В этой структуре ультрафиолетовая флуоресценция наносцинтиллятора LiYF ₄ , легированного Ce ^{III , при облучении вызывает образование электронно-дырочных пар в наночастицах ZnO, что приводит к образованию биотоксичных гидроксильных радикалов.}

Этот метод демонстрирует уменьшенную зависимость от уровней внутриклеточного кислорода за счет интеграции сцинтиллятора и полупроводника в качестве фотосенсибилизатора. Эти наночастицы использовались в качестве сцинтилляционных наночастиц при понижающем преобразовании рентгеновских лучей, чтобы соответствовать энергетической щели полупроводника, чтобы произвести ROS из молекул воды для эффективного взрыва.

Объем опухоли (использовалась линия клеток HeLa) с введенными LSZNP и облучением 8 Гр рентгеновским излучением почти полностью подавлялся за 15 дней.Кроме того, после облучения этих тканей наблюдалась поздняя стадия апоптоза с кариопикнозом, кариорексисом и значительным образованием апоптотических телец. Таким образом, применение этих наночастиц демонстрирует противоопухолевую терапевтическую эффективность. Рентгеновское облучение использовалось при 3 Гр.

Полосы излучения Tb ³⁺ хорошо перекрываются с линиями поглощения протопорфирина PpIX. Следовательно, ожидалась эффективная передача энергии от донора к акцептору и образование синглетного кислорода.Эта комбинация наночастиц генерировала АФК. Исследуемые нанокомпозиты могут быть неплохими кандидатами для применения в XPDT.

Усиление оптической люминесценции, возбуждаемой рентгеновскими лучами, было связано с тем, что уровни энергии Gd ³⁺ лежат между активатором (Ce ³⁺ ) и люминесцентным центром (Tb ³⁺ ), давая начало эффективной передаче энергии. Облучение наночастиц проводили однократной дозой рентгеновского излучения 3 Гр.

Благодаря эффективной передаче энергии возбуждения в конъюгатах они могут действовать как перспективные рентгеновские фотодинамические агенты. Однако при облучении рентгеновскими лучами наблюдались сильные радикалы ОН, улавливаемые наночастицами. Кроме того, напряжение на использованной трубке составляло 30 кВ (20 мА).

Кроме того, наночастицы ZnS: Cu, Co имеют длинное послесвечение, возбуждаемое рентгеновскими лучами, которое используется в качестве непрерывного источника света для активации XPDT. Рентгеновские конъюгаты ZnS: Cu, Co-TBrRh223 очень эффективны для разрушения раковых клеток. Помимо ZnS: Cu, наночастицы Co, облученные рентгеновскими лучами (2 Гр), также могут использоваться для визуализации клеток.Все это указывает на перспективность наночастиц ZnS: Cu, Co для биомедицинских приложений.

2,4. Металлоорганические каркасы как фотосенсибилизаторы

Hf-DBB-Ru был синтезирован сольвотермической реакцией между HfCl ₄ и H ₂ DBBRu с трифторуксусной кислотой в качестве модулятора.Hf-DBB-Ru облучали рентгеновскими лучами 1, 2, 3, 5 или 10 Гр.

Этот MOF был разработан из фотосенсибилизаторов на основе Ru. Катионный каркас продемонстрировал сильное нацеливание на митохондрии. Под воздействием рентгеновского излучения Hf-DBB-Ru успешно генерировал гидроксильные радикалы из вторичных строительных единиц (SBU) Hf ₆ и синглетный кислород из фотосенсибилизаторов DBB-Ru. Нацеленные на митохондрии частицы деполяризовали митохондриальную мембрану, чтобы активировать апоптоз раковых клеток, что привело к значительной регрессии колоректальных опухолевых клеток.Когда объем опухоли достигал 100-150 мм ³ , ткань облучали светом с энергией 180 Дж / см ² (650 нм).

Два нМОФ: 5.15-ди (п-бензоато) порфирин-Hf (DBP-Hf) и 5,10,15,20-тетра (п-бензоато) порфирин-Hf (TBP-Hf) были синтезированы из кластеров Hf и порфирина. фотосенсибилизирующие лиганды.Кластеры Hf поглощают рентгеновские фотоны, вызывая генерацию радикалов OH и ¹ O ₂ фотосенсибилизаторами. nMOFs подвергались рентгеновскому облучению от 0 до 1 Гр.

нМОФ были сконструированы как радиоусилители с использованием электронно-плотных Hf ₆ O ₄ (OH) ₄ и Hf ₁₂ O ₈ (OH) ₁₄ SBU в качестве рентгеновских поглотители для производства АФК.

Hf ₁₂ -DBA продемонстрировал отличное радиоусиление по сравнению с Hf ₆ -DBA. Было высказано предположение, что это связано с повышенным поглощением рентгеновских лучей электронно-плотными кластерами Hf ₁₂ и диффузией гидроксильных радикалов через пористые нанопластинки. Следует отметить, что под действием гамма-лучей Hf ₁₂ -DBA также проявлял большую радиосенсибилизацию, чем HfO ₂ и Hf ₆ -DBA.

Биомедицинская визуализация: принципы, технологии, клинические аспекты, контрастные вещества, ограничения и будущие тенденции в наномедицине

Интеллектуальный нанозонд, реагирующий на опухоль и микросреду, для высокоселективной и эффективной комбинированной терапии

Терапевтические эффекты химиотерапии и фотодинамической терапии (ФДТ) серьезно ограничены гипоксией опухоли и низкой способностью захватывать клетки. Здесь был разработан чувствительный к интеллектуальному микроокружению (TME) нанозонд с использованием реагирующего на pH и разложенного CeO _x / Fe ₂ O ₃ в качестве носителя не только для усиления поглощения клетками. увеличивают эффективность упаковки лекарств и модулируют гипоксию опухоли, а также действуют как акцептор резонансной передачи энергии Ферстера (FRET) и обеспечивают гашение энергии возбужденного фотосенсибилизатора.Из-за полых структур, похожих на ежей, носителя CeO _x / Fe ₂ O ₃ , химиотерапевтический препарат доксорубицин (DOX) и фотосенсибилизатор хлор e6 (Ce6) могут быть совместно загружены для формирования нанозонда CeO _x / Fe ₂ O ₃ -C и D. В нормальной ткани нанозонд CeO _x / Fe ₂ O ₃ -C&D показал слабую цитотоксичность.Попав в TME, CeO _x / Fe ₂ O ₃ нанооболочки начали распадаться, DOX быстро высвобождался в месте опухоли, а CeO _x / Fe ₂ O ₃ продемонстрировал каталазоподобную активность по разложению эндогенного H ₂ O ₂ и продуцированию O ₂ для постоянного преодоления гипоксии in situ .Тем временем Ce6 был преобразован из «молчаливого состояния» в «активированное состояние», генерируя сигнал флуоресценции и синглетный кислород ( ¹ O ₂ ) за счет ослабления эффективности FRET. Таким образом, наше исследование демонстрирует инновационную стратегию повышения способности захвата клеток, коррекции гипоксии опухоли и достижения высокоселективной и специфической комбинированной терапии.

У вас есть доступ к этой статье

Развивающаяся универсальность SAXS: рассеяние рентгеновских лучей в растворе для макромолекулярной архитектуры, функциональных ландшафтов и интегративной структурной биологии

Основные моменты

•

SAXS захватывает архитектуру и динамику для выявления молекулярных ансамблей.

•

Технология SAXS позволяет исследовать ключевые термодинамические и кинетические свойства макромолекул.

•

Высокопроизводительный SAXS обеспечивает многопараметрическую биомолекулярную библиотеку и скрининг лекарств.

•

SAXS становится все более опорой в зарождающуюся интегративную эру структурной биологии.

Малоугловое рассеяние рентгеновских лучей (SAXS) возникло как эффективный интегративный метод для всестороннего анализа макромолекулярных структур и взаимодействий в растворах.За последние два десятилетия SAXS стал основой набора инструментов структурных биологов, предоставляя комплексные измерения молекулярной формы и динамики, которые раскрывают биологическую функцию. Здесь мы обсуждаем развивающуюся теорию, методы и приложения МУРР, которые расширяют область малоуглового рассеяния за пределы простой характеристики формы. SAXS в сочетании с эксклюзионной хроматографией (SEC-SAXS) и методами с временным разрешением (TR-SAXS) теперь обеспечивает высокое разрешение макромолекулярной гибкости и ансамблей, очерчивание биофизических ландшафтов и облегчение высокопроизводительного скрининга библиотек для оценки макромолекулярные свойства и создание возможностей для открытия лекарств.Заглядывая вперед, мы рассматриваем SAXS в эпоху интеграции методов гибридной структурной биологии, его потенциал для освещения клеточных супрамолекулярных и мезомасштабных структур, а также его способность дополнять данные высокопроизводительного биоинформатического секвенирования. По мере того, как достижения в этой области продолжаются, мы надеемся на расширение использования SAXS, основанного на его способности надежно производить механистические идеи для биологии и медицины.

Рекомендуемые статьиЦитирующие статьи (0)

© 2019 Авторы.Опубликовано Elsevier Ltd.

Рекомендуемые статьи

Цитирующие статьи

Рентгеновская фотодинамическая терапия (ФДТ) с системой доставки липосом, нацеленной на митохондрии | Journal of Nanobiotechnology

Получение чистых липосом и липосом, включающих наночастицы золота и VP

Наноносители на основе липосом в этой работе были приготовлены с использованием метода тонкопленочной гидратации [24]. Вкратце, 25 мкл DOTAP (100 мМ) смешивали с 25 мкл DOPC (100 мМ), растворенного в хлороформе, с последующим добавлением 4 мкл раствора VP (3 мМ, растворенного в ДМСО).Для синтеза чистых липосом и липосом, загруженных только наночастицами золота, VP не добавляли в раствор смеси. Затем смесь растворителей упаривали в роторном испарителе (Rotavapor ^® R-300, BÜCHI) в течение 10 минут при 70 ° C. Тонкая липидная пленка формировалась вокруг стенки колбы и затем гидратировалась буфером PBS (pH 7,4) (в случае чистых липосом и липосом, содержащих только VP) или суспензией наночастиц золота (в случае липосом, включающих VP и наночастицы золота. ) при интенсивном перемешивании в течение 30 минут до гомогенизации суспензии (Vortexer, Heathrow Scientific).Суспензию гидратированных липидов выдерживали при комнатной температуре в течение 3 ч для максимального набухания липосом. Затем суспензию экструдировали одиннадцать раз через поликарбонатную мембрану 200 нм в автоматическом экструзионном оборудовании (NanoSizerTM AUTO, T&T Scientific Corporation, США). Полученную суспензию хранили при 4 ° C.

Модификация поверхности липосом с помощью TPP-COOH

ПЭГилированные и TPP-конъюгированные липосомы получали путем пост-вставки мицелл DSPE-PEG (2000) -NH ₂ мицелл в предварительно сформированные липосомы и последующего метода связывания EDC-NHS с небольшими модификациями [ 37].Вкратце, 500 мкл вышеупомянутых липосом и 50 мкл DSPE-PEG (2000) -NH ₂ (0,01 М в дистиллированной воде) совместно инкубировали при 60 ° C в течение 1 ч с последующим 3-кратным центрифугированием (10000 об / мин, 10 мин) с центробежными фильтрами Amicon Ultra 0,5 мл (100 кДа) для удаления свободных молекул. После этого TPP-COOH (10 мг) растворяли в 1 мл буфера MES (pH = 6) с последующим добавлением смеси EDC и NHS (молярное соотношение 1: 1). Раствор выдерживали при комнатной температуре 30 мин при перемешивании. После повышения pH до 7.0–7,4 к активированному раствору ТФП добавляли 200 мкл приготовленной суспензии ПЭГилированных липосом. Смешанный раствор осторожно встряхивали на орбитальном шейкере в течение 4 ч при комнатной температуре. После реакции раствор трижды промывали буфером PBS (11000 об / мин, каждый раз по 10 мин) с помощью центробежных фильтров Amicon Ultra (100 кДа). Конечную суспензию липосомного конъюгата хранили при 4 ° C для будущего использования.

