https://www.micro-manager.org), ImageJ64,65, Rapidstorm68 и PeakFit69.

Флуоресцентная резонансная микроскопия переноса энергии, продемонстрированная измерением активации серин/треонинкиназы Akt

Abstract

В этом протоколе описываются процедуры проведения анализа флуоресцентно-резонансной микроскопии переноса энергии (FRET) тремя различными методами: акцепторное фотообесцвечивание, сенсибилизированное излучение и спектральное изображение. Мы также обсудим методы FRET на основе микроскопии анизотропии и времени жизни флуоресценции. Используя конкретный пример зонда FRET Akind (индикатор Akt), который представляет собой версию Akt, модифицированную таким образом, что FRET возникает, когда зонд активируется путем фосфорилирования, что указывает на активацию Akt.Протокол содержит подробное пошаговое описание подготовки образцов, получения и анализа изображений, включая контрольные образцы, коррекцию изображений и создание количественных изображений отношения FRET/CFP как для сенсибилизированной эмиссии, так и для спектральной визуализации. Подготовка образца занимает 2 дня, настройка оборудования — 2–3 часа, получение и анализ изображений — 6–8 часов.

ВВЕДЕНИЕ

Передовые методы световой микроскопии в настоящее время предоставляют исследователям инструменты, необходимые для измерения белок-белковых взаимодействий и активации белков во времени и пространстве в клетке или внутри небольших организмов.В более широком масштабе многоцветная микроскопия позволяет визуализировать динамику органелл, везикул и целых клеток, а также наблюдать изменения на субклеточном, клеточном и организменном уровнях. Методы количественной световой микроскопии, в том числе FRET, предоставляют инструменты, необходимые для начала анализа субмикроскопических молекулярных взаимодействий внутри клеток и организмов с высоким пространственным и временным разрешением. Фактически, теперь доступны биосенсоры на основе FRET для измерения активности многих высокодинамичных биологических молекул в живых образцах 1–3 .В этом протоколе мы представляем процедуры микроскопии FRET, которые мы использовали, чтобы показать, что экспрессия адаптерного белка APPL1 приводит к заметному снижению количества активного Akt, особенно на краю клетки 4 . В качестве примера, чтобы проиллюстрировать процедуру, мы сравниваем внутримолекулярный зонд Akind FRET и неактивируемый мутант (3A-Akind), в котором активность FRET заметно снижена.

FRET

FRET также называют резонансной передачей энергии Фёрстера в честь немецкого ученого Теодора Фёрстера, впервые описавшего явление 5–7 .Процесс FRET включает передачу энергии от одного флуорофора в возбужденном состоянии ко второму флуорофору посредством безызлучательной передачи энергии (т. е. без испускания света) 8 . Эксперименты FRET с флуоресцентными белками (FP) основаны на измерении количества эмиссии акцепторного белка (например, Venus, вариант желтого FP, YFP) после возбуждения донора (например, голубого FP, CFP) 9 . В этом случае после возбуждения CFP свет излучения будет голубым; однако, если энергия передается белку-акцептору, такому как Венера, то также будет наблюдаться желтая флуоресценция (), даже если желтый белок не возбуждался напрямую лазером или лампой.Для эффективного FRET должно быть существенное перекрытие между эмиссионными спектрами флуоресценции донора и спектрами возбуждения (или поглощения) флуоресценции акцептора () 10,11 . Измерения FRET часто называют «молекулярными линейками», потому что FRET эффективен только тогда, когда два флуорофора находятся в пределах 2–10 нм друг от друга (). На самом деле эффективность переноса энергии сильно зависит от расстояния между двумя белками, так как оно обратно пропорционально этому расстоянию в шестой степени (http://micro.magnet.fsu.edu/primer/techniques/fluorescence/fret/fretintro.html).

Схематические диаграммы, изображающие три условия, которые должны быть выполнены для эффективного FRET. ( a ) Энергия излучения донора должна быть такой, которую может поглотить акцептор. Другими словами, спектр излучения донорного флуорофора должен перекрываться со спектром возбуждения акцепторного флуорофора. ( b ) Если расстояние между донором и акцептором FRET превышает 10 нм, то FRET не происходит, и донор излучает флуоресценцию.Если донор и акцептор находятся в пределах ~10 нм друг от друга, то может происходить передача энергии от донора (CFP) к акцептору (Венера). ( c ) Если диполи донорного и акцепторного флуорофора перпендикулярны друг другу, то молекула донора будет излучать флуоресценцию. Однако, если диполи параллельны друг другу, возникнет FRET.

Датчики FRET

Одной из наиболее эффективных пар голубых и желтых FP являются CyPet и YPet 12 ; однако обычно используются белковые конструкции со многими вариантами голубых и желтых белков.С развитием более ярких и фотостабильных красных FP использование EGFP и красных FP, таких как мономерная Cherry (mCherry), становится более распространенным 13 . В нескольких обзорах обсуждаются доступные в настоящее время конструкции FP 14–22 . FRET часто используется для изучения взаимодействий между двумя отдельными партнерами по связыванию белка посредством межмолекулярного FRET, при этом один партнер по связыванию содержит донор, а другой партнер содержит акцептор. Дифференциальная экспрессия донорных и акцепторных FP в каждой клетке должна быть принята во внимание, поскольку переменные уровни белка могут изменить результаты FRET 23,24 .В качестве альтернативы FRET можно использовать в качестве инструмента для наблюдения за конформационными изменениями в структуре белка после активации. Конформационные изменения могут быть результатом посттрансляционных модификаций, таких как фосфорилирование или другие события, включая связывание белка или мембраны. Эти изменения в конформации можно использовать для конструирования внутримолекулярных FRET-зондов, в которых и донорный, и акцепторный флуорофоры присутствуют в одной и той же молекуле. В базовых условиях два флуорофора находятся достаточно далеко друг от друга, чтобы не возникало FRET (11).Однако после активации конформационные изменения в белке сближают два флуорофора и происходит FRET. Внутримолекулярные биосенсорные зонды FRET обходят некоторые проблемы переменных уровней экспрессии, поскольку донорные и акцепторные FP экспрессируются вместе в соотношении один к одному как часть одной и той же молекулы. Эти зонды могут быть сконструированы так, чтобы быть очень чувствительными к конформационным изменениям в белке после связывания лиганда, фосфорилирования, ферментативного расщепления 22,25–29 и даже в ответ на молекулярное воздействие или связывание металлов, таких как цинк, что приводит к прирост или убыток ЛАД () 22,25–31 .

Схема внутримолекулярного зонда Akind FRET. Эта цифра была адаптирована с разрешения исх. 30. Akind состоит из домена гомологии плекстрина Akt (PH), за которым следует Venus FP, каталитический домен Akt (CD) и, наконец, CFP. ( a ) В базальном состоянии FRET минимален, так как флуорофоры CFP и Venus не находятся в пределах 10 нм друг от друга. Таким образом, если CFP возбужден, будет испускаться голубая флуоресценция. ( b ) Когда Akind рекрутируется на плазматическую мембрану посредством взаимодействия между его доменом PH и PIP 3 , он активируется двумя событиями фосфорилирования (P).Эти события фосфорилирования вызывают конформационные изменения в зонде Akind, в результате чего флуорофоры CFP и Venus оказываются достаточно близко друг к другу, чтобы позволить произойти FRET.

Таблица 1

Обзор других ключевых протоколов FRET.

Ссылка Резюме
Ai и др. 22 Двойная FRET-парная визуализация активности каспазы-3 в живых клетках
Brumbaugh et al. 25 Создание сенсоров FRET, которые реагируют на посттрансляционные модификации, такие как фосфорилирование
Aoki et al. 26 Внутримолекулярные FRET биосенсоры малых ГТФаз, визуализированные динамически в живых клетках
Дежуров и соавт. 27 Использование квантовых точек в конструировании биосенсоров FRET для олеиновой кислоты
Salonikidis et al. 28 Влияние ионной чувствительности на биосенсоры цАМФ FRET
Newman et al. 29 Обширный обзор генетически кодируемых флуоресцентных биосенсоров, пригодных для изучения динамики живых клеток
Grashoff et al. 74 Измерение напряжения в винкулине с помощью механочувствительного биосенсора FRET
Vinkenborg et al. 70 Измерение концентрации цинка в цитозоле с помощью биосенсоров eCALWY FRET

Здесь внутримолекулярный зонд Akind FRET используется для обнаружения активации Akt в клетках.Akind состоит из домена гомологии плекстрина Akt на его N-конце, за которым следует Venus FP, затем каталитический домен Akt и, наконец, CFP на С-конце () 30 . Akt рекрутируется на плазматическую мембрану через свой домен гомологии с плекстрином, где он связывается с фосфатидилинозитол (3,4,5)-трисфосфатом (PIP 3 ) (ссылка 31). Впоследствии он активируется путем фосфорилирования двух консервативных остатков, Thr308 и Ser473, в его каталитическом домене 32 . Эта активация вызывает конформационные изменения, которые сближают донорные и акцепторные молекулы внутри зонда Akind, что позволяет произойти FRET (4).

