Сейма Дади

Кафедра аналитической химии, фармацевтический факультет, Университет Эрджиес, 38039 Кайсери, Турция

Кагла Челик, аналитический факультет

Аптека, Университет Эрджиес, 38039 Кайсери, Турция

Исмаил Осой

Кафедра аналитической химии, фармацевтический факультет, Университет Эрджиес, 38039 Кайсери, Турция

Кафедра аналитической химии, фармацевтический факультет, Университет Эрджиес, 38039 9 Кайсери, Турция Автор, ответственный за переписку.

Поступило 23.06.2020 г .; Принято 2020 22 сентября.

Abstract

Мы сообщаем о создании наноцветков (НЦ) нового поколения с использованием ионов галловой кислоты (GA) и меди (II) (Cu ²⁺ ), действующих как органический и неорганический компонент, соответственно с эффективными имитирующими пероксидазу активностями в растворе и на мембране фильтра.В отличие от типичного механизма синтеза белковых NF, NF галловой кислоты (GA-NF) образовывались в результате координационной реакции между карбоксильными группами GA и Cu ²⁺ . Различные морфологии GA-NF были получены в зависимости от того, являются ли карбоксильные группы в галловой кислоте активными или нет. Имитирующая пероксидазу активность GA-NF основана на реакции Фентона в присутствии перекиси водорода (H ₂ O ₂ ) и была протестирована в отношении м-крезола в зависимости от концентрации GA-NF, м-крезола. , H ₂ O ₂ и время реакции.В оптимизированных условиях окислительное сочетание м-крезола с 4-аминоантипирином (4-AAP) катализировалось GA-NF, диспергированным в растворе и адсорбированным на фильтровальной бумаге с образованием антипиринового красителя, и это регистрировалось визуально и спектрофотометрически. М-крезол с диапазоном 0,05–0,5 мМ был обнаружен через 10 мин и 15 мин при использовании GA-NF в растворе и на фильтровальной бумаге, соответственно. Мы продемонстрировали, что NF могут быть получены из небелковых молекул, а GA-NF могут быть использованы в качестве многообещающего нанокатализатора для различных приложений.

Тематические термины: Биотехнология, Химия, Материаловедение, Нанонаука и технологии

Введение

В последнее время ферментно-неорганические гибридные наноструктуры в форме цветка, названные «наноцветками (NF)», привлекли значительное внимание из-за их значительно увеличенной каталитической активности и стабильность по сравнению со свободными и обычно иммобилизованными ферментами. Причинами повышенной активности и стабильности ферментов NF могут быть: (1) большая площадь поверхности, (2) облегченные ограничения массопереноса, (3) увеличение локальной концентрации ферментов и (4) морфологический кооперативный эффект.Типичный механизм образования NF на основе белков / ферментов основан на образовании комплексов между амидными группами белков / основной цепи ферментов и ионами Cu ²⁺ в фосфатном буферном растворе (PBS). Первоначально ионы Cu ²⁺ реагировали с фосфат-ионами (PO ₄ ^3-) с образованием первичных кристаллов Cu ₃ (PO ₄ ) ₂ , затем молекулы белка связываются с Cu ₃ (PO ₄ ) ₂ первичных кристаллов в результате координационной реакции между амидной группой и Cu ²⁺ с образованием комплексов белок-Cu ₃ (PO ₄ ) ₂ комплексов в качестве зародышей, которые можно назвать «зародышеобразованием» шаг».Непрерывная подача Cu ₃ (PO ₄ ) ₂ с белком приводит к росту семян с образованием больших лепестков, и эти лепестки объединяются друг с другом, что приводит к разветвленным структурам, подобным цветкам, за счет анизотропного роста, что можно назвать «Ступень роста» ^{1 — 6} . Наконец, рост наноцветков достигает насыщения, и их морфология завершается, что можно назвать «этапом завершения». До настоящего времени были произведены различные НФ на основе ферментов, которые использовались во многих биоаналитических приложениях ^{7 — 12} .Например, Ван и его коллеги сообщили о синтезе глюкозооксидазы (GOx) и пероксидазы хрена (HRP) -Cu ₃ (PO ₄ ) ₂ гибридный NF для обнаружения глюкозы в качестве колориметрического сенсора ⁹ . Кроме того, Лу и его коллеги разработали портативный набор для тестирования, приготовленный с включенным ацетилхолинэстеразой-NF гидрогелем агарозы для визуального обнаружения ацетилхолина ¹⁰ .