Характеристика липосом

Спектры экстинкции коллоидного раствора чистого золота и приготовленных образцов липосом были измерены с помощью спектрофотометра (Cary 5000 UV – Vis-NIR, Agilent Technologies).Распределение размеров и дзета-потенциалы липосом измеряли с помощью Zetasizer Nano-ZS от Malvern Panalytical Co. Морфологию липосом определяли с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ТЕМ). Для ПЭМ-визуализации образцы липосом готовили путем помещения капли суспензии на медную сетку и сушили на воздухе после отрицательного окрашивания для усиления контраста. Затем высушенные на воздухе образцы получали изображение с помощью системы PHILIPS CM 10 при ускоряющем напряжении 100 кВ. Изображения были получены с помощью камеры Olympus Megaview G10 и программного обеспечения iTEM.

Оценка поколения

¹ O ₂ поколения было обнаружено с помощью зонда SOSG на основе нашей предыдущей работы 1,8 мкл SOSG (500 мкМ) смешивали с 200 мкл суспензии липосом с последующим облучением рентгеновскими лучами в различных дозах (1 Гр, 2 Гр и 4 Гр). Облучение образцов проводили с помощью рентгеновского облучателя в шкафу на 320 кВ (X-RAD 320, Precision X-Ray, Inc.). Сигнал флуоресценции SOSG (длина волны возбуждения / излучения: 488/525 нм) регистрировали до и после рентгеновского излучения в спектрофлуорометре (FluoroMax-4 HORIBA Scientific Co.)

Культура клеток и рентгеновское излучение клеток

Аденокарцинома толстой кишки человека (клетки НСТ116) и нормальные эпителиальные клетки толстой кишки человека (CCD841 CoN) были приобретены из Американской коллекции типовых культур. Клетки HCT116 культивировали в среде McCoy 5A (модифицированной), а клетки CCD841 CoN культивировали в EMEM. Все питательные среды были дополнены 10% FBS и 1% антибиотиком-антимикотиком. Колбы инкубировали при 37 ° C в присутствии 5% CO ₂ увлажненного воздуха. Клетки высевали в соответствующих разведениях в чашки Петри со стеклянным дном для визуализации клеток или 96-луночные планшеты для анализа жизнеспособности клеток.Для экспериментов с рентгеновским излучением клетки облучали с использованием того же рентгеновского облучателя, который описан в оценке поколения ¹ O ₂ .

Визуализация и анализ клеточного поглощения липосом

Клетки HCT116 (3 × 10 ⁴ клеток / мл) высевали в чашки Петри со стеклянным дном и инкубировали при 37 ° C в течение 48 часов перед обработкой суспензией липосом. После удаления культуральной среды клетки инкубировали с суспензией липосом (250 мкМ) в культуральной среде в течение 1 ч, 2 ч и 4 ч.Затем клетки трижды промывали буфером PBS (pH 7,4) для удаления свободных липосом. Чтобы оценить активность липосом в поглощении клетками, перед визуализацией клетки окрашивали реагентом NucBlueTM Live ReadyProbesTM в течение 20 минут. Клетки получали с помощью системы конфокальной лазерной сканирующей микроскопии Olympus FV3000. Для возбуждения ВП использовался лазерный источник на 405 нм.

Для измерений проточной цитометрии после инкубации с суспензией липосом клетки трижды промывали фосфатно-солевым буфером Дульбекко, трипсинизировали, центрифугировали при 3000 об / мин в течение 3 минут и ресуспендировали в DPBS.Затем клетки анализировали с использованием проточного цитометра (анализатор клеток LSRFortessa ™ X-20, BD Biosciences), оснащенного фиолетовым лазером. Программное обеспечение FlowJo использовалось для дальнейшего анализа данных FCM.

Внутриклеточные

Клетки HCT116 культивировали в чашках Петри со стеклянным дном в концентрации 1 × 10 ⁵ клеток / мл. Затем клетки обрабатывали различными образцами липосом (250 мкМ) в культуральной среде в течение 3 часов при 37 ° C с последующим добавлением раствора SOSG (50 мкМ) для дальнейшей инкубации в течение 1 часа).После промывания свежей средой клетки облучали рентгеновскими лучами в различных дозах. Сигнал флуоресценции SOSG регистрировали под конфокальным лазерным сканирующим микроскопом FV3000. Для возбуждения SOSG использовали лазер на 488 нм. Количественный анализ сигнала SOSG был проведен с использованием программного обеспечения ImageJ, которое показало внутриклеточный уровень ¹ O ₂ , генерируемый в различных экспериментальных условиях.

Митохондриальная локализация TPP-конъюгированных липосом

Клетки HCT116 высевали на чашку Петри со стеклянным дном в концентрации 1 × 10 ⁵ клеток / мл в течение 48 часов.После этого клетки инкубировали с суспензией липосом в течение 4 ч. После двукратной промывки PBS клетки были совместно окрашены Mitotracker Red (0,2 мкМ) и реагентом NucBlueTM Live ReadyProbesTM в растворе для визуализации живых клеток при 37 ° C в течение 30 мин. Затем клетки дважды промывали PBS и хранили в растворе для визуализации живых клеток для конфокальной визуализации под конфокальным лазерным сканирующим микроскопом FV3000. Лазерные источники на 405 нм и 561 нм использовались для захвата ядра, VP и MitoTracker, соответственно.Совместную локализацию между TPP-конъюгированными липосомами и лизосомами также подтверждали с использованием LysoTracker ™ Red DND-99 (0,2 мкМ) в тех же экспериментальных условиях вместо MitoTracker ™ Red.

Анализ апоптоза и некроза

Анализы апоптоза и некроза проводили с использованием набора для обнаружения апоптоза / некроза / здоровых. Набор позволяет одновременно визуализировать апоптотические (зеленые), некротические (красные) и здоровые клетки (синие). Клетки HCT116 (1 × 10 ⁵ клеток / мл) сначала высевали на чашки Петри со стеклянным дном в культуральной среде, а затем инкубировали с различными суспензиями липосом в течение 4 часов.После промывания свежей средой клетки облучали рентгеновским излучением 4 Гр и инкубировали еще 48 часов. Клетки дважды промывали PBS и совместно окрашивали Hoechst33342, FITC-Annexin V и Ethidium Homodimer III (EthD-III) из набора в связывающем растворе (5-кратное разведение) при комнатной температуре в течение 15 минут в темноте. Множественные флуоресцентные изображения получали с использованием трех фильтров: (1) Hoechst33342 ( λ _абс / λ _em = 350/461), указывающий на здоровые клетки; (2) FITC ( λ _абс / λ _em = 492/514 нм), представляющий апоптоз, и (3) гомодимер этидия λ _абс / λ _em = 528 / 617 нм), что указывает на некроз.

Анализы жизнеспособности клеток после индуцированной рентгеновскими лучами PDT

Клетки (1 × 10 ⁴ / мл) высевали на 96-луночные планшеты и культивировали в течение 48 часов при 37 ° C. Когда клетки достигли 70% слияния, их разделили на четыре группы: контрольные клетки без обработки, клетки, инкубированные только с липосомами, клетки, обработанные только рентгеновскими лучами, и клетки, обработанные индуцированной рентгеновскими лучами PDT. Через 24 часа после обработки клеточную цитотоксичность оценивали с помощью набора для анализа жизнеспособности клеток, MTS (Promega Corporation, США) в соответствии с его протоколом.Анализы MTS проводили под планшет-ридером (SpectraMax MiniMax 300 Imaging Cytometer, Molecular Devices). Жизнеспособность клеток рассчитывали как процент поглощения необработанных контрольных клеток, который был установлен на 100%.

Оценка митохондриального мембранного потенциала (Δ

После посева клеток HCT116 их соответственно инкубировали с конъюгатами липосома-TPP и неконъюгированными липосомами в клеточной среде в течение 4 часов с последующим рентгеновским исследованием. излучение при 4 Гр.Через 24 часа после обработки клетки окрашивали 5 мкМ зонда JC-1 при 37 ° C в течение 15 минут перед визуализацией флуоресценции. Сигнал флуоресценции JC-1 регистрировался при 590 ± 17 нм (красные агрегаты) и 530 ± 15 нм (зеленые мономеры), соответственно. Анализ Δ ψ _м был проведен с использованием программного обеспечения ImageJ для расчета отношения интенсивностей красного и зеленого каналов.

Вестерн-блоттинг-анализ

Клетки HCT116 обрабатывали липосомами, конъюгированными с TPP, в течение 4 часов, только рентгеновскими лучами или комбинацией липосом и рентгеновской обработки.После обработки клетки дважды промывали PBS и лизировали буфером RIPA с добавлением коктейля ингибиторов протеазы (добавление ингибитора протеазы к буферу RIPA непосредственно перед использованием) в соответствии с протоколом производителя (ThermoFisher Scientific Australia). Вкратце, 250 мкл смеси добавляли к осадку клеток с последующим осторожным встряхиванием осадка клеток в течение 15 минут на льду. Смесь клеток центрифугировали при ~ 14000 × g в течение 15 мин для осаждения клеточного дебриса.Супернатант (экстрагированные белки) переносили в новую пробирку для прогона геля. Экстрагированные белки загружали в лунки белкового геля Бис-Трис. После разделения белки были перенесены на мембраны из ПВДФ. Мембраны блокировали блокирующим буфером (Thermo Fisher Scientific) в течение 1 ч при комнатной температуре и инкубировали с первичными антителами против Bax, BAD и расщепленной каспазой-3 при 4 ° C в течение ночи. Все первичные антитела разводили 1: 1000. После трехкратной промывки TBST мембраны инкубировали с соответствующими вторичными антителами, конъюгированными с HRP, в течение 1 ч при комнатной температуре.Все вторичные антитела разводили 1: 1000. После трехкратной промывки TBST мембраны визуализировали с использованием субстрата вестерн-блоттинга на системе визуализации ChemiDoc ™ MP (Bio-Rad Laboratories, Inc., США). Количественная оценка вестерн-блоттинга проводилась с использованием программного обеспечения ImageJ.

Статистический анализ

Все количественные данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение, n ≥ 3. Статистический анализ проводился с использованием калькулятора GraphPad Prism t test и * p <0,05, ** p <0.01, *** р <0,001, **** р <0,0001.

Понимание связывания малых молекул с рецептором Fc новорожденных с помощью рентгеновской кристаллографии и ЯМР с вращением под магическим углом 100 кГц

Образец цитирования: Stöppler D, Macpherson A, Smith-Penzel S, Basse N, Lecomte F, Deboves H, et al. (2018) Понимание связывания малых молекул с рецептором Fc новорожденных с помощью рентгеновской кристаллографии и ЯМР с вращением под магическим углом 100 кГц. ПЛоС Биол 16 (5): e2006192. https: // doi.org / 10.1371 / journal.pbio.2006192

Академический редактор: Энн Сток, UMDNJ / Медицинская школа Роберта Вуда Джонсона, Соединенные Штаты Америки

Поступила: 6 февраля 2018 г .; Дата принятия: 2 мая 2018 г .; Опубликовано: 21 мая 2018 г.

Авторские права: © 2018 Stöppler et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Кристаллографические данные доступны из банка данных по белкам (www.rcsb.org, инвентарные номера 6C97, 6C98 и 6C99), а данные о химических сдвигах — из банка данных биологического магнитного резонанса (www.bmrb). .wisc.edu, инвентарный номер 27437). Все остальные соответствующие данные находятся в документе и его файлах с вспомогательной информацией.

Финансирование: Deutsche Forschungsgemeinschaft (номер гранта SFB 1078 B1). Спонсор не принимал участия в планировании исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.iNEXT (номер гранта WP1). Спонсор не принимал участия в планировании исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи. Швейцарский национальный научный фонд (номер гранта 200020_159707 и 200020_146757). Спонсор не принимал участия в планировании исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи. Европейский исследовательский совет (грант № 741863, FASTER). Спонсор не принимал участия в планировании исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Я ознакомился с политикой журнала, и у авторов этой рукописи есть следующие конкурирующие интересы. Алекс Макферсон, Фабьен Леконт, Ричард Д. Тейлор, Тим Норман, Марта Вествуд, Бен Коссинс, Джеймс Уайт, Роберт Гриффин, Кристин Проссер, Себастьян Келм, Алистер Генри, Ричард Тейлор и Аластер Д. Лоусон — все нынешние или бывшие сотрудники и / или акционеры UCB Pharma. Николас Басс — сотрудник и / или акционер Санофи. Эрве Дебовес — сотрудник и / или акционер Evotec.Джон Портер — сотрудник и / или акционер Midatech Pharma. Кэтрин Кейн — сотрудник и / или акционер Vertex. Эми Х. Салливан и Дэвид Фокс III являются / были сотрудниками и / или акционерами Beryllium Discovery. Работа финансировалась UCB Pharma.