Методы измерения FRET в микроскопии

Существует пять основных методов, которые можно использовать в FRET-микроскопии; каждый метод будет представлен здесь (обзоры см. ссылки 23 , 33 39 ). Для простоты мы будем обсуждать FRET с точки зрения CFP в качестве донорного флуорофора и Venus FP в качестве акцепторного флуорофора. Однако любая подходящая пара флуорофора донора и акцептора может быть заменена.

Акцепторное фотообесцвечивание

Акцепторное фотообесцвечивание — это первый метод FRET, который следует применять ко всем экспериментальным системам.Он может быстро проверить наличие FRET, прежде чем переходить к оптимизации других измерений FRET. Примечательно, что этот метод наиболее применим к фиксированным клеткам или тканям или для экспериментов с живыми клетками, в которых неотбеленные акцепторные молекулы не могут быстро диффундировать обратно в обесцвеченную область. Если клетки живые и белки движутся быстро, всю клетку можно обесцветить и сравнить с соседней клеткой в ​​том же поле зрения, которая не была обесцвечена. Однако следует соблюдать осторожность, поскольку фототоксичность для такого эксперимента может быть высокой, и в этом случае использование фиксированных клеток может быть более актуальным, чем работа с скомпрометированными живыми образцами.Принцип фотообесцвечивания акцептора заключается в том, что в отсутствие акцептора не может произойти FRET. Следовательно, в результате происходит увеличение прямой эмиссии, т.е. интенсивности сигнала донора после фотообесцвечивания акцептора 40 . Изображения CFP сделаны до и после фотообесцвечивания FP Венеры в интересующей области (ROI; ). Изображения корректируются с учетом интенсивности фона и неравномерности поля, а интенсивность флуоресценции CFP определяется количественно. Мы обнаружили, что количественная оценка показала значительное увеличение интенсивности CFP после обесцвечивания Венеры по сравнению с контрольной областью, где Венера не обесцвечивалась, подтверждая сигнал FRET (1).Обратите внимание, что после фотообесцвечивания увеличение интенсивности CFP может быть небольшим, и поэтому его часто трудно измерить или визуализировать на глаз (). Это ожидаемо, поскольку эффективность FRET с FP составляет в лучшем случае 10–40%, и человеческий глаз не может визуализировать такие небольшие различия в интенсивности. Акцепторное фотообесцвечивание также следует проводить на отрицательном контроле FRET, чтобы убедиться, что не наблюдается увеличения флуоресценции донора (1).

Акцепторное фотообесцвечивание в интересующих областях (ROI). Показаны клетки HT-1080, экспрессирующие Akind.( a ) Изображения CFP и FP Венеры до (слева) и после фотообесцвечивания Венеры лазерной линией 514 нм (справа). Красные кружки обозначают ROI, где Венера была обесцвечена лазерной линией 514 нм, а белые кружки представляют неотбеленную контрольную область. ( b ) Количественная оценка изменения интенсивности флуоресценции CFP после фотообесцвечивания как в неотбеленной контрольной области (контрольная область CFP), так и в области, в которой Венера была подвергнута фотообесцвечиванию с помощью лазерной линии 514 нм (обесцвеченная область CFP).Столбики погрешностей представляют собой sem. для 16 ячеек (* P = 0,0022). Масштабная линейка, 10 мкм. а.е., условные единицы.

Таблица 2

Образцы, необходимые для различных методов FRET-микроскопии.

90 445 455 No 9045 5 Рекомендуемые
Примеры Акцептора
отбеливающих
сенсибилизированных
выбросы
Спектрального Флуоресцентных
прижизненных
коррекция или измерения
Немеченая клетка Да Да Да Да AutoFluorent
CFP в одиночку NO Да Да Да Да CFP Emission Cross Talk, CFP Spectra, определение CFP Lifetime
Да Да Да Да No Венера возбуждения Cross Talk, Venus Spectra
NOUS CFP и VENUS Да Рекомендуется Рекомендуется Рекомендуется Отрицательный Фрет
Связанный CFP и Venus Рекомендуется Рекомендуется Рекомендуемые Рекомендуемые Положительный контроль Фрета, Определить Срок службы FRET CFP
CFP и Venus Experiremental Образцы Да Да Да Да Да Образец процентов
CFP и Venus Положительный биологический Control Рекомендуется Рекомендуется Рекомендуется Рекомендуется Рекомендуется показать Должен показать высокую Фрету, Короткие CFP Lifetime
CFP и Venus Отрицательный биологический контроль Рекомендуется Рекомендуется Рекомендуется FRET, длительный срок службы CFP

Если в образцах FRET после фотообесцвечивания акцептора не наблюдается увеличения интенсивности доноров, возможные причины см. в разделе «Подводные камни FRET».Фотообесцвечивание на конфокальном лазерном сканирующем микроскопе (CLSM) является относительно простым, и большинство программных платформ предоставляют простой интерфейс для отбеливания области интереса. В широкопольном микроскопе полевая диафрагма флуоресценции может быть закрыта и использована для локализованного фотообесцвечивания. Фактически, постепенное фотообесцвечивание акцептора может быть использовано для измерения эффективности FRET с использованием широкопольной платформы 41 . Важно, чтобы условия фотообесцвечивания акцептора были оптимизированы, чтобы гарантировать, что донор также не обесцвечивается.

Сенсибилизированное излучение

Метод FRET с сенсибилизированным излучением основан на измерении FRET по серии образцов и контрольных изображений (). Изображения донора и сигнала FRET собираются и корректируются с учетом интенсивности фона, шума и интенсивности, которые не возникают непосредственно из сигнала FRET. Результирующие изображения затем представляются как изображение соотношения FRET/донор, и, таким образом, другое название этого метода — FRET на основе соотношения. По мере увеличения сигнала FRET сигнал донора снижается, и соотношение FRET/донор будет увеличиваться.

Сенсибилизированная эмиссия, вероятно, является наиболее часто используемой формой FRET-микроскопии, поскольку ее можно проводить на стандартном широкопольном микроскопе, что делает ее доступной. Поскольку сбор изображений выполняется быстро, он также идеально подходит для микроскопии живых клеток. Для широкопольной сенсибилизированной эмиссионной FRET-микроскопии требуются три флуоресцентных куба: куб CFP, куб Venus и куб FRET (содержащий CFP-фильтр возбуждения, дихроичное зеркало для возбуждения CFP и эмиссионный фильтр Venus). Если доступны колеса фильтров возбуждения и излучения, то требуются два куба фильтров, один с дихроичным зеркалом для возбуждения CFP и один с дихроичным зеркалом для возбуждения Венеры.Фильтры возбуждения и эмиссии в колесах фильтров затем поворачиваются на место по мере необходимости.

В представленном здесь протоколе изображения были собраны с использованием CLSM. В этом случае линии возбуждающего лазера изменяются для возбуждения либо CFP, либо Венеры, а характеристики излучения настраиваются для сбора либо CFP, либо флуоресцентного излучения Венеры. Вычисления изображения отношения FRET сенсибилизированной эмиссии одинаковы независимо от того, используется ли для сбора изображений широкопольный микроскоп или CLSM.

Сенсибилизированное излучение Контроль FRET

Для правильного расчета соотношения FRET/CFP необходимы контрольные образцы и контрольные изображения. Ниже приводится описание контрольных образцов, которые требуются и/или рекомендуются (см. сводку необходимых и рекомендуемых образцов для различных методов FRET). Изображения CFP, Venus и FRET должны быть получены с использованием одних и тех же настроек прибора для контрольных и экспериментальных образцов. Для обеспечения стабильности мощности лазера во время визуализации требуется 1-2-часовой период прогрева лазера 42 .

  1. Немеченые клетки . Должны быть получены изображения сигналов CFP, Venus и FRET от немеченых, нетрансфицированных клеток. Это обеспечит меру клеточной автофлуоресценции. Нет необходимости вводить поправку на аутофлуоресценцию, если ее интенсивность составляет <5% по отношению к конкретному сигналу CFP, Venus или FRET. Если аутофлуоресценция составляет более 5%, ее лучше всего скорректировать с помощью протокола спектральной визуализации в шагах 68–75 ПРОЦЕДУРЫ. Этот образец обязателен.