Более того, хотя ДНК-кэпированные наночастицы золота или оксида железа (НЧ) проявляют внутреннюю пероксидазоподобную активность в виде комбинации ДНК и коллоидных НЧ ^{13 , 14} , недавние исследования показали, что аминокислоты, катехоламин и экстракты растений могут действовать как органические компоненты, а ионы Cu ²⁺ , используемые как неорганические компоненты для изготовления НФ, вместо использования белков / ферментов в качестве органических молекул ^{12 , 15 , 16} .Стоит упомянуть, что аминные и / или карбоксильные группы в биологических или органических молекулах также координированно реагируют с ионами Cu ²⁺ с образованием небелковых NF. Они проявляют пероксидазоподобную и противомикробную активность, благодаря механизму реакции Фентона в присутствии перекиси водорода (H ₂ O ₂ ). Однако о синтезе NF с использованием молекул без аминогрупп не сообщалось, а механизм образования еще не задокументирован.

Фенол и его производные являются побочными промышленными продуктами, которые используются во многих процессах, таких как производство пестицидов, инсектицидов, пластмасс и красок, и оказывают серьезное негативное воздействие на человека и окружающую среду ¹⁷ .Поэтому разработка аналитических методов определения этих соединений имеет большое значение. Было разработано несколько подходов или методов для анализа этих соединений, включая хроматографические ¹⁸ и электрохимические методы ¹⁹ . Однако для этих методов требуются дорогостоящие инструменты, многоэтапные и трудоемкие процедуры, а также обученный персонал. Колориметрическое зондирование привлекло внимание благодаря низкой стоимости, простоте в эксплуатации, одноэтапной и быстрой процедуре обнаружения фенольных соединений ²⁰ .

Здесь мы впервые сообщаем о синтезе NF на основе галловой кислоты (GA-NF) с эффективной каталитической активностью, имитирующей пероксидазу, для колориметрического и спектрофотометрического обнаружения м-крезола. GA-NF проявляли пероксидазную имитирующую активность в присутствии H ₂ O ₂ на основании реакции Фентона. В основном, GA-NF катализируют окисление ряда концентраций (0,05 мМ, 0,1 мМ, 0,2 мМ, 0,3 мМ, 0,4 мМ, 0,5 мМ) м-крезола с 4-AAP в растворе в течение 10 минут (мин) инкубации и продукты детектировались спектрофотометрически и визуально.Кроме того, та же процедура была применена к иммобилизованной на GA-NF мембране фильтра, затем обнаружение м-крезола с такими же концентрациями было выполнено за 15 мин. Различные параметры, такие как концентрация GA-NF, H ₂ O ₂ и время реакции, были исследованы для оптимизации обнаружения м-крезола в растворе и на мембране фильтра.

Результаты

Синтез GA-NF

Синтез органо-неорганических наноцветов (NF) основан на координационной реакции между амидными группами в основной цепи белка и Cu ²⁺ в Cu ₃ (PO ₄ ) ₂ первичный кристалл.Хотя небелковые молекулы, включая аминокислоты (известные как строительные блоки белков), катехоламины или экстракты некоторых модельных растений, действовали как органические компоненты NF, почти во всех недавних исследованиях учитывалась координация между амидной группой и Cu ^2+. как ключевой этап формирования национальных федераций. Похоже, что отбор молекул, содержащих амидную группу, стал обязательным при синтезе НФ, что можно рассматривать как главный недостаток образования НФ.

Здесь мы впервые представляем вдохновляющую работу по созданию наноцветов, включенных в галловую кислоту (GA-NF), с использованием координационной реакции, происходящей между карбоксильной группой GA и Cu ²⁺ .Применяли типичную процедуру синтеза NF: свободный GA добавляли в 10 мМ раствор PBS, содержащий Cu ²⁺ , а затем полученную смесь оставляли для инкубации без нарушения. Карбоксильная группа GA прореагировала с Cu ²⁺ в Cu ₃ (PO ₄ ) ₂ первичных кристаллах с инициированием образования GA-Cu ₃ (PO ₄ ) ₂ комплексов в виде семена. Интересно, что комплексы GA-Cu ₃ (PO ₄ ) ₂ были выращены в виде больших лепестков, и эти лепестки с включенными ГА связывались друг с другом, действуя как клей, как и ранее включенные белки.Затем возникает полная цветочная структура под названием «наноцветок (НЦ)» с насыщением анизотропного роста. Механизм образования GA-NFs шаг за шагом продемонстрирован на схеме.

Иллюстрация потенциального механизма образования GA-NFs с тремя последовательными: образование семян, рост семян и образование наноцветков. Примечание : Серая точка представляет собой первичный кристалл Cu ₃ (PO ₄ ) ₂ , а включенная серая точка синий прямоугольник представляет комплекс GA-Cu ₃ (PO ₄ ) ₂ .