Сокращения: β2м, β2-микроглобулин; APS, Продвинутый источник фотонов; AUC, аналитическое ультрацентрифугирование; BMRB, Банк данных биологического магнитного резонанса; CD8, кластер дифференциации 8; CLS, Канадский источник света; COOT, Кристаллографический объектно-ориентированный инструментарий; CP, Перекрестная поляризация; CSP, возмущение химического сдвига; ECD, внеклеточный домен; FcRn, неонатальный рецептор Fc; FcRn _ECD , внеклеточный домен неонатального рецептора Fc; HSA, Человеческий сывороточный альбумин; IgG, Иммуноглобулин G; МАС, магическое вращение под углом; MHC1, большой комплекс гистосовместимости I класса; ORF, Открытая рамка для чтения; PDB, Банк данных белков; р.m.s.d., среднеквадратичное отклонение; SPR, Поверхностный плазмонный резонанс; TCR, Рецептор Т-клеток; ЧАЕВЫЕ, Сохранение и масштабирование инфицированных клеток без титра

Введение

Для открытия новых химических лекарств скрининг фрагментов с последующим структурным дизайном является эффективным способом отбора проб химического пространства и поиска совпадений для сложных целевых классов, таких как белок-белок взаимодействия [1–3]. Помимо обнаружения ортостерических лигандов, скрининг фрагментов имеет потенциал для определения вторичных сайтов связывания на белке, которые могут быть использованы для аллостерической регуляции [4].В процессе разработки приветствуется методология, включающая обнаружение аллостерических эффектов. ЯМР с вращением под магическим углом (MAS) потенциально может внести свой вклад посредством обнаружения изменений химического сдвига на большие расстояния, когда исследуемый белок слишком велик для ЯМР в растворе и даже не может быть дейтерирован. Здесь он применяется к растворимой конструкции 42 кДа неонатального рецептора Fc (FcRn) в рамках поиска аллостерических регуляторов с использованием очень быстрой MAS (100 кГц).

FcRn способствует гуморальному иммунитету новорожденных, регулируя транспорт иммуноглобулинов (IgG) через эпителий [5].Кроме того, было показано, что он связывается с IgG и альбумином сыворотки человека (HSA) в неперекрывающихся сайтах pH-зависимым образом (рис. 1) [6,7]. Это позволяет поддерживать гомеостаз IgG и HSA, учитывая длительный период полувыведения обоих белков из сыворотки [8–11]. При низком pH взаимодействие FcRn с IgG происходит посредством протонирования ионизируемых остатков, расположенных на шарнире Ch3 – Ch4 Fc IgG, что приводит к возникновению временных межмолекулярных солевых мостиков с отрицательно заряженными остатками на FcRn [12]. Взаимодействие FcRn с IgG и HSA происходит в закисленных ранних эндосомах, отвлекая белки от катаболизма и возвращая их в среду с нейтральным pH внеклеточного компартмента.При pH, близком к нейтральному, сродство взаимодействия уменьшается, и комплекс диссоциирует [10,13].

Рис. 1. FcRn позволяет поддерживать гомеостаз белка.

Растворимый внеклеточный домен неонатального рецептора Fc (FcRn _ECD , код PDB 1EXU) представляет собой гетеродимер, состоящий из β2m (зеленый) и α-цепи (синий) с полостью на границе раздела между двумя белками. FcRn участвует в регуляции уровней HSA (оранжевый) и IgG (красный). Связывание как HSA, так и IgG с FcRn зависит от pH, что обеспечивает механизм гомеостаза белка через эндосомный перенос.β2m, β2-микроглобулин; FcRn, неонатальный рецептор Fc; FcRn _ECD , внеклеточный домен неонатального рецептора Fc; HSA, человеческий сывороточный альбумин; IgG, иммуноглобулин G; PDB, Банк данных белков.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2006192.g001

Существующий как гетеродимер, состоящий из β2-микроглобулина (β2m) и прикрепленной к мембране α-цепи (рис. 1), FcRn гомологичен классу I главный комплекс гистосовместимости (MHC1) [14]. MHC1 представляет антигенные пептидные фрагменты рецептору Т-клеток (TCR) в комплексе с кластером дифференцировки 8 (CD8) [14].Напротив, FcRn не участвует в презентации эндогенного пептида TCR; его пептид-связывающая бороздка закрыта и нефункциональна [14].

Эффект потери FcRn был изучен на мышах с дефицитом β2m, которые развиваются нормально, но не обладают цитотоксичностью, опосредованной Т-клетками [15]. Делеция β2m препятствовала экспрессии FcRn, что приводило к снижению периода полужизни IgG [16–18]. Кроме того, случайная мутация остатков, проксимальных к сайту связывания IgG-FcRn, позволила отобрать варианты Fc с повышенным сродством к FcRn при pH 6.Эти конструкции Fc поддерживали pH-зависимое связывание и демонстрировали более длительный период полужизни по сравнению с IgG дикого типа [19].

FcRn был предложен в качестве лекарственной мишени для лечения аутоиммунных заболеваний, при которых патогенные аутоантитела вредны для здоровья [20]. Примеры таких заболеваний включают, но не ограничиваются ими, миастению, синдром Гийена – Барре и дерматомиозит [21–24]. Антитела, продуцируемые против тяжелой цепи FcRn, облегчают симптомы миастении у крыс, и было показано, что мыши без FcRn устойчивы к аутоиммунным заболеваниям [25–27].Текущее лечение этих состояний — это внутривенное введение иммуноглобулина, который увеличивает обмен патогенных IgG за счет насыщения FcRn [26]. Недавно розаноликсизумаб, моноклональное антитело против FcRn человека, снизил концентрацию IgG в сыворотке в рандомизированном исследовании фазы 1, предоставив клинические доказательства потенциала терапевтического средства против FcRn [28].

Химический ингибитор для контроля переноса FcRn терапевтически желателен для потенциального лечения аутоиммунных нарушений.Ранее сообщалось об ингибиторах ортостерических пептидов с эффективностью in vivo [29–33]. Кроме того, были описаны взаимоотношения структура-активность антагонистов малых молекул с использованием анализов ELISA [34]. Однако до настоящего времени не сообщалось об аллостерических модуляторах взаимодействий FcRn – IgG или FcRn – HSA. Если такие молекулы будут обнаружены, их можно будет использовать в терапевтических целях или в качестве инструментов в биомедицинских исследованиях.

В этом исследовании мы представляем открытие соединения, которое связывается с растворимым внеклеточным доменом FcRn, сокращенно FcRn _ECD .В начальном процессе скрининга дополнительные методы in silico использовались для прогнозирования сайтов связывания на основе заряда и топографии или консервативности последовательности, по отдельности или в комбинации [35–37]. Взаимодействие лиганда с FcRn _ECD исследуют с помощью комбинации рентгеновской кристаллографии и сверхбыстрого MAS ЯМР с обнаружением протонов, выявляя его локализацию в эволюционно законсервированном кармане связывания. На высоких частотах MAS 100 кГц мы могли получить хорошо разрешенные протонно-детектируемые ЯМР-спектры на осажденном, полностью протонированном FcRn _ECD , что позволяет de novo определять химический сдвиг остатков в связывающем кармане и в β2m путем установления последовательных связей. .MAS-ЯМР точно определяет изменения химического сдвига при связывании лиганда вблизи сайта связывания и в удаленных от него областях. В этом контексте MAS-ЯМР помогает исключить влияние эффектов упаковки кристаллов за счет использования белковых растворов. Обе кристаллические структуры с лигандом и без него были доступны, но структурные изменения не были очевидны при использовании процедур глобального подбора, когда молекулы, возможно, были «заблокированы» в конформации кристаллическими контактами. Чтобы идентифицировать участки структуры, на которые не влияет связывание лиганда, для подгонки, которая также чувствительна к небольшим аллостерическим эффектам, остатки, не показавшие изменений химического сдвига, были использованы для получения наложений FcRn _ECD X с учетом химического сдвига. -лучевые структуры с лигандом и без него.Наши результаты показывают, что терапевтическое вмешательство при аутоиммунных заболеваниях может быть достигнуто с помощью аллостерических малых молекул, которые связываются с FcRn _ECD . Кроме того, такие соединения потенциально могут быть использованы в качестве химических зондов для изучения переноса FcRn. Представленный подход подчеркивает дальнейшее использование MAS ЯМР для обнаружения структурных изменений в недейтерированных белках, экспрессируемых в клетках млекопитающих, при связывании лиганда.

Результаты и обсуждение

Рентгеновская кристаллография FcRn

Сайты связывания малых молекул на белках можно идентифицировать на основе формы поверхности, заряда и функциональности.Мы использовали программу SiteMap для идентификации сайтов связывания на FcRn _ECD [35]. Чтобы получить структурные данные для нашего анализа, дифракционные данные для кристаллов FcRn _ECD , при pH 3 и pH 8,5, были собраны при криогенных температурах и структурах, разрешенных до 2,0 Å и 2,45 Å, соответственно, путем молекулярного замещения. Две копии FcRn _ECD были обнаружены в асимметричной единице. В дополнение к структурам при кислотном и основном pH, структура pH 7,2 была создана с использованием моделирования молекулярной динамики (S1 рис и S1 текст).

Программа SiteMap обнаружила ряд областей с показателем пригодности к лекарственным средствам> 1,0, номинальный количественный показатель, указывающий на то, что связывание нМ может быть достигнуто с помощью обычной небольшой молекулы с молекулярной массой <500 Да. В частности, SiteMap идентифицировал лигандируемый сайт на границе между α-цепью и β2m (S1 Fig и S1 Text). Было предсказано, что соответствующие границы изменяются в зависимости от pH, при этом площадь описывается как одна большая или три отдельные полости.

SiteMap не обнаружил областей рядом с сайтом связывания IgG.Основываясь на нашем анализе, если существует ортостерический карман для небольшой молекулы, блокирующей IgG, он, вероятно, будет временным по своей природе и не стабилизируется в кристаллической решетке.

Эволюционная консервация FcRn

Исходя из предположения, что эволюционно сохраняющиеся полости могут иметь связанную функцию, мы оценили такую ​​сохранность полостей, обнаруженных с помощью SiteMap (S2 Рис). Мы идентифицировали последовательности ортологов с помощью OrthoDB и выполнили выравнивание последовательностей с помощью Clustal Omega [38,39].Затем с помощью MEDELLER была создана модель гомологии для каждой последовательности, что позволило нам визуализировать мутации в соответствии с эволюционной консервацией в PyMOL [40,41].

Наш анализ последовательности в целом поддерживает идею о том, что области белка, важные для структурной целостности или функции, являются консервативными, в частности, граница раздела между α-цепью и β2m. Он содержит ключевые контакты, такие как контакты между D53 _β2m , Q34 _{α-цепью} и S37 _{α-цепью} , и сохранение этих контактов сохраняет структурную целостность нековалентно связанного гетеродимера.

Кроме того, мотивы в сайте связывания HSA также были консервативными. Один из них ранее был идентифицирован как критический для связывания альбумина и был местом контакта белка в наших кристаллических структурах с pH 3 и pH 8,5 между двумя копиями FcRn _ECD в асимметричной единице [8]. Сначала мы были удивлены, увидев, что сайт связывания IgG плохо консервативен, за исключением ключевых остатков, таких как D130 _α-цепь . Это может быть связано с гетерогенностью фрагментов Fc между ортологами млекопитающих, что предположительно снижает перекрестную реактивность видов.Из регионов, идентифицированных с помощью SiteMap, центральная полость была высококонсервативной, возможно, из-за близости к границе раздела димеров.