  2. Цитозольные клетки, экспрессирующие CFP .Спектры излучения CFP и Венеры перекрываются, и поэтому часть излучения CFP будет обнаружена в канале изображения FRET (перекрестные помехи излучения), что даст ложноположительный сигнал FRET. Клетки, экспрессирующие только цитозольный CFP, используются для измерения степени перекрестных помех эмиссии CFP и для расчета поправочного коэффициента, который используется для удаления сигнала CFP в изображениях FRET. Этот поправочный коэффициент специфичен для точных настроек прибора. Лучше всего использовать цитозольный белок для управления перекрестными помехами, поскольку кластеризация в клеточных структурах может привести к артефактам FRET из-за высоких локальных концентраций FP.Этот образец обязателен.

  3. Цитозольные Venus-экспрессирующие клетки . FP Венеры часто напрямую возбуждается источником возбуждающего света CFP (перекрестные помехи возбуждения), что приводит к появлению сигнала в канале изображения FRET, который не является прямым результатом FRET между донором и акцептором. Клетки, экспрессирующие только цитозольную Венеру, визуализируются, чтобы скорректировать перекрестные помехи возбуждения и рассчитать поправочный коэффициент для сигнала Венеры в изображении FRET. Опять же, этот поправочный коэффициент зависит от точных настроек прибора.Это также зависит от источника возбуждения, используемого для CFP. Например, перекрестные помехи возбуждения будут более значительными для лазерного возбуждения CFP с длиной волны 458 нм, чем для возбуждения с длиной волны 405 нм (). Этот образец обязателен.

    Важнейшая коррекция перекрестных помех возбуждения и излучения. ( a ) Кривые возбуждения для CFP и Венеры, показывающие перекрестные помехи возбуждения (синяя область) от лазерного излучения с длиной волны 405, 440 или 458 нм. В показанном примере, когда для возбуждения CFP используется 440-нм лазер, большая часть флуоресценции Венеры (изображение Венеры, основанное на прямом возбуждении Венеры светом с длиной волны 514 нм) также возбуждается напрямую, и излучение попадает в FRET канал изображения (изображение FRET).Перекрестные помехи возбуждения Венеры можно скорректировать, рассчитав соотношение между изображением Венеры, когда флуорофор возбуждается напрямую (514 нм) и когда флуорофор возбуждается падающим светом CFP (440 нм) в контрольных клетках, экспрессирующих только Венеру. См. уравнение (1) для более подробной информации. При выполнении измерений FRET используется прямое изображение экспрессии Венеры, возбужденной на длине волны 514 нм, так что доля перекрестных помех прямого возбуждения Венеры может быть вычтена из изображения FRET. ( b ) Излучение CFP сильно перекрывается с излучением Венеры, поэтому часть излучения флуорофора CFP передается и собирается в канале изображения FRET (синяя область кривой).Эти перекрестные помехи излучения будут обширными независимо от того, какой источник света используется для возбуждения CFP. Соотношение сигнала CFP в канале CFP и канале FRET из образца клеток, экспрессирующих только цитозольный CFP, можно использовать для коррекции изображений FRET для перекрестных помех излучения с использованием уравнения (1). Взято с http://www.microscopyu.com/articles/fluorescence/fret/fretintro.html с разрешения.

  4. Несцепленные клетки, экспрессирующие CFP и Venus . Клетки, экспрессирующие как несвязанный донор, так и акцептор, используют в качестве отрицательного контроля.Изображения из этого образца проходят этапы обработки и анализа изображения, и сигнал FRET не должен наблюдаться. Лучше всего использовать белки, которые не располагаются в кластерах или органеллах. Этот образец рекомендуется, но не обязателен.

  5. Связанные клетки, экспрессирующие CFP и Venus . Клетки, экспрессирующие CFP и Venus, соединенные коротким линкером (5-7 а.о.), действуют как положительный контроль FRET, потому что два FP будут находиться в пределах 10 нм друг от друга 43 . Изображения из этого образца проходят этапы обработки и анализа изображения, и результирующее FRET-изображение должно показывать высокий FRET-сигнал.Плазмиды для различных положительных зондов FRET доступны от AddGene (http://www.addgene.org). Этот образец рекомендуется, но не обязателен.

  6. Средства биологического контроля . Мы рекомендуем использовать биологические контроли, которые будут показывать отсутствие или низкий уровень FRET и высокий уровень FRET.

Обработка и анализ сенсибилизированного эмиссионного изображения

Для расчета изображения соотношения FRET/CFP необходимо пройти ряд этапов обработки изображения. Детали шагов будут показаны в протоколе, но здесь будут представлены общие понятия для исправлений.Как и при любой количественной обработке изображений, все изображения должны быть сначала скорректированы для любой неоднородности поля в возбуждении образца и для любой интенсивности фона в изображениях 44 . В нашем случае поле освещения очень однородно, потому что мы используем CLSM с масляным иммерсионным объективом Plan Apo с числовой апертурой ×63/1,4 и коэффициентом увеличения изображения, равным 2. Поэтому коррекция не требуется. Коррекция фона выполняется путем измерения средней интенсивности области интереса на изображении, где нет ячеек, и вычитания этой интенсивности из значения серого каждого пикселя в изображении.Все изображения (FRET Raw , Venus и CFP) необходимо скорректировать на неравномерность фона и поля (при необходимости) перед применением каких-либо расчетов.

Также необходимо рассчитать поправочные коэффициенты для перекрестных помех прямого возбуждения Венеры ( A ) и перекрестных помех излучения CFP ( B ). После этого скорректированное FRET-изображение (FRET Corr ) может быть рассчитано на основе уравнения (1).

F R R E 6 T R F R E T RAW A * Venus — B * C F P

(1)

FRET Raw — исходное изображение FRET, полученное под микроскопом. A представляет собой процент перекрестных помех возбуждения Венеры в изображении FRET, рассчитанный для контрольного образца Венеры. Венера — изображение экспрессии Венеры в образце после прямого возбуждения лазерной линией 514 нм. B — процент перекрестных помех излучения CFP в канале FRET, рассчитанный по контрольному образцу CFP. CFP — изображение образца, собранного в канале CFP. Изображение соотношения затем рассчитывается из уравнения (2):

FRETCFP=[FRETCorr×1000IMax(FRETCorr)CFP×1000IMax(CFP)]×1000

(2)

Числитель — это нормализованное изображение FRET Corr , а знаменатель — это нормализованное изображение CFP. I Max — максимальное значение серого в изображении FRET Corr (числитель) или CFP (знаменатель), которое вычисляется после обработки изображения средним фильтром. Это делается для того, чтобы I Max не соответствовали просто зашумленному пикселю в изображении. Изображения основаны на целочисленных значениях, поэтому коэффициент 1000 включен, чтобы избежать дробной интенсивности пикселей в результирующем изображении соотношения. В качестве альтернативы можно использовать изображение с плавающей запятой.

Небольшие изменения в FRET выделены изображением соотношения, потому что по мере увеличения количества сигнала FRET (увеличение числителя) количество сигнала CFP соответственно уменьшается (уменьшение знаменателя). Максимальная эффективность FRET для FP обычно составляет порядка 10–40%, а расстояние Фёрстера (расстояние, на котором эффективность FRET составляет 50% от максимальной) составляет ~ 5 нм (ссылка 45), в основном из-за физического размера и защиты, которые структура β-бочонка внутри FP предлагает флуорофор 46 .

Изображение соотношения для внутримолекулярного FRET часто выражается без коррекции изображения FRET для перекрестных помех. В принципе, это приемлемо, поскольку уровень экспрессии донора и акцептора всегда равен 1:1. Однако, если перекрестные помехи значительны, изменения в эффективности FRET между образцами могут быть сведены к минимуму и, возможно, не обнаружены. Таким образом, коррекция изображений с использованием уравнений (1) и (2) может сделать тонкие изменения в эффективности FRET более очевидными. В свете этого мы рекомендуем использовать скорректированное изображение FRETC или r даже для внутримолекулярных зондов FRET, особенно при работе со спектрально подобными красителями, такими как CFP и Venus, которые дают значительные перекрестные помехи.

Спектральная визуализация

Спектральная визуализация может использоваться в сочетании с сенсибилизированным излучением. Вместо того, чтобы собирать отдельные изображения CFP и FRET с помощью полосовых фильтров и корректировать их для перекрестных помех излучения CFP, можно собрать весь спектр излучения флуоресценции (; http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/articles/spectralimaging/ введение.html) 47–50 . Крайне важно измерить контрольные спектры только для CFP, только для Венеры и для клеточной автофлуоресценции на изображениях с высоким отношением сигнал-шум (S/N) ().Эти спектральные формы используются в процессе разделения, во время которого алгоритм вычисляет, какая доля сигнала в каждом пикселе изображения приходится на автофлуоресценцию, CFP и излучение Венеры (FRET). После разделения генерируется новый стек изображений с тремя изображениями, по одному для каждого из этих сигналов ().