Скрининг фрагментов для идентификации малых молекул

Наш анализ in silico предполагает наличие эволюционно консервативного сайта связывания на границе между α-цепью и β2m. Чтобы найти лиганды для этой полости и, возможно, других сайтов, был проведен скрининг фрагментов ЯМР в состоянии раствора. Для этой цели мы использовали внутреннюю библиотеку из примерно 1100 молекул, содержащих атомы фтора, чтобы сделать возможным опрос лиганда с помощью ¹⁹ F ЯМР Карра-Перселла-Мейбума-Гилла [42,43].Этот экран обнаружил 143 потенциальных связующих. Чтобы выбрать соединения для кристаллографических исследований, активные молекулы были дополнительно протестированы в экспериментах с насыщенным переносом разностного ЯМР и с помощью поверхностного плазмонного резонанса (SPR), что дало расчетное значение K _D 80 мкМ для фрагмента с наивысшим сродством, рацемата UCB-FcRn. -84 (рис. S3 и данные S1) [44,45]. Хиральное разделение показало предпочтительное связывание R-энантиомера. Конкуренция UCB-FcRn-84 с IgG была протестирована в анализе FcRn _ECD –IgG FRET; однако никакого измеримого ингибирования не наблюдалось.

Кристаллографические исследования лиганд-связанного FcRn

Подтвержденные попадания с экрана-фрагмента были пропитаны кристаллами FcRn _ECD , выращенными в кислых условиях. Основываясь на полученных кристаллических структурах, мы стремились улучшить как сродство, так и растворимость лиганда.

UCB-FcRn-84 был обнаружен в консервативной полости на границе β2m и α-цепи (S4 рис. И S2 текст), как предсказано SiteMap. Ключевые свойства связывающих взаимодействий включают захоронение 3-фторфенильной группы в гидрофобной полости, состоящей из Y26 _β2m , S52 _β2m , Y63 _β2m , L65 _β2m , W29 _α-цепи и P228 _{α- цепь} .Наиболее визуально яркой особенностью связывающего кармана является туннельная полость, которая проходит через середину белка (S5 рис. И S2 текст). Бициклическое кольцо UCB-FcRn-84 занимает эту полость, будучи вовлеченным в одну прямую и одну опосредованную водой водородную связь с основной цепью α-цепи Q34 _.

Поскольку фрагмент был центрально расположен в этой области, он предоставил нам удобную химическую платформу для дальнейшего исследования сайта связывания (S4 рис. И S2 текст). Мы попытались улучшить сродство UCB-FcRn-84, лучше занимая пространство вокруг 3-фторфенильной группы, которая была вложена в четко определенный гидрофобный карман.Примечательно, что мы идентифицировали небольшую область, доступную для роста, рядом с незамещенным мета-положением 3-фторфенильной группы. После сканирования ряда дизамещенных фенильных производных мы определили 3,5-дифторфенил как лучший вариант, дающий лиганд со сродством 2,4 мкМ к рацемату. Более того, добавление 3-пиридильной группы в положение 5 привело к получению эквипотенциального соединения (UCB-FcRn-303), но с улучшенной растворимостью (S5 и S6 фиг., S1 данные и S2 текст).

Кристаллическая структура UCB-FcRn-303, связанного с FcRn _ECD , отображает R-энантиомер (Фиг.2 и S5 Фиг).Режим связывания соответствует положению, наблюдаемому для UCB-FcRn-84 (фиг. 2A и 2B, S4 и S5, фиг.). Дизамещенное фенильное кольцо лучше заполняет гидрофобный карман на границе α-цепь / β2m, в то время как взаимодействия водородных связей поддерживаются с α-цепью и локальной водной сеткой.

Рис. 2. Кристаллическая структура соединения UCB-FcRn-303 (R-энантиомер), связанного с FcRn _ECD .

(A) Белок кристаллизовался в виде димера, состоящего из двух молекул β2m (темно-серый и зеленый) и двух молекул α-цепи (светло-серый и синий). (B) На границе β2m и α-цепи UCB-FcRn-303 (серый) занимает карман связывания с глицином, цистеином, гидрофобный (лейцин), заряженный (гистидин, аспартат) и полярно незаряженный (серин , Глутамин) остатков. β2m, β2-микроглобулин; FcRn, неонатальный рецептор Fc; FcRn _ECD , внеклеточный домен неонатального рецептора Fc.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2006192.g002

В биохимических экспериментах молекулы из нашей серии не ингибировали связывание IgG при тестировании в конкурентном анализе FcRn _ECD –IgG FRET.Это согласуется с нашими кристаллографическими исследованиями, которые не показали заметных изменений в сайте связывания IgG, хотя точной интерпретации небольших изменений могут препятствовать контакты кристаллов. FcRn _ECD кристаллизовался с двумя копиями гетеродимера, присутствующими в асимметричной единице, упаковывая антипараллельным образом (рис. 2A). Наложение комплекса тяжелая цепь IgG-FcRn _ECD (банк данных белка [PDB], код 1FRT) с безлигандной кристаллической структурой показывает значительное перекрытие между доменами Ch3 и Ch4 IgG и симметричными копиями FcRn _ECD (S7 Рис) [46].

Чтобы определить, может ли лиганд вызывать небольшие конформационные и / или динамические изменения в областях за пределами сайта прямого связывания, мы использовали методы на основе ортогональных растворов, которые позволят избежать конформационных ограничений, налагаемых упаковкой кристаллов.

Осажденный, полностью протонированный FcRn

До недавнего времени MAS-ЯМР в состоянии раствора и детектированный протонами обычно требовал дейтерирования белков в диапазоне размеров 42 кДа FcRn _ECD , как соотношение сигнал / шум, полученное в экспериментах с тройным резонансом с участием ¹³ Cβ и ¹³ Cα химические сдвиги критически зависят от T ₂ когерентностей ¹³ C [47,48].Поскольку нам не удалось произвести дейтерированный FcRn _ECD в достаточных количествах, было невозможно получить трехмерные спектры ЯМР в состоянии раствора, которые позволили бы проводить последовательные отнесения. Однако спектральное качество корреляционного спектра 2D ¹⁵ N- ¹ H, записанного в растворе, очень высокое (S8 Рис) [49]. Это указывает на то, что FcRn _ECD , скорее всего, не образует стабильный димер гетеродимеров в растворе при применяемых концентрациях, что согласуется с биохимическими данными и более ранними исследованиями [50].Можно было наблюдать по крайней мере 227 из ожидаемых 349 сигналов амида основной цепи, а остальные сигналы, скорее всего, были скрыты из-за перекрытия.

Чтобы обойти эти экспериментальные ограничения, мы применили MAS ЯМР. Прогресс последних лет, в частности, более быстрое вращение образцов, позволяет получать детектируемые протонами спектры MAS ЯМР на полностью протонированных образцах, что увеличивает чувствительность и облегчает определение резонанса с помощью экспериментов с тройным резонансом [51–54]. На самой высокой частоте MAS, обычно доступной (110 кГц), хорошо разрешенные протонные спектры были зарегистрированы для полностью протонированных микрокристаллических и мембранных белков, осажденных ансамблей и фибриллярных белков [55–57].

В данном случае мы исследовали растворимый FcRn _ECD с помощью экспериментов MAS ЯМР с помощью седиментации. Для этого необходимо наличие специальных инструментов для наполнения [58,59]. С помощью таких устройств мы осадили растворимый, полностью протонированный [ ¹³ C, ¹⁵ N] -меченный FcRn _ECD 42 кДа путем ультрацентрифугирования непосредственно в ротор MAS 0,7 мм (рис. 3A).

Рис. 3. Детектируемый протонами MAS ЯМР на полностью протонированном FcRn _ECD .

(A) Растворимый FcRn _ECD (42 кДа) осаждали ультрацентрифугированием при 100000 x g непосредственно в ротор 0,7 мм MAS NMR с использованием самодельного инструмента для наполнения. (B) 2D ¹⁵ N- ¹ H корреляционный спектр, зарегистрированный при 100 кГц MAS полностью протонированного [ ¹³ C, ¹⁵ N] -меченного FcRn _ECD . (C) Типичная ширина линии ¹ H (1) и ¹⁵ N (2) на полувысоте полной ширины (FWHM) выбранного кросс-пика из ¹⁵ N- ¹ H спектр.β2m, β2-микроглобулин; FcRn, неонатальный рецептор Fc; FcRn _ECD , внеклеточный домен неонатального рецептора Fc.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2006192.g003

Корреляционный спектр 2D ¹⁵ N- ¹ H, измеренный на MAS 100 кГц, показан на рисунке 3B. Наблюдаемая ширина линий демонстрирует замечательное спектральное качество по стандартам MAS ЯМР (рис. 3C). Полученные при магнитном поле около 20 Тл ширины линий ¹ H и ¹⁵ N выбранного типичного кросс-пика составляют 184 Гц и 41 Гц, соответственно.Ширина амидной линии ¹ H FcRn _ECD все еще выше, чем наблюдается в модельном белке GB1, примерно в 1,8 раза, но аналогична осажденному белку оболочки вирусного капсида AP205 [60]. Спектр отображает большое количество неразрешенных сигналов и значительную долю сигналов, которые хорошо рассеяны, и оба из них могут быть отнесены на основе подходящих спектров тройного резонанса.

Чтобы отслеживать состояние складчатости FcRn _ECD в осажденном образце, мы сравнили спектр MAS ¹⁵ N- ¹ H с корреляцией ¹⁵ N- ¹ H, зарегистрированной в растворе (S8 Рис. и S3 Text).Совпадение спектров свидетельствует о том, что структура FcRn _ECD в растворе очень похожа на структуру в осажденном образце. FcRn _ECD не образовывал стабильных димеров гетеродимеров в растворе, как это наблюдалось в кристаллической структуре. Аналитическое ультрацентрифугирование, однако, выявляет зависящее от концентрации равновесие протомер-дипротомер гетеродимера FcRn _ECD в растворе с очень низкой заселенностью фракции дипротомера (S9 рис. И S4 текст).Возможно, что это равновесие изменяется в процессе седиментации, что может объяснить небольшие различия в химическом сдвиге. Однако из-за перекрытия сигналов в спектре MAS ЯМР ¹⁵ N- ¹ H более подробное сравнение химического сдвига невозможно.

Резонансные отнесения в протонно-детектируемых MAS ЯМР спектрах FcRn

Чтобы сделать возможной интерпретацию возмущений химического сдвига (CSP) при связывании UCB-FcRn-303 с FcRn _ECD , определение резонанса имеет решающее значение.Доступные сейчас высокие частоты MAS облегчают процедуру назначения, основанную на экспериментах MAS ЯМР с тройным резонансом, как и в ЯМР в растворе. К ним относятся спектры (H) CANH, (H) CBCANH, (H) CA (CO) NH и (H) CBCA (CO) NH, дающие отнесения ¹⁵ N, ¹ H ^N , ¹³ Cα0 и ¹³ Cβ химические сдвиги [61,62]. Если невозможно получить спектр (H) CBCA (CO) NH с достаточным отношением сигнал / шум из-за слишком короткого времени релаксации ¹³ Cα и ¹³ CO, первые два эксперимента позволяют идентифицировать аминокислоты. которые на следующем этапе могут быть последовательно соединены в соответствии с последовательностью белка с использованием спектра (H) CA (CO) NH.В этом исследовании такие спектры были получены на полностью протонированном [ ¹³ C, ¹⁵ N] -меченном FcRn _ECD , что позволило отнести 25 остатков α-цепи, близких к карману связывания, и 73% всех остатков β2m. .

Чтобы облегчить определение резонансов β2m, мы использовали данные Beerbaum и его коллег, в которых [ ² H, ¹³ C, ¹⁵ N] β2m, меченный [^{] 15} N], исследовали в комплексе с немеченым MHC1 [63] . Однако окончательные назначения были достигнуты путем установления последовательных связей вдоль белковой основы, как показано для последовательности от K41 _β2m до R45 _β2m (фиг. 4).Все присвоения химического сдвига перечислены в таблице S1 и данных S2 и депонированы в банке данных биологического магнитного резонанса (BMRB) (инвентарный номер 27437). Всего таким образом были отнесены сигналы из 98 остатков (таблица S1, данные S2 и текст S5). Более чувствительный (H) CANH спектр содержал 84 дополнительных разрешенных кросс-пика, которые не могли быть назначены дальше из-за перекрытия или отсутствия корреляций в менее чувствительных (H) CA (CO) NH и (H) CBCANH спектрах.