Спектральная визуализация аутофлуоресценции и зонд CFP-Venus Akind. ( a ) Спектральные изображения зонда Akind, экспрессированного в клетках HT-1080. Спектр измеряли от 421 нм до 645 нм с шагом 10 нм с использованием ×20/0.Объектив 8-NA и возбуждение лазером с длиной волны 405 нм. Масштабная линейка, 100 мкм. ( b ) Эталонные спектры, которые были собраны для клеточной автофлуоресценции (зеленая линия), CFP (голубая линия) и Венеры (желтая линия) и использовались для спектрального разделения стопок лямбда-изображений, таких как показанный в a . ( c ) Несмешанные изображения с по , показывающие аутофлуоресцентные клетки с подгруппой, экспрессирующей зонд Akind FRET. Поскольку возбуждение было только от 405-нм лазера, изображение Венеры является результатом FRET от CFP до флуорофоров Венеры.Масштабная линейка, 100 мкм.

Изображения CFP ( CFP Spec ) и FRET ( FRET Spec ) затем можно использовать для расчета изображения соотношения FRET/CFP с помощью уравнения (2) и подстановки FRET на Corr

. FRET Spec и CFP с CFP Spec . Спектральные изображения по-прежнему необходимо скорректировать с учетом неравномерного освещения, интенсивности фона и перекрестных помех возбуждения Венеры (уравнение (1)), прежде чем можно будет рассчитать изображение отношения.Поправки на перекрестные помехи излучения CFP больше не являются фактором, поскольку сигнал CFP отделяется от изображения FRET в процессе спектрального разделения.

Основным преимуществом спектральной визуализации является повышение чувствительности, поскольку можно обнаружить весь свет, собираемый системой. Однако испускаемый свет должен быть разделен по многим каналам детектора (в данном случае 24), поэтому каждое изображение в наборе спектральных данных может быть зашумленным (). Возможно, потребуется изменить настройки прибора (например,например, более длительное время пребывания пикселя, меньший коэффициент усиления фотоумножителя (ФЭУ), более высокая мощность лазера, усреднение изображения или линии, меньший размер или область изображения), чтобы иметь адекватное соотношение сигнал/шум в каждом канале излучения при измерении всего спектра. Еще одним преимуществом спектральной визуализации является способность удалять вклад клеточной автофлуоресценции, которая может быть высокой в ​​определенных типах клеток и небольших организмах. Основным недостатком спектральной визуализации является то, что требуется специализированное конфокальное оборудование.Используемая здесь система имеет детектор ФЭУ с 32 матрицами, и, таким образом, все 24 изображения собираются одновременно, что позволяет быстро получать изображения и за один проход лазерного возбуждения. Следует отметить, что некоторые конфокальные системы спектральной визуализации используют щелевое сканирование с одним или двумя детекторами ФЭУ. Спектральная визуализация в этих системах выполняется медленно, поскольку одновременно можно отображать только одно или два спектральных окна. Кроме того, образец необходимо сканировать несколько раз для каждого спектрального окна, что увеличивает фотообесцвечивание и фототоксичность, что делает эти системы менее подходящими для визуализации в реальном времени.

Анизотропия флуоресценции

Анизотропия флуоресценции может использоваться для определения скорости вращения флуорофоров 51 . Высокая анизотропия указывает на медленное вращение флуорофора, тогда как низкая анизотропия указывает на быстрое вращение. Если флуорофор возбуждается поляризованным светом, и флуорофор вращается в течение времени, пока молекула находится в возбужденном состоянии, то разница между полярностью испускаемого и возбуждающего света даст информацию о том, насколько сильно флуорофор повернулся, пока молекула находится в возбужденном состоянии. молекула находилась в возбужденном состоянии 52 .Флуорофор внутри FP содержится в большой β-цилиндрической структуре 53 , и, таким образом, молекула не вращается заметно в течение нескольких наносекунд, пока флуорофор находится в возбужденном состоянии 52 . Однако, если флуорофор подвергается FRET, полярность испускаемого света будет зависеть от ориентации акцепторного флуорофора. Поэтому, если донор возбужден и испускает флуоресценцию напрямую, полярность не меняется, но если донор отдает свою энергию акцептору, происходит изменение полярности и уменьшение анизотропии.Чтобы выполнить FRET на основе анизотропии флуоресценции, источник света должен быть поляризован таким образом, чтобы флуорофоры определенной полярности (горизонтальной или вертикальной) возбуждались избирательно. Лазеры, входящие в состав CLSM, по своей природе поляризованы. Для широкопольных систем между источником света и образцом 52 помещается поляризационный фильтр. Затем перед детектором помещают переменный поляризатор и получают два изображения испускаемого акцептором света. Первое изображение представляет излучение донора, параллельное свету возбуждения ( I ), а второе изображение представляет излучение донора, перпендикулярное падающему поляризованному свету ( I ).Анизотропия ( r ) рассчитывается по уравнению (3). Более низкая анизотропия указывает на более высокий FRET.

r=I‖−I⊥I‖+2I⊥

(3)

Основные преимущества FRET на основе анизотропии заключаются в том, что измерения могут быть быстрыми; кроме того, добавление поляризаторов в систему относительно недорого. Эта скорость делает его идеальным для микроскопии в реальном времени 54 или скрининга с высоким содержанием 55 . Основным недостатком является то, что он не очень чувствителен к эффективности FRET.Таким образом, он может давать качественный результат FRET или не FRET, но его нельзя использовать для измерения небольших изменений FRET от образца к образцу или в одной ячейке.

Микроскопия для визуализации времени жизни флуоресценции (FLIM)

Время жизни флуоресценции молекулы — это среднее время, которое она проводит в возбужденном состоянии, прежде чем испустить фотон флуоресценции и вернуться в основное состояние. Это время жизни сильно зависит от локальной среды, окружающей флуорофор, и чувствительно к показателю преломления среды 56 , рН 57 , присутствию ионов поблизости или присутствию акцепторной молекулы.В отличие от интенсивности флуоресценции время жизни не зависит от концентрации флуорофора и менее подвержено фотообесцвечиванию.

FLIM — это метод визуализации, который создает изображение на основе пространственного распределения времени жизни флуорофора в различных местах образца, а не интенсивности флуорофора 58,59 . Время жизни флуоресценции флуорофора зависит как от излучательных (т.е. флуоресценции), так и от безызлучательных процессов, включая тушение флуоресценции донора с помощью FRET 8 .В отличие от сенсибилизированного излучения, FLIM требует только измерения времени жизни донорного флуорофора, и поэтому необходимо собирать только изображения флуоресценции CFP.

Счет одиночных фотонов с временной корреляцией (TCSPC) обычно используется для измерения времени жизни флуоресценции. Этот метод основан на импульсном лазерном источнике света, возбуждающем образец с высокой частотой, и детекторе, который измеряет время, необходимое для испускания каждого фотона после импульса. Общее количество фотонов, отображаемое в разных интервалах времени, создает кривую затухания (зеленая и красная кривые).Эта кривая затухания также свернута функцией отклика прибора (черная кривая), которую необходимо измерить и отделить от кривой затухания флуорофора (подробные методы можно найти в Sun et al , 60 или Szabelski et al ). , 61 ) перед построением кривой для измерения времени жизни флуоресценции. Системы FLIM обычно связаны с CLSM и генерируют изображение времени жизни флуоресценции для каждого местоположения пикселя (). Пространственное бинирование обычно необходимо для получения достаточного количества фотонов, чтобы соответствовать кривой затухания времени жизни для каждого местоположения пикселя.

Анализ FRET-FLIM цитозольного GFP и FRET-положительного зонда GFP-mCherry, а также влияние локального флуорофорного окружения. ( a ) Репрезентативные кривые затухания TCSPC для цитозольного GFP (зеленый) или FRET-положительного зонда GFP-mCherry (красный) вместе с функцией инструментального ответа (IRF; черный). Обратите внимание на более крутой наклон или более короткое время жизни GFP для GFP-mCherry, что указывает на то, что происходит FRET. ( b ) FLIM-изображения (пространственное распределение значения времени жизни) времени жизни флуоресценции GFP в клетках HEK-293, экспрессирующих цитозольный GFP или FRET-положительный зонд GFP-mCherry.Желтый и красный представляют собой длительное время жизни цитозольного GFP, тогда как зеленый и синий показывают сокращение времени жизни из-за FRET между GFP и mCherry. Масштабная линейка, 10 мкм. ( c ) Средние значения продолжительности жизни для клеток, экспрессирующих либо цитозольный GFP, либо FRET-положительный GFP-mCherry, показаны для указанных условий окружающей среды: живые клетки в соответствующей питательной среде (живые), фиксированные клетки, помещенные в PBS (фиксированные), ProLong Gold (ПроЛонгГолд) или Fluoro-Gel (Флуоро-Гель) монтажная среда. ( d ) Соответствующая эффективность FRET для клеток, экспрессирующих FRET-положительный зонд GFP-mCherry, рассчитанная с использованием уравнения (4).Фиксированные образцы имеют аналогичный срок службы и эффективность FRET по сравнению с живыми образцами, в то время как те же параметры, измеренные в образцах, помещенных в ProLong Gold или Fluoro-Gel, сильно зависят от процедуры установки. Столбики погрешностей представляют собой sem. по 5–7 ячеек для каждого состояния.