Рис. 4. Спектры MAS ЯМР с тройным резонансом позволяют отнести химические сдвиги.

Последовательные отнесения резонансов с использованием экспериментов (H) CANH (синий), (H) CA (CO) NH (красный) и (H) CBCANH (зеленый), записанных на полностью протонированных [ ¹³ C, ¹⁵ N ] -меченный FcRn _ECD при 100 кГц MAS. Например, последовательные соединения от K41 _β2m до R45 _β2m в β2m обозначены пунктирными линиями. Все присвоенные химические сдвиги можно найти в таблице S1, данных S2 и в BMRB (номер доступа 27437). β2m, β2-микроглобулин; BMRB, Банк данных биологического магнитного резонанса; FcRn _ECD , внеклеточный домен неонатального рецептора Fc; МАС, магическое вращение под углом.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2006192.g004

Интересно, что большое количество измеренных химических сдвигов ¹³ Cα, ¹³ Cβ, ¹⁵ N и ¹ H β2m в гетеродимере FcRn _ECD соответствуют наблюдаемым резонансам ЯМР в состоянии раствора для дейтерированного β2m в комплексах MHC1 из предыдущего исследования (S1 Table и S5 Text) [63]. Различия в химических сдвигах можно объяснить изотопными эффектами ¹ H / ² H, ограниченным числом аминокислотных замен в MHC1, потенциальными димерами гетеродимеров FcRn _ECD в осажденном образце, а также различиями в буфере и температуре. [64].Сходство химических сдвигов поддерживает идею, что β2m принимает свою глобулярную складку в осажденном образце FcRn _ECD . Основываясь на этих выводах и на сходстве между спектрами состояния раствора ¹⁵ N- ¹ H и MAS ¹⁵ N- ¹ H, мы предполагаем, что общая структура FcRn _ECD очень похожа в растворе. и в осажденных образцах (S8 рис., S3 текст, S1 таблица и S5 текст).

Таким образом, спектры (H) CANH, (H) CA (CO) NH и (H) CBCANH представляют собой приемлемую основу для получения назначений основного резонанса и позволили нам использовать CSP в качестве мониторов структурных изменений в FcRn _ECD при Связывание UCB-FcRn-303.

Структурные изменения в FcRn

CSP (Δδ) являются зондами как для прямого воздействия связывания лиганда, так и для сопутствующих долгосрочных структурных изменений рецепторных белков, которые могут указывать на аллостерические эффекты. Поскольку различия между рентгеновскими структурами с лигандом и без него могут быть замаскированы кристаллическими контактами, мы проанализировали эту возможность, сравнив 3D (H) CANH-спектры, записанные на образцах FcRn _ECD с UCB-FcRn-303 и без него (рис. 5Б).Введение третьего измерения по сравнению с корреляцией 2D ¹⁵ N- ¹ H приводит к лучшему спектральному разрешению. Наблюдаемые минимальные различия в химическом сдвиге показаны на фиг. 5A. В целом, многие из назначенных сигналов показывают очень похожие химические сдвиги в обоих спектрах (Δδ <0,02 ppm, белый цвет на рис. 5C и 5D), тогда как сигналы, которые значительно смещаются (0,02 ppm <Δδ <0,03 ppm, голубой; 0,03 ppm <Δδ). <0,04 ppm, морской; 0,04 ppm <Δδ, темно-синий на рис. 5C и 5D) выглядят хорошо сгруппированными, что свидетельствует о конформационном / динамическом изменении, исходящем от сайта связывания лиганда.В следующих обсуждениях мы будем рассматривать все вычеты с Δδ <0,02 м.д. как невозмущенные. Выбранные кросс-пики сильно затронутых остатков (0,04 ppm <Δδ) показаны в 2D-плоскостях спектров (H) CANH с лигандом и без лиганда (рис. 5B). Рассчитанные CSP, показанные на фиг. 5A, основаны на изменениях химического сдвига во всех трех спектральных измерениях. Поэтому большие CSP, показанные на фиг. 5A, могут быть не очевидны из двухмерных плоскостей, показанных на фиг. 5B, см. D96 _β2m .

Рис. 5. CSP (Δδ) указывают на структурные изменения в FcRn _ECD при связывании лиганда.

(A) CSP всех назначенных аминокислот в FcRn _ECD при связывании с UCB-FcRn-303, рассчитано с Δδ = MIN {SQRT [(Δδ ( ¹ H)) ² + (Δδ ( ¹³ C) / 10) ² + (Δδ ( ¹⁵ N) / 5) ² ]} (стандартное отклонение = 0,015 ppm). Изменения измеряли в спектрах ЯМР 3D (H) CANH MAS. (B) CSP при связывании UCB-FcRn-303 с FcRn _ECD в 2D-плоскостях 3D (H) CANH-спектров с лигандом (черный) и без (синий), оба зарегистрированы в присутствии 3% ДМСО. (C) Структурный вид UCB-FcRn-303 (красный), связанного с FcRn _ECD с назначенными остатками в представлении палочки, закодированном цветом в соответствии с их CSP (Δδ <0,02, белый; 0,02 <Δδ <0,03, голубой; 0,03 <Δδ <0,04, морской; 0,04 <Δδ, темно-синий). (D) Структурный вид FcRn _ECD в комплексе с UCB-FcRn-303 ( красный ) с той же цветовой кодировкой изменений химических сдвигов, что и на (C). Все химические сдвиги можно найти в таблице S1, данных S2 и в BMRB (номер доступа 27437).BMRB, Банк данных биологического магнитного резонанса; CSP — возмущение химического сдвига; FcRn, неонатальный рецептор Fc; FcRn _ECD , внеклеточный домен неонатального рецептора Fc.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2006192.g005

Как и ожидалось, сильные эффекты наблюдаются вблизи кармана связывания UCB-FcRn-303 с помощью рентгеновской кристаллографии (G232 _{α- цепи} , C48 _α-цепи , G49 _α-цепи и S52 _β2m , фиг. 5A и 5C), поскольку химическое окружение этих остатков изменяется при связывании.

Что еще более интересно, несколько остатков, в которых произошли изменения в своих химических сдвигах, удалены от связывающего кармана. К ним относятся, например, α-цепь E54 _{на С-конце короткой α-спирали рядом с областью связывания (фиг. 5C и 5D). Такой эффект потенциально можно объяснить небольшим перемещением α-спирали. Кроме того, сильные CSP можно наблюдать в довольно удаленной области, состоящей из петель в β2m, включая D96 β2m , G18 β2m , K19 β2m , S20 β2m и h23 β2m (рис. 5C и 5D). .Эти остатки группируются на поверхности, близкой или на границе раздела β2m и α-цепи двух разных гетеродимеров, видимых в асимметричной единице (Рис. 6A и 6B). Второй сайт связывания лиганда в этой области FcRn ECD может быть исключен, поскольку стехиометрические отношения> 1 не наблюдались в экспериментах SPR или рентгеновской кристаллографии (рис. 2A, S3, S4, S5, S6, фиг. И S1). . Интересно, что сильные изменения сдвига наблюдались на сравнительно больших расстояниях от сайта связывания малых молекул.Эти сильные CSP могут быть прямыми эффектами связывания лиганда, такими как введение небольшого смещения субъединицы β2m по отношению к α-цепи. Альтернативно, возможно, что происходят изменения в равновесии протомер-дипротомер, и таким образом затрагиваются химические сдвиги остатков на потенциальной границе дипротомера. Хотя мы не наблюдаем стабильный димер гетеродимеров в растворе, небольшая фракция присутствует, как видно в экспериментах с аналитическим ультрацентрифугированием (AUC) (S9 рис. И S4 текст).Дипротомер также может быть более густонаселенным при очень высоких концентрациях белка после примененного осаждения посредством ультрацентрифугирования при подготовке экспериментов MAS 100 кГц. Однако образцы с лигандом и без него были приготовлены в идентичных условиях, поэтому структурные эффекты, не связанные со связыванием лиганда, маловероятны. Для индуцированного лигандом изменения равновесия необходимы структурные изменения с дальним диапазоном в направлении потенциальной границы раздела дипротомеров, что еще раз подчеркивает возможность возникновения аллостерических эффектов при связывании лиганда.}

Рис. 6. Кластеры CSP на потенциальном интерфейсе дипротомера FcRn _ECD .

(A) CSP в поверхностном представлении кристаллической структуры дипротомера FcRn _ECD в комплексе с UCB-FcRn-303 (красный), с той же цветовой кодировкой, что и на рис. 5. (B) Для ориентации , кристаллическая структура FcRn _ECD показана в мультипликационном представлении с β2m зеленым и темно-серым, а молекулы α-цепочки синим и светло-серым. (C) Сайты взаимодействия IgG и HSA показаны фиолетовым и оранжевым цветом соответственно.Выделенные остатки обсуждаются в тексте. CSP — возмущение химического сдвига; FcRn, неонатальный рецептор Fc; FcRn _ECD , внеклеточный домен неонатального рецептора Fc; HSA, человеческий сывороточный альбумин; IgG, иммуноглобулин G.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2006192.g006

В сайте взаимодействия с HSA можно было обнаружить ряд сильно затронутых остатков. К ним относятся R12 _β2m , h23 _β2m , C48 _α-цепь , G49 _α-цепь , A50 _α-цепь и E54 _α-цепь с CSP около 0.04 ppm или больше (данные на рисунках 5A, 6C и S2). Некоторые из этих аминокислот расположены близко к сайту связывания UCB-FcRn-303, но особенно R12 _β2m , h23 _β2m и E54 _α-цепь далеки от него и поэтому могут быть структурно изменены за счет аллостерических эффектов. (Фиг.5C и 6C). Возможно, что взаимодействие FcRn-HSA может модулироваться с помощью UCB-FcRn-303. Сайт связывания с HSA, однако, расположен на возможном интерфейсе дипротомера и CSPs в этой области могут быть вызваны потенциальными лиганд-индуцированными изменениями в равновесии протомер-дипротомер FcRn _ECD , как обсуждалось выше.

Из назначенных ЯМР остатков только несколько остатков от β2m обнаруживаются в области связывания IgG, такие как R3 _β2m и T86 _β2m (Рис. 6C), для которых происходят незначительные изменения химического сдвига (Рис. 5A) [46 ]. В общем, остатки в области β-складок β2m, удаленные от сайта связывания или границы раздела между гетеродимерами, не обнаруживают заметных CSPs (Рис. 5D).

Для дальнейшего изучения возможности аллостерической интерференции со связыванием IgG мы создали наложения с учетом химического сдвига двух кристаллических структур FcRn _ECD с и без UCB-FcRn-303.Все остатки с Δδ <0,02 ppm (рис. 5A) были использованы для подгонки, включая область вокруг R3 _β2m , T86 _β2m и L87 _β2m в β2m, который участвует во взаимодействии IgG (рис. 6C), давая среднеквадратичное отклонение (rmsd) 0,095 Å. Если движение α-спиральной области α-цепи может быть индуцировано при связывании лиганда, оно может распространяться в сторону петли от α-цепи D130 _{к α-цепи} E133 _{, которая является частью сайта связывания для IgG (рис. 6C) [46].К сожалению, наложение не выявляет каких-либо значительных структурных изменений остатков α-цепи рядом с этой петлей, за исключением тонких различий, которые мы не можем выделить как эффект, индуцированный соединением, из-за его близости к взаимодействиям с кристаллической упаковкой. Тем не менее, CSP, наблюдаемые далеко от полости лиганда, выявляют возможность аллостерических эффектов в FcRn ECD , индуцированных UCB-FcRn-303, путем воздействия на сайт взаимодействия с HSA. Это свидетельствует о том, что связывание оптимизированного лиганда может быть направлено на смещение субъединиц β2m и α-цепи и дистальное нарушение интерфейса связывания IgG с FcRn ECD .}

Выводы

В контексте исследования лекарств, мы идентифицировали соединение с молекулярной массой <500 Да, UCB-FcRn-303, которое связывается с внеклеточным доменом FcRn с низкой аффинностью в мкМ. Консервативный сайт связывания расположен на границе β2m и α-цепи, с туннельной полостью с доступом растворителя с двух разных сторон. Карман был идентифицирован методами компьютерной химии при теоретическом исследовании лекарственной устойчивости и подтвержден скринингом фрагментов, рентгеновской кристаллографией и ЯМР-спектроскопией.Соответствующие кристаллические структуры показывают димер гетеродимеров со стехиометрией 1: 1 для комплекса лиганд / белок.

Из-за расстояния около 35 Å между карманом связывания малых молекул и местом взаимодействия IgG (рис. 6C), для фармакологически значимого вмешательства в связывание IgG потребуются существенные аллостерические эффекты [46]. Такие аллостерические эффекты можно контролировать, сравнивая рентгеновские структуры с лигандом и без него, а также с помощью ЯМР-спектроскопии с помощью анализа индуцированных лигандом CSP.Поэтому мы разработали новый подход для тестирования эффектов связывания лиганда на растворимых белках, используя детектируемую протонами MAS ЯМР спектроскопию 100 кГц на полностью протонированном FcRn _ECD . После успешного осаждения белка путем ультрацентрифугирования с использованием специальных инструментов для наполнения можно было получить и частично сопоставить спектры MAS ЯМР с очень хорошо детектированными протонами. CSP при связывании UCB-FcRn-303 наблюдаются вокруг кармана связывания малых молекул, но также затрагиваются и отдаленные остатки, перекрывающиеся с сайтом взаимодействия с HSA.

Поскольку большая часть остатков в β2m по направлению к сайту связывания IgG и некоторые в α-цепи не показывают существенных CSP (рис. 5A, 6A и 6C), мы произвели выравнивание двух рентгеновских структур с лигандом и без него, совмещение несмещающих остатков. Этот подход не выявил существенных изменений остатков, близких к сайту взаимодействия IgG, при связывании FcRn-UCB-303, что могло бы модулировать взаимодействие FcRn _ECD –IgG. Можно предположить, что оптимизированный лиганд может вызывать сдвиг α-спиральной области в α-цепи с потенциальным воздействием на взаимодействие IgG.Такая оптимизация может включать производные с дополнительными функциональными группами, которые входят в границу раздела α-цепь / β2m и, таким образом, вызывают небольшое смещение этих двух компонентов друг относительно друга. Сильные CSP можно было наблюдать в сайте взаимодействия с HSA FcRn _ECD , что подчеркивает возможность достижения функциональной модуляции FcRn с помощью UCB-FcRn-303. Однако нельзя полностью исключить, что изменения олигомерного состояния FcRn _ECD , вызванные лигандом в условиях MAS, приводят к наблюдаемым CSP в этой области.

Представленная методология MAS ЯМР обеспечивает привлекательный подход для структурных исследований крупных растворимых белков, экспрессируемых в клетках млекопитающих или других типах эукариотических клеток, в которых дейтерирование затруднено, особенно в случаях, когда гликозилирование имеет решающее значение. Более того, он расширяет диапазон применений ЯМР до ​​фармакологически значимых мишеней, которые часто недоступны для методов ЯМР в растворе из-за размера. Подход MAS ЯМР работает с высокомолекулярными мишенями и не зависит от физического состояния образца, обеспечивая возможность обработки спектральной сложности, например.g., применяя соответствующие концепции маркировки. Это облегчает исследования взаимодействия белок-лиганд с помощью ЯМР для любого типа белка или биомолекулярного комплекса, делая доступными ранее трудноразрешимые фармакологические мишени, такие как рибосомы, рецепторы, связанные с G-белком, и т.п. Наше исследование показывает, что MAS ЯМР дополняет рентгеновскую кристаллографию в кампаниях по открытию лекарств на основе структур. Особенно полезно исследовать аллостерические изменения за пределами сайтов связывания малых молекул, которые может быть трудно наблюдать с помощью рентгеновской кристаллографии.

Материалы и методы

FcRn

Кодирующие последовательности внеклеточного домена (ECD) (аминокислоты 1-297) α-цепи FcRn человека и β2m человека были синтезированы Entelechon (Entelechon, Регенсбург, Германия). Фрагмент α-цепи клонировали в вектор экспрессии pMH (UCB), а последовательность β2m клонировали в pMK (UCB) как фрагменты HindIII и EcoRI. Оба вектора обрабатывали SalI и NotI, а соответствующие фрагменты вырезали и лигировали для создания вектора, содержащего гены α-цепи и β2m (pM-ECDFcRn-B2M).

Вектор дополнительно расщепляли с помощью SalI и лигировали кассету с неомицином для создания вектора с двойным геном с селекцией антибиотика (pMFcRnECD-B2M-Neo).

Создание стабильной линии клеток млекопитающих FcRn

HEK293 трансфицировали pMFcRnECD-B2M-Neo с использованием 293fectin (Thermofisher) в соответствии с инструкциями производителя. Трансфицированные клетки инкубировали в статическом инкубаторе при 37 ° C и 8% CO ₂ в течение 24 часов.Затем клетки разбавляли до необходимой концентрации средой с добавлением 0,5 мг / л G418 (Invitrogen), а затем делили на пулы объемом 1 мл в 24-луночных планшетах и ​​инкубировали в статическом инкубаторе при 37 ° C с 8% CO _2. . Каждые 7 дней среду удаляли из каждой лунки и заменяли свежей средой. Еще через 14 дней пулы, в которых наблюдался рост клеток, переносили в 6-луночные планшеты. Их увеличивали до 50 мл культур в колбах E250 в инкубаторах с встряхиванием.Для определения общей экспрессии гетеродимера FcRn _ECD , состоящего из β2m и α-цепей, устанавливали периодический избыточный рост и инкубировали в течение 10 дней.

Образцы супернатантов порционного разрастания объемом 50 мл анализировали на экспрессию FcRn _ECD с помощью вестерн-блоттинга. 15 мкл каждого супернатанта анализировали на вестерн-блоттинге (денатурированный гель Tris / Gly) вместе с известными концентрациями очищенного человеческого FcRn в качестве контроля.

Пул с наивысшей экспрессией был расширен (без отбора неомицина) до шкалы 10 л в волновом биореакторе 20/50 EHT при 37 ° C, 8% CO ₂ в течение 4 дней, после чего температура была снижена до 32 ° C и инкубировали еще 6 дней.Культуру клеток собирали центрифугированием (1000 × г в течение 1 часа) и супернатант пропускали через фильтр 0,22 мкм.

Очистка FcRn

Супернатант культуры клеток млекопитающих, содержащий гетеродимер FcRn _ECD , концентрировали с помощью мембраны с MWCO 10 000, используя фильтрацию в тангенциальном потоке (Centramate, Pall) или клетки с перемешиванием Amicon (Millipore), в зависимости от масштаба. Буфер для образца заменяли на 50 мМ фосфат натрия, pH 5.8, 30 мМ NaCl путем разбавления и концентрирования. FcRn _ECD загружали в колонку KappaSelect (GE Healthcare), которая была предварительно загружена моноклональным антителом IgG4 для связывания FcRn _ECD , перед промывкой 50 мМ фосфата натрия, pH 5,8, 30 мМ NaCl и элюированием 50 мМ NaCl. мМ фосфат натрия, pH 8,0, 30 мМ NaCl. Фракции элюирования анализировали с помощью SDS-PAGE и соответствующие фракции объединяли.

Образец концентрировали с использованием центробежного концентратора Amicon (Millipore), мембрана 10000 MWCO.Белок очищали гель-фильтрацией на колонке Superdex 200 (GE Healthcare) с использованием 25 мМ фосфата натрия, pH 7,4, 100 мМ NaCl. Пиковые фракции анализировали с помощью SDS-PAGE перед объединением и концентрированием, если необходимо.

Анализ SPR

SPR проводили с использованием инструментов BIAcore 4000 (GE Healthcare). Реагенты, включая сенсорные чипы CM5, N- гидроксисукцинимид (NHS), N -этил- N — (3-диметиламинопропил) карбодиимид (EDC) и этаноламин HCl, 10 мМ буферы ацетата натрия (pH 5.0, pH 4,5) и HBS-P (10x буфер) были получены от GE Healthcare.

FcRn _ECD разбавляли 10 мМ натрий-ацетатным буфером, pH 5,0 и иммобилизовали на сенсорном чипе CM5 с помощью химии аминового связывания до уровня захвата примерно 4000 единиц отклика. Соединения подвергали скринингу 10-точечным титрованием из 200 мкМ, при 2% ДМСО, pH 6,0, и поверхность повторно иммобилизовали после каждого 384-луночного планшета. Инъекции проводили со скоростью 10 мкл / мин.

Все данные имеют двойные ссылки для холостых инъекций и эталонной поверхности в соответствии со стандартными процедурами.Как обработка данных, так и подгонка выполнялись с использованием шаблонных протоколов Activity Base, разработанных в компании.

Скрининг библиотеки фрагментов с использованием

Библиотека приблизительно из 1100 фторсодержащих фрагментов была объединена в группы по 12, гарантируя отсутствие перекрытия сигналов ¹⁹ F. Первоначально коктейли готовили при концентрации 4,2 мМ в d6-ДМСО и разбавляли до 800 мкМ в PBS, pH 7,4 перед окончательным разбавлением до концентрации лиганда 40 мкМ (1% d6-DMSO) в любом PBS, содержащем 10% D ₂ O (для контрольных образцов) или 20 мкМ FcRn _ECD , содержащего 10% D ₂ O (для образцов белка).Спектры ЯМР получали при 25 ° C на спектрометре Bruker AVIII-HD 600 МГц, оборудованном криозондом QCI-F и автосэмплером SampleJet. Данные были собраны с использованием импульсной последовательности CPMG с общим временем эхо-сигнала 160 мс при ширине развертки 126 ppm со временем сбора данных 1 с. Все спектры обрабатывались с помощью TopSpin 3.2. Фрагменты считались связующими с FcRn _ECD , когда интенсивность сигнала ¹⁹ F была значительно снижена в спектрах с присутствующим FcRn _ECD по сравнению со спектрами, записанными в отсутствие белка.

Скрининг библиотеки фрагментов с использованием ЯМР STD

STD получали с соотношением лиганд: белок 50: 1 (500 мкМ лиганд, 10 мкМ FcRn _ECD ) в 500 мкл фосфатно-солевого буфера, pH 7,4 (90% H ₂ O, 10% D _{). 2} O) с 5% d6-DMSO, чтобы помочь солюбилизировать лиганд. Спектры ЯМР STD регистрировали с использованием спектрометра Bruker Avance III HD 600 МГц, оборудованного 5 мм криозондом QCI-F Cryoprobe. Данные были получены и обработаны с использованием стандартного программного обеспечения Bruker и были собраны при 298 К.Белок был насыщен в метильной области спектра при 0 м.д., а нерезонансное насыщение осуществляли при 33 м.д. Применялась серия из 120 импульсов EBurp2 (50 мс каждый) с задержкой 4 мкс между каждым импульсом, в результате чего общее время насыщения составляло 6 с. Белковые сигналы удаляли путем применения спин-блокировки 100 мс. Перемеженные данные в резонансе и вне резонанса записывались, обрабатывались отдельно, а затем получались разностные спектры путем вычитания включенного и нерезонансного спектров. Данные заполняли нулями один раз и применяли оконную функцию экспоненциального умножения (LB 2 Гц).

Конструирование плазмиды FcRn

Исходная конструкция для α-цепи / β2m экспрессирует две открытые рамки считывания (ORF) в одной бакуловирусной многоцелевой экспрессионной плазмиде pBacugs4X-1. Белковые мишени основаны на следующих аминокислотных последовательностях (как α-цепь, так и β2m каждая содержит свои нативные лидеры): α-цепь 1–297 на основе эталонной последовательности NCBI NP_004098, β2m 1–119 на основе эталонной последовательности NCBI NP_004039. Кодоны для обеих ORF были сконструированы GeneComposer для высокоэкспрессированных бакуловирусных генов, так что сайты рестрикции BamHI, HindIII, BglII и EcoRI были удалены из вставок для облегчения клонирования [65].Оба гена, включая фланкирующие сайты рестрикции, были синтезированы в GeneArt. ORF для α-цепи клонировали позади промотора полиэдрина через уникальные сайты BamHI и HindIII; в этом случае сайт BamHI предшествует сигнальной последовательности, тогда как HindIII следует за последовательностью «TGAT», так что две остановки вводятся после C-концевого остатка. ORF для β2m клонировали за промотором p10 через уникальные сайты BglII и EcoRI; сайт BglII предшествовал сигнальной последовательности, тогда как EcoRI следовал за последовательностью «TGATAA», так что две остановки были введены после С-концевого остатка.Используя эту схему клонирования, промоторы полиэдрина и p10 располагаются в разных / противоположных ориентациях в векторе-переносчике бакуловируса. Последовательность ORF проверяли до начала исследований экспрессии.