Когда присутствует акцепторная молекула, FRET, который представляет собой процесс тушения, снижает возбужденные состояния донорного флуорофора, тем самым сокращая время жизни. Например, когда EGFP экспрессируется отдельно, его время жизни больше, чем когда он связан с mCherry коротким аминокислотным линкером.Это изменение срока службы видно на кривых времени жизни TCSPC (). mCherry FP действует как акцептор, происходит FRET, а время жизни флуоресценции EGFP значительно сокращается (4). Необходимо соблюдать осторожность при проведении экспериментов FLIM на фиксированных образцах, поскольку локальное окружение флуорофора может резко изменить время жизни флуоресценции донора. Фактически, когда образцы, экспрессирующие EGFP, монтируются с использованием среды ProLong Gold или Fluoro-Gel, время жизни флуоресценции уменьшается в отсутствие акцептора (10).В этих условиях изменения времени жизни флуоресценции в присутствии акцептора (mCherry) полностью маскируются (), а эффективность FRET минимальна и составляет всего ~5% (). FLIM-FRET определяется путем расчета эффективности передачи энергии ( E FRET ) на основе информации о сроке службы следующим образом:

где τ DA — среднее время жизни донора в присутствии акцептора, а τ D — среднее время жизни одного донора.

FLIM также может быть выполнен с использованием методов частотной области, в которых изменение частоты и амплитуды испускаемого света по отношению к свету возбуждения отражает величину возникающего FRET 62 . Для сравнения TCSPC и FLIM в частотной области см. работу Gratton et al . 63 .

Подводные камни FRET

Небольшие изменения интенсивности

Следует отметить, что даже высокоэффективные внутримолекулярные зонды FRET, разработанные с двумя FP, будут давать только небольшую эффективность FRET в 10–40% (http://micro.magnet.fsu.edu/primer/techniques/fluorescence/fret/fretintro.html). Эти небольшие значения интенсивности могут быть сложными для измерения с помощью флуоресцентной микроскопии. Это особенно верно для исследований сенсибилизированного излучения спектрально подобных зондов (необходимых для FRET), где вклад перекрестных помех возбуждения и излучения может быть значительно выше, чем сигналов FRET. Следовательно, изображения должны собираться с высоким отношением сигнал/шум, математические операции должны выполняться тщательно, а инструменты должны работать хорошо.Контроль качества инструментов имеет решающее значение 42 . Например, если мощность лазера колеблется в пределах 10-20% во время получения изображения и между последовательными изображениями, то сигналы FRET могут быть потеряны.

Ложноотрицательные результаты

Если два белка или внутримолекулярный зонд не дают никакого сигнала FRET, существует несколько возможных причин — кроме того факта, что белки не взаимодействуют или белок не меняет конформацию — для отсутствия сигнал ФРЕТ.Возможно, что два флуорофора недостаточно близки, чтобы взаимодействовать, несмотря на взаимодействие белков или изменение конформации зонда. Также возможно, что флуорофоры расположены близко друг к другу, но их диполи не выровнены должным образом друг относительно друга (). Если они перпендикулярны друг другу, то передачи энергии не произойдет. Наконец, FRET может не возникать из-за тушения флуоресценции, вызванного местными условиями (например, рН, высокой концентрацией красителя, монтажной средой) 59,64 .Поэтому отрицательные результаты FRET не очень информативны.

Ложноположительные результаты

Уровни экспрессии FP должны поддерживаться на физиологически релевантных уровнях, чтобы избежать биологических изменений из-за избыточной экспрессии. Кроме того, при высоких концентрациях белка в локализованной области FRET может возникать между соседними, невзаимодействующими флуорофорами, что может давать ложноположительные сигналы FRET 23 .

Методы FRET: преимущества и недостатки

Акцепторное фотообесцвечивание является простым и должно проводиться для всех экспериментов FRET.Основным недостатком фотообесцвечивания акцепторов является то, что это необратимый анализ конечной точки.

Преимущество сенсибилизированного излучения заключается в быстром сборе изображений, что делает его легко применимым для измерений живых клеток. Он также доступен по цене, поскольку может быть реализован на относительно недорогом широкопольном микроскопе, оснащенном соответствующими фильтрующими кубами. Важно отметить, что сигнал FRET слаб по сравнению с перекрестными помехами; поэтому важно собирать изображения с высоким отношением сигнал/шум и тщательно выполнять коррекцию изображений.Это требует большого количества контрольных образцов и изображений для обширных этапов обработки изображений. В этом случае результирующие FRET-изображения зашумлены, так как шум вносится на каждом этапе обработки изображения.

Измерения FRET на основе анизотропии выполняются очень быстро, что делает их идеальным выбором для задач высокопроизводительной микроскопии с использованием FRET 37,52,54 . Анизотропия также доступна по цене, требуя только источника поляризованного света и переменного поляризатора перед детектором на основе камеры.В общем, измерения анизотропии идеально подходят для получения качественных результатов типа FRET или без FRET, но не обеспечивают высокоточной эффективности FRET. При этом, если анизотропия комбинируется с FLIM, могут быть обнаружены тонкие изменения в эффективности FRET и может быть получено много информации о белок-белковых взаимодействиях 65 .

FLIM очень чувствителен и относительно не зависит от концентрации акцептора и донора. Он также менее чувствителен к обесцвечиванию флуорофорами, что со временем дает более точные результаты.FLIM-FRET также может оценить процент взаимодействующих и невзаимодействующих популяций доноров, параметр, который не может быть измерен с помощью большинства подходов, основанных на интенсивности. Однако сбор данных для TCSPC FLIM происходит медленно (минутная временная шкала), что затрудняет его применение к живым образцам при физиологических температурах. FLIM требует дорогостоящего узкоспециализированного оборудования и более чувствителен ко многим аспектам окружающей среды. Это включает в себя монтажную среду, температуру и местное окружение флуорофоров.

Разработка протокола

В этом протоколе содержится информация о том, как проводить FRET-анализ с использованием зонда Akind путем фотообесцвечивания акцептора, сенсибилизированной эмиссии и спектральной визуализации на CLSM. Ранее мы использовали метод сенсибилизированной эмиссии, чтобы охарактеризовать эффекты адаптерного белка APPL1 на активность Akt 1 . Экспрессия APPL1 в клетках HT-1080 приводила к существенному снижению общего количества активного Akt, что определялось снижением сигнала Akind FRET.Кроме того, с помощью линейного сканирования мы показали, что экспрессия APPL1 приводит к снижению активности Akt именно на краю клетки, где Akt обычно активируется. Протокол предоставляет пошаговые инструкции по необходимым контрольным образцам, обширной коллекции изображений и поправкам, необходимым для измерений сенсибилизированного излучения. Также особое внимание уделяется корректировкам обработки изображений и подробностям о том, как получить точные результаты изображения соотношения. Ранее были опубликованы некоторые протоколы по различным аспектам FRET, включая биосенсоры 25,26,65,66 ; мономолекулярные методы 67 ; белок-белковые взаимодействия 60,68,69 ; измерение цитозольных металлов, таких как цинк 70 ; и исследования структуры ДНК 71 и кинетики 72 .Однако, насколько нам известно, это первый протокол FRET, предоставляющий пошаговые инструкции по выполнению спектральной визуализации FRET. Условия, используемые во всех протоколах, могут применяться как к фиксированным, так и к живым клеткам. В частности, настройки CLSM, используемые для сенсибилизированного излучения, оптимальны для минимального повреждения образца (т. е. фототоксичности), что необходимо для приложений с живыми клетками. Фактически, основное преимущество одноцепочечных внутримолекулярных зондов FRET заключается в том, что их можно использовать для измерения динамических изменений активации белков в живых образцах с высоким пространственным разрешением.

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


Настройка браузера на прием файлов cookie

Существует множество причин, по которым файл cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее распространенные причины:

  • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки браузера, чтобы принять файлы cookie, или спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
  • Ваш браузер спрашивает, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файл cookie.
  • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Попробуйте другой браузер, если вы подозреваете это.
  • Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы это исправить, установите правильное время и дату на своем компьютере.
  • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Предоставить доступ без файлов cookie потребует от сайта создания нового сеанса для каждой посещаемой вами страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в файле cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файле cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, если вы не решите ввести его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступ к остальной части вашего компьютера, и только сайт, создавший файл cookie, может его прочитать.

Протокол использования биосенсоров Förster Resonance Energy Transfer (FRET)-force для измерения механических сил в ядерном комплексе LINC.