Экспрессия FcRn

Конструкцию α-цепь / β2m трансфицировали в клетки насекомых Sf9 (системы экспрессии) с использованием BestBac 2.0, ДНК линеаризованного бакуловируса с удаленной v-cath / chiA (системы экспрессии, № по каталогу -91-002). Вирус от каждой трансфекции амплифицировали в течение 3 раундов, чтобы получить вирусный запас для крупномасштабного производства.Крупномасштабные препараты выращивали в среде ESF921 (Expression Systems, № по каталогу 96–001). Крупномасштабные препараты инфицировали с использованием метода сохранения и увеличения числа инфицированных клеток без титра (TIPS) [66]. Приблизительно 10 ⁶ Tni-клеток ( Trichopulsia ni , Expression Systems) на мл инфицировали с использованием 1 мл клеток TIPS. Секретированные белки собирали через 2–3 дня с помощью фильтрации в тангенциальном потоке (Spectrum KrosFlo, фильтр 0,2 мкм, кат. № P-NO2-E20U-05-N).

Очистка FcRn

Собранную бакуловирусную среду ( Trichoplusia ni ), содержащую секретированный FcRn _ECD , концентрировали в 10 раз и заменяли буфер (50 мМ фосфат натрия, pH 5.8 и 30 мМ NaCl с помощью фильтрации с тангенциальным потоком (TFF) (Spectrum Labs). Концентрированную среду центрифугировали с использованием ротора JA-10 при 9000 об / мин в течение 15 минут при 4 ° C, а затем фильтровали через фильтр на крышке бутылки 0,2 мкм. Перед хроматографией в концентрированную среду добавляли три полных таблетки ингибитора протеазы, не содержащего ЭДТА. Отфильтрованную концентрированную среду наносили на 35 мл смолы IgG-сефарозы FF (GE Healthcare), уравновешенной 50 мМ натрий-фосфатным буфером, pH 5,8 и 30 мМ NaCl (Sigma), и вращали один за другим в течение одного часа при 4 ° C.Затем смолу выливали в колонку с гравитационным потоком и промывали 10 объемами колонки того же буфера для уравновешивания. FcRn _ECD элюировали со смолы восемью объемами колонки 50 мМ натрий-фосфатного буфера с pH 8,0 и 30 мМ NaCl. Фракции элюирования, содержащие FcRn _ECD , объединяли и загружали на две 5-мл колонки HiTrap Q FF (GE Healthcare) и элюировали градиентом 1 М NaCl. Представляющие интерес фракции объединяли и добавляли глицерин до конечной концентрации 10%.Пул концентрировали до 15 мг / мл с помощью центрифугирования (регенерированная целлюлоза Amicon, MWCO 10 кДа, Millipore) и дополнительно очищали с помощью эксклюзионной хроматографии на колонке HiLoad 16/600 Superdex 200 пг (GE Healthcare) в 50 мМ HEPES (4 — (2-гидроксиэтил) -1-пиперазинэтансульфоновая кислота) pH 7,0 и 75 мМ NaCl. Фракции, содержащие FcRn _ECD , объединяли и концентрировали для кристаллографии путем концентрирования на центрифуге (регенерированная целлюлоза Amicon, MWCO 10 кДа, Millipore) до 9.9 мг / мл перед аликвотированием и мгновенной заморозкой в ​​жидком азоте для последующего использования в экспериментах по кристаллизации.

Кристаллизация FcRn

Для поиска условий кристаллизации для FcRn _ECD , экспрессируемого в клетках насекомых, были проведены испытания кристаллизации методом диффузии паров сидя при 291 K с использованием различных коммерческих запасных матриц (реагенты Rigaku: JCSG +, Wizard 1/2, Wizard 3/4; Hampton Research: Crystal Screen HTIndex; молекулярные размеры: PACT, Morpheus, Proplex; микролитики: MCSG1) с использованием 0.4 мкл раствора белка с концентрацией 5 мг / мл, которые были смешаны с 0,4 мкл резервуарного раствора и уравновешены с 80 мкл резервуарного раствора. При первоначальных испытаниях по кристаллизации в нескольких условиях были получены небольшие кристаллы воздушного змея, содержащие PEG 3350, PEG 6000 или PEG 8000 при низком pH. Кристаллы FcRn _ECD с низким pH получали на оптимизированном сите для условий кристаллизации (Rigaku), содержащем 12% –16% PEG 6000, 100 мМ лимонная кислота / трехосновный цитрат аммония с pH 3,00–3,09. Кристаллы FcRn _ECD появлялись в течение 24 часов и со временем увеличивались, обычно до размера 50–150 микрон.Кристаллы собирали с использованием 20% глицерина в качестве криопротектора и мгновенно замораживали в жидком азоте перед сбором данных.

Кроме того, маленькие стержневидные кристаллы появлялись в одном условии при значительно более высоком pH (условие PACT h4, 100 мМ бис-трис пропан / HCl pH 8,5, 200 мМ NaI и 20% PEG 3350) [67]. Кристаллы FcRn _ECD с высоким / нейтральным pH были получены в оптимизированных условиях кристаллизации, содержащих 100 мМ бис-трис-пропан / HCl pH 8,5, 200 мМ NaI и 20% PEG 3350.Кристаллы FcRn _ECD появлялись в течение 48 часов и со временем становились больше, обычно более 150 микрон. Кристаллы собирали с использованием 20% этиленгликоля и мгновенно замораживали в жидком азоте перед сбором данных. Для получения кристаллов, связанных с соединением, кристаллы апо FcRn _ECD , выращенные при pH 3, вымачивали в течение трех дней в буфере, содержащем 0,1 M лимонная кислота / NaOH при pH 3,0, 20% мас. / Об. PEG 6000, 20% глицерина и 12,5-20. мМ соединение растворяют в 100% ДМСО. Для кристаллизации UCB-FcRn-303 связанной структуры FcRn _ECD использовали белок, экспрессируемый в клетках насекомых Sf9.

Определение структуры методом рентгеновской кристаллографии

набора данных были собраны в канадском источнике света (CLS) на канале луча 08ID-1 (CMCF), оборудованном рентгеновским детектором Rayonix MX300 CCD и усовершенствованным источником фотонов (APS) на канале 21-ID-F (LS-CAT), оснащенным детектор рентгеновского излучения Marmosaic 225 CCD. Данные дифракции были уменьшены и масштабированы с помощью XDS / XSCALE [68]. Структуры FcRn _ECD при низком и высоком / нейтральном pH были решены путем молекулярного замещения с использованием ранее существовавшей структуры комплекса.Значительная часть конструкции потребовала реконструкции; поэтому Phenix.autobuild был запущен для создания начальной структуры для дальнейшего уточнения. Все структуры были уточнены с использованием итерационных циклов TLS и ограниченного уточнения с помощью Phenix.refine и построения модели с использованием Crystallographic Object-Oriented Toolkit (COOT; версия 0.8.1-pre) и были проверены с использованием Molprobity до размещения в PDB (идентификаторы 6C97, 6C98, 6C99) [69–73]. Дифракционные данные и статистика уточнения для апо FcRn _ECD при pH 3 и обеих связанных с лигандом структур приведены в таблице S2.

Моделирование молекулярной динамики

Структуры FcRn _ECD при pH 3 и pH 8,5 использовали в качестве отправных точек для моделирования молекулярной динамики после добавления водорода. Состояния протонирования и недостающие петли были предсказаны с помощью Maestro (Schrödinger LLC). Структура была сольватирована в додекаэдре, так что ни один атом белка не находился в пределах 10 Å от края растворителя. Одноатомные ионы добавляли до концентрации соли 0,15 М. Все моделирование длилось 1000 нс и проводилось с помощью GROMACS 4.6.2 [74]. Сетка частиц Эвальда использовалась для электростатики на больших расстояниях вместе с отсечкой 10 Å для потенциальных функций Кулона и Леннарда – Джонса.

Экспрессия полностью протонированного [

FcRn _ECD экспрессировали с использованием стабильной клеточной линии HEK293, как описано выше, но питательную среду заменяли средой Bioexpress 6000 (Cambridge Isotope Laboratories).

Получение 2D

Состояние решения 2D ¹⁵ N- ¹ H TROSY-спектр был получен с 0.35 мл образца 300 мкМ [ ¹³ C, ¹⁵ N] -меченного FcRn _ECD в 25 мМ Na ₂ HPO ₄ , 100 мМ NaCl, 50 мкМ ЭДТА, 0,02% (мас. / v) буфер NaN ₃ при pH 7,4, содержащий 5% D ₂ O / 95% H ₂ O [49]. Данные ЯМР получали при 35 ° C на спектрометре Bruker AVIII HD 600 МГц, снабженном криогенно охлаждаемым зондом. Спектр был получен в течение 40 минут со временем сбора данных 40 мс для F ₁ ( ¹⁵ Н) и 60 мс для F ₂ ( ¹ H).Он был обработан с помощью Topspin 3.5 (Bruker Biospin Ltd) с линейным прогнозированием, используемым для увеличения эффективного времени сбора данных до 60 мс в F ₁ .

Седиментация FcRn

0,5 мл образца 100 мкМ [ ¹³ C, ¹⁵ N] -меченного FcRn _ECD в 25 мМ Na ₂ HPO ₄ , 100 мМ NaCl, 50 мкМ ЭДТА, 0,02% ( w / v) NaN ₃ буфер при pH 7,4, содержащий 3% DMSO, непосредственно ультрацентрифугировали в 0.7-миллиметровый ротор MAS ЯМР при 100000 x g и 4 ° C в течение 40 часов с использованием ротора ультрацентрифуги с качающимся ковшом. На этом этапе использовались специальные самодельные инструменты для наполнения. И нижняя, и верхняя крышки ротора 0,7 мм MAS были приклеены, чтобы избежать потери жидкости или снятия крышек во время MAS. Избыток белка и жидкости после ультрацентрифугирования удаляли перед закрытием 0,7 мм ротора ЯМР MAS. Для экспериментов по обнаружению CSP, 3 мМ UCB-FcRn-303 добавляли к 0,5 мл образца, содержащего 100 мкМ [ ¹³ C, ¹⁵ N] -меченного FcRn _ECD в 25 мМ Na ₂ HPO. ₄ , 100 мМ NaCl, 50 мкМ ЭДТА, 0.02% (мас. / Об.) Буфер NaN ₃ при pH 7,4, содержащий 3% ДМСО (соотношение лиганд: белок 30: 1). Связанный с лигандом образец осаждали во второй 0,7 мм ротор MAS в тех же условиях, что и образец без лиганда.

ЯМР-эксперименты с обнаружением протонов с использованием быстрой MAS на полностью протонированных [

Все эксперименты MAS ЯМР были выполнены на спектрометре Bruker AVANCE III 850 МГц. Спектры регистрировались при 80, 90 или 100 кГц MAS с тройным резонансом 0.Зонд MAS 7 мм (Bruker) и ссылка на 4,4-диметил-4-силапентан-1-сульфоновую кислоту (DSS) (параметры эксперимента см. В таблице S3). Температура образца 283 К контролировалась по частоте резонансной линии воды. Чтобы достичь этой температуры образца, образец охлаждали во время MAS с использованием газообразного азота через охлаждающую установку (BCU II, Bruker) в сильном режиме с потоком газа, установленным на 400 л / ч. Спектры (H) NH, (H) CANH, (H) CA (CO) NH и (H) CBCANH были записаны с использованием этапов переноса намагниченности с перекрестной поляризацией (CP) (гетероядерный перенос) и DREAM (гомоядерный перенос) в соответствии с процедурами описан Penzel et al. [61,75,76].Все спектры обрабатывали с помощью Topspin 3.5 (Bruker) и анализировали с помощью CCPNmr Analysis v. 2.4.2. [77]. Все назначенные химические сдвиги и наблюдаемые CSP перечислены в таблице S1 и данных S2 и депонированы в банке данных биологического магнитного резонанса (BMRB) (номер доступа 27437).