штаммов E. coli , экспрессирующих сенсорную ДНК, отбирали из планшетов LB/Ampicillin и амплифицировали в жидком бульоне LB. После амплификации векторов плазмиды ДНК очищали в буфере TRIS-EDTA с использованием стандартного имеющегося в продаже набора для выделения ДНК.С помощью спектрофотометра очищенную ДНК количественно определяли до стандартной концентрации мкг/мл (, рис. 1A, , дни 1-2).

Используя фибробласты NIh4T3, клетки выращивали до 70-90% слияния в 6-луночной пластиковой чашке для культивирования клеток. Для встраивания плазмидной ДНК в клетки NIh4T3 проводили опосредованную липидами плазмидную трансфекцию. Коммерчески доступный реагент для трансфекции (см. Таблицу материалов ) использовали в качестве липидного сосуда для ДНК. Два повтора сенсоров Nesprin-TS и Nesprin-HL трансфицировали в 4 лунки с клетками (, рисунок 1B, ).При подготовке к FRET-визуализации отдельные флуорофорные конструкции mTFP1 и venus трансфицировали в клетки NIh4T3 (, рис. 1B, ). После трансфекции клетки переносили в чашки для просмотра со стеклянным дном, совместимые с инвертированными конфокальными микроскопами с большим увеличением.

Прежде чем приступить к конфокальной визуализации, для проверки эффективности трансфекции использовали простой инвертированный широкопольный флуоресцентный микроскоп. Используя объектив 10X с числовой апертурой 0,25, многие клетки в типичном поле зрения экспрессировали Nesprin-TS (, рис. 2, ).Как правило, датчик локализован вокруг ядерной оболочки, что соответствует эндогенной локализации Nesprin-2G 2 . Датчик контроля без силы, Nesprin-HL, следовал аналогичному паттерну экспрессии 2 .

После подтверждения эффективности трансфекции сенсоров Nesprin TS и HL живые клетки, экспрессирующие одиночные флуорофорные конструкции (mTFP1 или venus), визуализировали с помощью инвертированного конфокального микроскопа. Используя режим спектрального обнаружения, mTFP1 и спектральные отпечатки Венеры были записаны в базу данных спектрального разделения (, рисунок 3, , Arrow-2 и , рисунок 4A, ).После снятия отпечатков пальцев параметр захвата был переключен в режим разделения с mTFP1 и спектрами Венеры, загруженными в качестве компонентов (, рис. 4D, ). Необработанные изображения были получены в виде стопок изображений со спектральным разрешением (, рис. 4, ).

Наконец, стопки изображений со спектральным разрешением были импортированы в программное обеспечение с открытым исходным кодом ImageJ для обработки. Изображения были предварительно обработаны, и изображения соотношений были рассчитаны с использованием установленных процедур 15 .

Поскольку коэффициент FRET является относительным показателем, каждый эксперимент должен сравнивать два или более условий.Кроме того, поскольку настройки детектора лазера и камеры могут влиять на FRET, все условия должны быть получены в одном и том же сеансе визуализации. Часто мы используем нечувствительный к силе безголовый или бесхвостый элемент управления, который представляет собой элемент управления с нулевой силой, в качестве основы для наших экспериментов. Поскольку изображения с соотношением FRET могут быть шумными, часто необходимо делать несколько изображений (5-20) для каждого условия. В условиях, когда существуют большие различия в FRET, это будет визуально различимо на изображениях отношения FRET.Наиболее резкое различие в FRET для датчика натяжения Nesprin было между неструктурированными и удлиненными ячейками (, рис. 5, ). Хотя между клетками существуют различия, изменение FRET между двумя состояниями настолько резкое, что дальнейший анализ может не потребоваться. Однако другие состояния часто имеют минимальные изменения FRET; они могут быть визуально неразличимы между отдельными изображениями, а скорее требуют анализа данных в совокупности. Чтобы определить, являются ли эти изменения значительными, рассчитывается медианный коэффициент FRET для каждого изображения и визуально выражается в виде набора гистограмм.Сравнивая гистограммы между условиями, становится легче увидеть более тонкие изменения FRET между экспериментальными группами. В рис. 6A и 6B гистограммы FRET каждой отдельной ячейки представлены цветом на гистограмме с накоплением. Клетки, обработанные каликулином А (, фигура 6B, ), демонстрируют сдвинутую влево гистограмму FRET по сравнению с клетками, обработанными ингибитором миозина ML7 (, фигура 6A, ).


Рис. 1: Экспериментальная блок-схема, основанная на времени. ( A ) Начиная с полученной сенсорной плазмидной ДНК, векторов E. coli трансформируют ДНК, отбирают и амплифицируют (дни 1-2). Из концентрированного бульона E. coli LB выделяют и определяют количество плазмидной ДНК (день 3). Используя очищенные плазмиды ДНК, фибробласты NIh4T3 трансфицировали в формате с шестью лунками ( B ) и переносили на чашки со стеклянным дном, совместимые с инвертированным конфокальным микроскопом (день 3). Чтобы убедиться в успехе трансфекции, клетки просматривают под широкопольным флуоресцентным микроскопом, оснащенным соответствующими наборами фильтров (день 4).В зависимости от успешной трансфекции клетки визуализируют на конфокальном микроскопе, оснащенном спектральным детектором. Используя спектральное разделение, каналы mTFP1 и Венеры разделяются во время сбора данных и сохраняются в виде стопок изображений со спектральным разрешением (дни 4-5). Наконец, изображения предварительно обрабатываются в ImageJ и вычисляются соотношения изображений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой фигуры.


Рисунок 2: Репрезентативное изображение трансфицированных фибробластов NIh4T3. ( A ) 10-кратное увеличение трансфицированных фибробластов NIh4T3, экспрессирующих Nesprin-TS, с использованием набора фильтров GFP. ( B ) Покомпонентное изображение ограничительной рамки из части A. Сенсорная экспрессия следует за ядерной оболочкой и часто распространяется в цитоплазму. ( C ) Nesprin-TS и -HL Control и то, как они связываются с доменами связывания актина и SUN. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой фигуры.


Рис. 3: Учебное пособие по спектральному фингерпринтингу с использованием программного обеспечения Confocal. Нормализованные спектры излучения, полученные для 20-пиксельных радиусов в выделенных областях интереса, очерченных цветными перекрестиями. (Стрелка-1) Режим спектрального обнаружения для захвата изображения. (Стрелка-2) Настройка «Spectral Unmixing» для добавления нормализованных спектров в базу данных спектров. (Стрелка-3) Частота возбуждения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой фигуры.


Рис. 4: Разделение спектров в реальном времени и вывод программного обеспечения Confocal. ( A ) Критические параметры изображения для воспроизведения живых несмешанных изображений.(Стрелка-1) Частота возбуждения. (Стрелка-2) Живой режим спектрального разделения. ( B ) Изображение ядер в несмешанном канале Венеры. ( C ) Изображение ядер в несмешанном канале mTFP1. ( D ) Комбинированное изображение Венеры и mTFP1. (Стрелка-3) Ядерная мембрана клетки, в которой экспрессируется Несприн-ТС. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой фигуры.


Рис. 5: Nesprin-TS Соотношение FRET в клетках почки собаки Madin-Darby с рисунком и без рисунка (MDCK).Клетки MDCK, которые стабильно экспрессируют Nesprin-TS, визуализировали на линиях фибронектина шириной 10 мкм ( A ) или мембранах из полидиметилсилоксана без рисунка (PDMS) ( B ). Ядерные мембраны визуально маскировали и переводили в коэффициенты FRET. Цветная полоса шкалы представляет амплитуду отношения FRET для неструктурированных и структурированных ядер. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой фигуры.


Рис. 6: Обработанные ратиометрические FRET-изображения клеток, экспрессирующих Nesprin-TS, и гистограммный анализ агрегированных данных. ( A ) Репрезентативная, нормализованная суммированная гистограмма изображений отношения FRET для Nesprin-TS, обработанного ингибитором миозина ML7, с цветовой кодировкой ядер отдельных клеток. ( B ) Репрезентативная, нормализованная суммированная гистограмма изображений соотношения FRET для Nesprin-TS, обработанного каликулином А, активатором клеточной сократимости. Легенда соотносит каждое анализируемое ядро ​​с его положением на гистограмме. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Требуется подписка.Пожалуйста, порекомендуйте JoVE вашему библиотекарю.

(PDF) ДНК-конструкции Cy3/Cy5 с внутренней меткой демонстрируют значительно повышенную фотостабильность в экспериментах FRET с одной молекулой

Nucleic Acids Research, 2014 11

Тиннефельд, П. (2012) Фотофизика

флуоресцентных зондов для биофизики одиночных молекул и

изображений сверхвысокого разрешения. Анну. Преподобный физ. хим., 63, 595–617.