Аналитическое ультрацентрифугирование FcRn

Эксперименты по скорости осаждения проводились при 8 ° C и 35000 об / мин с ротором Ан-60Ti с использованием 12-мм двухсекторных центральных элементов Epon.Для каждого из трех измерений при различных концентрациях FcRn _ECD (4 мкМ, 14 мкМ и 52 мкМ) образец объемом 400 мкл в 10 мМ Na ₂ HPO ₄ , 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, Использовали 1,8 мМ буфер KH ₂ PO ₄ при pH 7,2. Данные были проанализированы и нанесены на график с помощью GUSSI и SEDFIT [78].

Экспериментальные и аналитические детали синтетических аналогов

Все растворители и реагенты использовались в том виде, в котором они были получены от коммерческих поставщиков, если не указано иное.Соединения были названы с использованием пакета Biovia Draw 2016 (IUPAC).

записаны на спектрометре Bruker Avance III HD 500 МГц или 250 МГц.

Указанные химические сдвиги (δ) даны в частях на миллион (ppm), а константы взаимодействия (J) указаны в герцах (Гц). Спиновые множественности представлены как s = синглет, d = дублет, t = триплет, q = квартет, dd = дублет дублета, ddd = дублет дублета дублета, dt = дублет триплета, td = триплет дублета и m = мультиплет.

uPLC-MS выполняли на системе Waters Acquity UPLC, соединенной с детектором Waters Acquity PDA, детектором ELS и МСД (положительный результат сканирования: 150-850). Метод (pH 3): колонка Phenomenex Kinetix-XB C18 (2,1 x 100 мм, 1,7 мкм). Элюирование с линейным градиентом воды + 0,1% муравьиной кислоты и ацетонитрила + 0,1% муравьиной кислоты при скорости потока 0,6 мл / мин. Хиральный анализ SFC: система Waters Thar 3100 SFC, подключенная к детектору Waters 2998 PDA, Chiralcel OD-H 25 см. Хиральное разделение SFC: система Water Thar SFC с насосом Waters Thar FDM, автоинжектор Waters Thar Alias, коллектор фракций Waters Thar и детектор Waters 2998 PDA.

1- [7- (3-фторфенил) -5-метил-4,7-дигидро- [1,2,4] триазоло [1,5-a] пиримидин-6-ил] этанон (CAS 6-95 -3) был приобретен в виде рацемата у Life Chemicals, и смесь была разделена хиральной хроматографией с использованием фазы Chiralpak AD (100 × 500), 300 мл / мин с системой гептан / изопропанол (8/2). 1,21 г исходного материала дает соответственно 577 мг и 588 мг разделенных изомеров.Хиральный аналитический SFC: RT = 8,22 мин, 100% ее; RT = 10,40 мин, 100% ее.

1- [7- (3,5-Дифторфенил) -5-метил-4,7-дигидро- [1,2,4] триазоло [1,5-a] пиримидин-6-ил] этанон (S11 Рис.) .

Перемешиваемый раствор 3,5-дифторбензальдегида (0,1 мл, 0,946 ммоль), пентан-2,4-диона (0,146 мл, 1,42 ммоль, 1,5 экв.) И 4H -1,2,4-триазола -3-Амин (119 мг, 1,42 ммоль, 1,5 экв.) В N, N-диметилформамиде (1,5 мл) облучали в микроволновой печи (до 200 Вт) при 150 ° C в течение 60 мин.Реакционной смеси давали остыть до температуры окружающей среды и добавляли воду (6 мл), что приводило к образованию осадка. Полученное твердое вещество собирали фильтрованием, промывали водой (2 × 1 мл) и циклогексаном (2 × 1 мл), затем растирали в горячем ацетонитриле (1 мл) и сушили в вакууме , получая 94 мг (выход 34%). указанного в заголовке соединения в виде бледно-желтого твердого вещества.

Анализ ¹ H ЯМР дал (500 МГц, ДМСО-d6) δ 10,89 (с, 1H), 7,70 (с, 1H), 7.14 (т, J = 9,1 Гц, 1H), 6,98 (д, J = 6,3 Гц, 2H), 6,46 (с, 1H), 2,46 (с, 3H), 2,20 (с, 3H). uPLC-MS: [M + H] ⁺ m / z = 291, RT = 2,38 мин (99%).

Рацемат (50 мг) разделяли хиральной препаративной хроматографией на фазе Chiralpak ASV (50 * 490), 80 мл / мин с системой гептан / этанол (9/1), чтобы получить 24 мг и 19 мг чистого энантиомеры.Хиральный аналитический SFC: RT = 10,89 мин, 100% ее; RT = 15,16 мин, 97,8% ее.

Метил 7- (3,5-дифторфенил) -5- (3-пиридил) -4,7-дигидро [1,2,4] триазоло [1,5-a] пиримидин-6-карбоксилат (UCB-FcRn -303) (S13 Рис).

К перемешиваемому раствору 3,5-дифторбензальдегида (150 мг, 1,06 ммоль), метил-3-оксо-3- (пиридин-3-ил) пропаноата (265 мг, 1,48 ммоль, 1,4 экв.) И 4H. -1,2,4-триазол-3-амин (124 мг, 1,48 ммоль, 1,4 экв.) В N, N-диметилформамиде (1,5 мл) добавляли хлор (триметил) силан (0.268 мл, 2,11 ммоль) по каплям. Затем реакционную смесь облучали в микроволновой печи (до 200 Вт) при 130 ° C в течение 60 минут. Реакционной смеси давали остыть до температуры окружающей среды и добавляли воду (6 мл), что приводило к образованию осадка. Полученное твердое вещество собирали фильтрованием, промывали водой (2 × 1 мл) и циклогексаном (2 × 1 мл), затем перекристаллизовывали из ацетонитрила (2 мл) и сушили в вакууме с получением 238 мг (выход 59%) указанного в заголовке соединения. в виде бледно-желтого твердого вещества.Анализ ¹ H ЯМР дал (500 МГц, ДМСО-d6) δ 11,18 (с, 1H), 8,67-8,61 (м, 2H), 7,92 (дт, J = 7,8, 1,9 Гц, 1H), 7,75 (с , 1H), 7,48 (дд, J = 7,8, 4,9 Гц, 1H), 7,20 (tt, J = 9,2, 2,2 Гц, 1H), 7,16–7,10 (м, 2H), 6,50 (с, 1H), 3,27 ( с, 3Н). uPLC-MS: [M + H] ⁺ m / z = 370, RT = 2,12 мин (97%).

Вспомогательная информация

S1 Рис. Оценка лигандованности FcRn

При низком pH сайты связывания, способные давать связывание с высокой аффинностью, ограничены границей раздела димера, при этом область описывается как один большой или три отдельных кармана (карманы A-C).При нейтральном и основном pH переходные сайты возникают в сайте связывания альбумина, между спиралями α1 и α2 (D) и между доменами β2m и α3 (E). β2m, β2-микроглобулин; FcRn _ECD , внеклеточный домен неонатального рецептора Fc.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2006192.s001

(JPG)

S2 Рис. Эволюционная консервация FcRn

(A) Структура гетеродимера FcRn _ECD человека с pH 3 окрашена в цвет, чтобы проиллюстрировать сохранение последовательности в ортологах позвоночных.Универсально консервативные остатки окрашены в белый цвет; мутированные остатки показаны красным цветом, причем интенсивность цвета указывает на оценку BLOSUM62 наиболее подходящей замены (более темный красный цвет = более радикальное изменение аминокислоты по сравнению с человеческим остатком). Виды, включенные в анализ: Pan troglodytes , Gorilla gorilla , Pongo pygmaeus , Macaca mulatta , Callithrix aurita , Microcebus musinus , 917culnetus i , Cavia porcellus , Oryctolagus cuniculus и Bos taurus .Мутации происходят по всей α-цепи и β2m. Области явной консервации включают границу раздела α-цепи и β2m, а также центральную полость, которая была обнаружена при анализе SiteMap. (B) Для справки: человеческий FcRn _ECD из структуры FcRn, связанной с HSA (код PDB 4N0F), был окрашен для выделения остатков, которые составляют поверхности с Fc-составляющей IgG (пурпурный) и HSA (оранжевый), α-цепь показана зеленым цветом, а β2m — голубым. β2m, β2-микроглобулин; FcRn, неонатальный рецептор Fc; FcRn _ECD , внеклеточный домен неонатального рецептора Fc; HSA, человеческий сывороточный альбумин; IgG, иммуноглобулин G; PDB, Банк данных белков.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2006192.s002

(TIF)

S4 Рис. Кристаллическая структура соединения UCB-FcRn-84, связанного с FcRn

Соединение связывается на границе раздела β2m (зеленый) и α-цепи (синий). Также в этой кристаллической структуре второй гетеродимер можно найти в асимметричной единице (серый цвет). β2m, β2-микроглобулин; FcRn, неонатальный рецептор Fc; FcRn _ECD , внеклеточный домен неонатального рецептора Fc.

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pbio.2006192.s004

(JPG)

S5 Рис. Кристаллическая структура UCB-FcRn-303, связанного с FcRn

Соединение занимает тот же карман связывания, что и UCB-FcRn-84, на границе β2m (зеленый) и α-цепи (синий). Область связывания представляет собой туннельную полость, проходящую через белок. Опять же, второй гетеродимер обнаружен в кристаллической структуре (изображен серым цветом). β2m, β2-микроглобулин; FcRn, неонатальный рецептор Fc; FcRn _ECD , внеклеточный домен неонатального рецептора Fc.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2006192.s005

(JPG)

S7 Рис. Домены Ch3 и Ch4 (красный) тяжелой цепи IgG в комплексе с FcRn

β2m, β2-микроглобулин; FcRn _ECD , внеклеточный домен неонатального рецептора Fc; IgG, иммуноглобулин G; PDB, Банк данных белков.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2006192.s007

(JPG)

S8 Рис. Сравнение FcRn

(A) 2D ¹⁵ N- ¹ H корреляция с использованием TROSY полностью протонированного [ ¹³ C, ¹⁵ N] -меченного FcRn _ECD , измеренного в растворе. (B) Наложение спектра, показанного на (A) (оранжевый), со спектром 2D ¹⁵ N- ¹ H осажденного полностью протонированного [ ¹³ C, ¹⁵ N] -меченного FcRn _ECD записан на частоте 100 кГц MAS (черный).FcRn _ECD , внеклеточный домен неонатального рецептора Fc; МАС, магическое вращение под углом.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2006192.s008

(JPG)

S9 Рис. Аналитическое ультрацентрифугирование FcRn

Эксперименты по скорости седиментации при трех различных концентрациях (52 мкМ, серый; 14 мкМ, красный; 4 мкМ, синий) демонстрируют пики, зависящие от концентрации белка при 3,5 S, 5,1 S и 5,3 S. FcRn _ECD , внеклеточный домен неонатальный рецептор Fc.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2006192.s009

(JPG)

S2 Данные. Наблюдаемые химические сдвиги и значения CSP FcRn

β2m, β2-микроглобулин; CSP — возмущение химического сдвига; FcRn, неонатальный рецептор Fc; FcRn _ECD , внеклеточный домен неонатального рецептора Fc; MHC1, главный комплекс гистосовместимости класса I.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2006192.s015

(XLSX)

S1 Таблица.

Их сравнивают с соответствующими химическими сдвигами (Beerbaum et al.) [ ² H, ¹³ C, ¹⁵ N] β2m в комплексах MHC1, измеренными с помощью ЯМР в состоянии раствора [63]. Аминокислоты α-цепи изображены синим цветом, остатки β2m — зеленым.β2m, β2-микроглобулин; FcRn _ECD , внеклеточный домен неонатального рецептора Fc; МАС, магическое вращение под углом.

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2006192.s016

(PDF)