14. Расник И., МакКинни С.А., Ха Т.Расник, И., МакКинни, С.А.,

и Ха, Т. (2006) Немигающая и долговечная флуоресцентная визуализация одиночной молекулы

. Нац. Методы, 3, 891–893.

15. Aitken, CE, Marshall, RA, and Puglisi, JDAitken, CE,

Marshall, RA, and Puglisi, JD (2008) Система поглощения кислорода

для улучшения стабильности красителя в одиночной молекуле

флуоресцентные эксперименты. Биофиз. Дж., 94, 1826–1835 гг.

16. Дэйв Р., Терри Д.С., Манро Дж.B., and Blanchard, S.C.Dave, R.,

Terry, D.S., Munro, J.B., and Blanchard, S.C. (2009) Mitigating

нежелательных фотофизических процессов для улучшения флуоресцентной визуализации одиночных молекул

. Биофиз. Дж., 96, 2371–2381.

17. Грюнвелл, Дж. Р., Гласс, Дж. Л., Лакост, Т. Д., Дениз, А. А., Чемла,

Д. С., и Шульц, П. Г. Гранвелл, Дж. Р., Гласс, Дж. Л., Лакост, Т. Д.,

Дениз, А. А., Чемла, Д.С. и Шульц, П.Г. (2001) Мониторинг

конформационных флуктуаций шпилек ДНК с использованием однопарного

флуоресцентного резонансного переноса энергии.Варенье. хим. Соц., 123,

4295–4303.

18. Cordes, T., Vogelsang, J., and Tinnefeld, P.Cordes, T., Vogelsang, J.,

и Tinnefeld, P. (2009) О механизме действия Trolox как антимигающего

и антиобесцвечивающего реагент. Варенье. хим. Соц., 131, 5018–5019.

19. Левитус М. и Ранджит С. Левитус М. и Ранджит С. (2011) Цианиновые

красители в биофизических исследованиях: фотофизика полиметиновых

флуоресцентных красителей в биомолекулярных средах.Q. Rev. Biophys., 44,

123–151.

20. Luo, G., Wang, M., Konigsberg, W.H., и Xie, X.S.Luo, G., Wang,

M., Konigsberg, W.H., и Xie, X.S. (2007) Флуоресцентный анализ одиночной молекулы и ансамбля

для функционально важного

конформационного изменения в ДНК-полимеразе Т7. проц. Натл. акад.

Науч. США, 104, 12610–12615.

21. Муджумдар Р.Б., Эрнст Л.А., Муджумдар С.Р., Льюис С.Дж. и

Ваггонер А.С. Муджумдар Р.Б., Эрнст, Л.А., Муджумдар, С.Р.,

Льюис, С.Дж., и Ваггонер, А.С. (1993) Маркировка цианиновым красителем

реагенты: сульфоиндоцианинсукцинимидиловые эфиры. Биоконж. хим.,4,

105–111.

22. Грубер, Х.Дж., Хан, К.Д., Када, Г., Ринер, К.К., Хармс, Г.С.,

Арер, В., Дакс, Т.Г., и Кнаус, Х.-Г. Грубер, Х.Дж., Хан, CD,

Када, Г., Ринер, К.К., Хармс, Г.С., Арер, В., Дакс, Т.Г., и

, Кнаус, Х.-Г. (2000) Аномальное усиление флуоресценции Cy3

и Cy3.5 по сравнению с аномальной потерей флуоресценции Cy5 и Cy7 при ковалентном связывании

с IgG и нековалентном связывании с авидином. Биоконж.

Chem., 11, 696–704.

23. Campos, LA, Liu, J., Wang, X., Ramanathan, R., English, DS,

и Mu˜

noz, V.Campos, LA, Liu, J., Wang, X ., Ramanathan, R.,

English, DS, и Mu˜

noz, V. (2011) Стратегия фотозащиты для

микросекундной разрешающей способности флуоресцентной спектроскопии одиночных молекул.

Нац. Методы, 8, 143–146.

24. Альтман, Р.Б., Терри, Д.С., Чжоу, З., Чжэн, К., Геггер, П., Колстер,

Р.А., Чжао, Ю., Джавич, Дж.А., Уоррен, Д.Д., и Бланшар,

SCAltman, RB, Terry, DS, Zhou, Z., Zheng, Q., Geggier, P.,

Kolster, RA, Zhao, Y., Javitch, JA, Warren, JD, and Blanchard,

SC (2011) Производные цианина флуорофора с повышенной фотостабильностью

. Нац. Методы, 9, 68–71.

25. Nord´

en, B., Роджер, А., и Даффорн, Т. Норд’

en, Б., Роджер, А., и

Даффорн, Т. (2010) В: Линейный дихроизм и круговой дихроизм,

Oxford University Press, Oxford . п. 1997.

26. Мельхиор, В.Б. и фон Хиппель, П.Х.Мельхиор, В.Б. и Von

Hippel, P.H. (1973) Изменение относительной стабильности пар оснований dA·dT и

dG·dC в ДНК. проц. Натл. акад. науч. США, 70, 298–302.

27. Ранджит С., Гурунатан К. и Левитус М. Ранджит С., Gurunathan,

K., and Levitus, M. (2009) Фотофизика флуоресцентных

модификаций ДНК: уменьшение неопределенностей в FRET. Дж. Физ. хим.

Б, 113, 7861–7866.

28. Хосе Д., Датта К., Джонсон Н.П. и фон Хиппель П.Х. Хосе Д.,

Датта К., Джонсон Н.П. и фон Хиппель П.Х. (2009) Спектроскопические

исследования позиционно-специфических «дышащих» флуктуаций ДНК на

репликационных вилках и соединениях праймер-матрица. проц.Натл. акад.

Науч. США, 106, 4231–4236.

29. Алтан-Бонне Г., Либчабер А. и Кричевский О. Алтан-Боннет,

Г., Либчабер А. и Кричевский О. (2003) Динамика пузыря в

двойных скрученная ДНК. физ. Rev. Lett., 90, 138101.

30. фон Хиппель, П. Х., Джонсон, Н. П., и Маркус, А. Х. Фон Хиппель, П. Х.,

Джонсон, Н. П., и Маркус, А. Х. (2013) Пятьдесят лет ДНК

«дыхание»: размышления о старых и новых подходах. Биополимеры,99,

923–954.

31. Морейра Б.Г., Ю Ю., Бельке М.А. и Овчарзи Р.Морейра,

Б.Г. Ю Ю., Бельке М.А. и Овчарзи Р. (2005) Эффекты

 флуоресцентные красители, гасители и оборванные концы на стабильности ДНК-дуплекса

. Биохим. Биофиз. Рез. Комм., 327, 473–484.

32. Fegan, A., Shirude, P.S., and Balasubramanian, S.Fegan, A.,

Shirude, P.S., and Balasubramanian, S. (2008) Жесткий цианиновый краситель

Метки нуклеиновых кислот. хим. коммун., 2004–2006 гг.

33. Цзяо Г.-С. и Берджесс, К. Цзяо, Г.-С. и Burgess, K. (2003)

Олигонуклеотиды с сильно флуоресцентными группами ␲-Конъюгированные с нуклеотидным основанием

: синтезы, температуры плавления и конформация.

Биоорг. Мед. хим. Lett., 13, 2785–2788.

34. Икбал, А., Арслан, С., Окумус, Б., Уилсон, Т.Дж., Жиро, Г., Норман,

Д.Г., Ха, Т., и Лилли, ДМикбал, А., Арслан, С., Окумус Б.,

Уилсон Т.Дж., Жиро Г., Норман Д.Г., Ха Т. и Лилли Д.М.

(2008) Ориентационная зависимость флуоресцентного переноса энергии

между Cy3 и Cy5, присоединенными на конце к двухцепочечным нуклеиновым

кислотам. проц. Натл. акад. науч. США, 105, 11176–11181.

35. Маркхэм, Н.Р. и Zuker, M.Markham, N.R. и Zuker, M.

(2005) Веб-сервер DINAMelt для предсказания плавления нуклеиновых кислот.

Nucleic Acids Res., 33, W577–W581.

36. Фогельсанг Дж., Каспер Р., Штайнхауэр К., Person, B., Heilemann, M.,

Sauer, M., и Tinnefeld, P.Vogelsang, J., Kasper, R., Steinhauer,

C., Person, B., Heilemann, M., Зауэр, М., и Тиннефельд, П. (2008) Система восстановления и окисления

сводит к минимуму фотообесцвечивание и мерцание

флуоресцентных красителей. Ангью. Chem., 47, 5465–5469.

37. Льюис, Ф.Д., Бассани, Д.М., Колдуэлл, Р.А., и Унетт, Д.Дж.Льюис,

Ф.Д., Бассани, Д.М., Колдуэлл, Р.А., и Унетт, Д.Дж. (1994) Синглет

состояние цис, транс-фотоизомеризация и интерсистемное скрещивание

1-арилпропенов.Варенье. хим. Соц., 116, 10477–10485.

в библиотеках Университета Орегона 14 марта 2014 г. http://nar.oxfordjournals.org/Загружено с

Fender Japan Jazz Bass P Serial Bass Guitar Ref No 2170


Описание

Здравствуйте! eBay из Японии, поэтому я могу предоставить вам лучший сервис.

Этот товар распродан повсюду в Японии и его очень трудно достать!!

В порядке живой очереди.  

◆ Косметическое состояние

Подробное состояние товара смотрите на фотографиях.

Фендер Япония Jazz Bass P Serial Bass Guitar

P044391

Модель: Jazz Bass

Ширина гайки: 40 ММ

Рост строки: 1 Строка сторона 3 мм / 4 Строка Сторона 3 мм

Аккорд Длина: 860 мм

FRET: 70%

Trush + Неизвестный

Вес: 4026 г

Там вмятины, царапины, покраска для пилинга, Пыль, и чувство использования

PEG: Normal

PU: звуковой выход был подтвержден бывшим владельцем

На ручке может появляться жужжание

Ощущения от использования, такие как царапины, потертости, грязь, вмятины и т.д. видны на всем 90 015

Операционный статус:

Звук: Нормальный

Пожалуйста, подумайте, что ему нужно Техническое обслуживание

◆ Включение

Все вы можете увидеть на этой фотографии будет входить в комплект пакета.

Вы можете наслаждаться воспроизведением музыки.

★ Этот продукт также доступен на других сайтах ЕС. Мы обновим его как можно скорее, но если этот продукт продается на другом сайте ЕС до того, как он будет продан на eBay, нам очень жаль, но мы отменим транзакцию. на этом сайте.

★ Я изучил товар(ы) и включил свои наблюдения как можно точнее в описание выше. Обратите внимание, что некоторые описания могут быть основаны на моем собственном мнении.Пожалуйста, внимательно прочитайте его и поймите состояние товара (ов) перед началом торгов.

Оплата

Пожалуйста, оплатите в течение 3 дней после закрытия аукциона.

Доставка

Доставка по всему миру из Токио. Для товаров с жесткими футлярами мы обычно упаковываем жесткий футляр и содержимое прокладочным материалом (обычно пузырчатой ​​пленкой). Проблем с этим способом доставки пока не было. Однако, если вы хотите, чтобы жесткий футляр был включен в картон, я могу отправить его этим способом, если вы доплатите 10 долларов.Это относится только к продуктам, которые изначально имеют жесткий футляр.

этот товар отправляется в течение 1 рабочего дня после подтверждения оплаты.

(воскресенье и праздничные дни нерабочие дни)

Доставка со страховкой и номером грузоперевозки занимает 4-7 дней.

* Мы не можем использовать службу EMS (Почта Японии) для некоторых стран Центральной Азии (Казахстан, Кыргызстан, Таджикистан и т. д.). Если ваш адрес доставки находится в этих регионах, пожалуйста, свяжитесь с нами перед началом торгов.

Возврат

Возврат принимается ТОЛЬКО в том случае, если товар не соответствует описанию.

Международные покупатели — обратите внимание:

* Импортные пошлины, налоги и сборы не включены в стоимость товара или стоимость доставки. Эти обязанности ответственность покупателей.
* Пожалуйста, свяжитесь с таможней вашей страны, чтобы определить эти дополнительные расходы до торгов/покупки.
* Эти сборы обычно взимаются транспортной (доставочной) компанией или когда вы забираете товар — не путайте их с дополнительными расходами на доставку.
* Мы не отмечаем стоимость товаров ниже их стоимости и не отмечаем товары как «подарки» — правила США и других стран запрещают такое поведение.

Обратная связь:    Обратная связь очень важна для всех участников сообщества.
 Пожалуйста, оставьте отзыв, как только вы получите посылку, мы оставим то же самое для вас. Спасибо!
 Если что-то случилось, пожалуйста, свяжитесь с нами, прежде чем оставить отзыв, мы предложим вам удовлетворительный результат.
 Мы являемся серьезным продавцом и ответим как можно скорее.

Свадебный фотограф Lurnea NSW 2170

Когда речь идет о свадебном фотографе Lurnea, стоимость — не единственное, о чем вы должны думать.Если вам нужны качественные фотографии для вашего свадебного фотографа Lurnea, вам придется учитывать их опыт, оборудование, которое они используют, их стиль фотографии и многое другое, если вы хотите получить наилучшие фотографии. Если вам нужны лучшие услуги, возможно, вам нужно обратить внимание на большее, но в целом это отличное место для начала поиска.

Как долго вы должны нанимать свадебного фотографа Lurnea для вашего большого мероприятия?

Со всем, что требуется от свадебной фотографии, включая изобретательность и терпение, может быть жизненно важно найти профессионала в этой отрасли, чтобы убедиться, что все сделано правильно.Неважно, кого вы выберете для съемки событий вашего большого дня, может быть мудрой идеей подумать о том, как долго вам потребуются их услуги на вашей свадьбе. Каждое событие уникально, поэтому часто бывает жизненно важно хорошенько взглянуть на то, что вы хотите от своих фотографий, чтобы решить, сколько часов вам потребуется, чтобы нанять профессионала. Если вы не знаете, что делать, почему бы не обсудить с вашим фотографом, что, по их мнению, будет лучше всего?

Независимо от того, планируете ли вы свадьбу в Эрлвуде, Амбарвейле или Уоттл-Гроув, обязательно найдите подходящего свадебного фотографа, соответствующего вашим требованиям.С помощью профессионала вы гарантированно получите идеальные фотографии вашего особенного дня.

Сколько фотографий должен дать вам свадебный фотограф Lurnea?

Свадебный фотограф, как правило, должен предложить вам большое количество фотографий высокого качества, которые действительно передают элегантность торжества. Как правило, это будет зависеть от услуг агентства и, прежде всего, от ваших собственных предпочтений и ограничений. В большинстве случаев количество фотографий, которые вы получите, будет согласовано между вами и вашим фотографом еще до мероприятия, так что вам не о чем беспокоиться.Чтобы гарантировать, что обо всем позаботятся должным образом, обязательно воспользуйтесь помощью команды специалистов в индустрии свадебной фотографии.

Нужны ваши фотографии в другом месте? Нет проблем, мы покрываем очень большую территорию и можем помочь запечатлеть ваш особенный день. Fame Park Studios также предоставляет услуги свадебного фотографа в Беверли-Хиллз для тех, кто нуждается в фотосъемке в этом пригороде. Просто свяжитесь с нами, чтобы получить помощь.

Что может быть эффективнее цифровой зеркальной камеры?

Ваши свадебные фотографии часто помогут вам навсегда запомнить этот важный день, поэтому так важно следить за тем, чтобы фотография была сделана должным образом.Есть немало факторов, которые следует учитывать при выборе идеальной камеры, например, хотите ли вы купить зеркальную камеру. Беззеркальные камеры также могут быть хорошим вариантом, поэтому вы можете внимательно изучить преимущества этих устройств. У профессионала в индустрии свадебной фотографии, скорее всего, есть все необходимое, чтобы запечатлеть все важные моменты вашего большого дня, поэтому вам не нужно беспокоиться о том, какую камеру вам следует приобрести.

Делают ли свадебные фотографы Lurnea необработанные снимки?

Для свадебных фотографов необычно предоставлять клиентам необработанные свадебные изображения — и тому есть несколько причин.В общем, вы не можете ни для чего использовать файлы RAW; поэтому без какой-либо работы по редактированию ваши изображения будут практически непригодны для использования. Помимо этого, есть также тот факт, что изображения в формате RAW не совсем закончены, и их необходимо изменить, чтобы они выглядели потрясающе. Когда все будет готово, вы гарантированно получите фотографии, которыми сможете наслаждаться и ценить долгие годы.

Едят ли фотографы на свадьбах Lurnea?

Большинство пар задумаются, когда доберутся до свадебного ресторана, — нужно ли им угостить своего фотографа едой.Как правило, если вы заручитесь помощью профессионала, вы обнаружите, что он увлечен своей работой и сделает все возможное для создания идеальных фотографий. Фотографы обычно выкладываются на полную, поэтому они, вероятно, будут благодарны за то, что у них есть время поесть. Кормить фотографа от вас не требуется, но и вас ничто не останавливает — в общем, выбор за вами.

Как вы могли бы показать свои свадебные фотографии – Lurnea 2170?

Один из лучших способов сохранить особенные моменты вашей свадьбы в памяти и сердце — это сделать фотографии высокого качества, которыми вы будете дорожить вечно.

Leave a Reply

Ваш адрес email не будет опубликован.

2019 © Все права защищены.