В качестве интересного и достойного подхода систематически исследовалась роль активации карбоксильной группы в морфологии GA-NF. 1-Этил-3- (3-диметиламинопропил) карбодиимид (EDC) и N-гидроксисукцинимид (NHS) в стандартной химии мечения белков или называемой «химией EDC / NHS» использовали для активации карбоксильной группы свободного GA. Затем следовали типичной процедуре синтеза NF, чтобы показать, как активированная карбоксильная группа влияет на морфологию GA-NF.

Была охарактеризована и интерпретирована структура GA-NF с пероксидазной имитирующей активностью в растворе и на мембране фильтра.В нашей системе GA-NF были диспергированы в растворе и физически адсорбированы на мембране фильтра для обнаружения м-крезола, известного как важное опасное соединение, спектрофотометром в УФ-видимой области и невооруженным глазом (рис. A). Реакция окислительного сочетания м-крезола и 4-AAP, катализируемая GA-NF в присутствии H ₂ O ₂ , показана на рис. B.

Схематическая иллюстрация пероксидазной активности ( A ) cGA-NF, диспергированные в растворе и адсорбированные на мембране фильтра, и cGA-NF ( B ) катализируют окислительное связывание между м-крезолом и 4-AAP с образованием окрашенного антипиринового красителя.

Характеристика GA-NF

Структура GA-NF была охарактеризована несколькими методами. Морфологию (форма, размер и свойства поверхности) GA-NF и активированных карбоксильными группами GA-NF (cGA-NF) контролировали с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM). СЭМ-изображения на рис. A, B показывают, что GA-NF имеют сферическую форму с размером ~ 4 мкм. Кажется, что большие лепестки с включенным GA имеют пластинчатую форму, и они вертикально вставлены друг в друга, образуя GA-NF. Маленькие сферы (показаны черным квадратом) на поверхности увеличенного изображения GA-NF на рис.B может указывать на вновь возникшие нанокристаллы GA-Cu ₃ (PO ₄ ) ₂ . Мы предполагаем, что образование GA-NF может происходить кинетически медленно и при непрерывном процессе образования. На рисунке C показано, что при увеличении времени реакции маленькие сферы росли и охватывали поверхность GA-NF в виде поясов (показаны черным прямоугольником). При правильном подходе мы активировали карбоксильную группу ГА, чтобы облегчить координационную реакцию между ГА и Cu ²⁺ . Затем были получены однородные монодисперсные cGA-NF размером ~ 9 мкм с высокопористой структурой, как показано на рис.D. Изображение cGA-NF с большим увеличением также представлено на вставке к рис. D.

Изображения GA-NF, сформированных за ( A , B ) 3 дня, ( C ) 4 дней и ( D ) изображение активированных карбоксильной группой cGA-NF, образовавшихся за 3 дня. На вставке: изображение рис. 2D с большим увеличением.

В качестве дополнительного структурного анализа был использован энергодисперсионный рентгеновский анализ (EDX), чтобы показать присутствие металлической Cu в каркасе Cu ₃ (PO ₄ ) ₂ каркасе (рис.А). Поскольку механизм образования ЯО был хорошо задокументирован, ионы металлов, особенно Cu ²⁺ , действуют как незаменимый компонент краеугольного камня для создания ЯО. Изгиб и растяжение в cGA-NF оценивали с помощью инфракрасной спектроскопии с преобразованием Фурье (FTIR), как показано на рис. B. Для анализа свободного GA (синяя линия) растяжение групп O – H при 3268 см ^-1 , сильное поглощение COOH (карбоновые кислоты) при 1606 см. ^-1 и растяжение C = O при 1467 см. ^-1 относятся к характерным пикам свободного GA.Характерные пики 1029 см ^-1 и 555 см ^-1 относятся к PO ₄ ^3- колебания Cu ₃ (PO ₄ ) ₂ , как показано красной линией ¹⁵ . В то время как колебания PO ₄ ^3- в cGA-NF отнесены к 1038 см ^-1 и 558 см ^-1 , растяжение группы O – H с различной модой, умеренное поглощение COOH и C = O-растяжения наблюдаются при 3419 см ^-1 , 1623 см ^-1 , 1469 см ^-1 соответственно.Согласованность спектров FTIR указывает на наличие NF, содержащих цГА. Положения дифракционных пиков в спектре cGA-NFs показывают, что кристаллическая структура Cu ₃ (PO ₄ ) ₂ · 3H ₂ O (JPSCD 00–022-0548) и NaCl (JPSCD 01-088- 2300) можно увидеть в спектре XRD (рис. C).

Структурный анализ cGA-NF. ( A ) EDX-анализ для определения металлической Cu, ( B ) FT-IR спектр для оценки характеристических пиков и ( C ) XRD-диаграмма cGA-NF (черная линия).Пиковое положение Cu ₃ (PO ₄ ) ₂ · 3H ₂ O (красная линия, JPSCD 00-022-0548).

Обнаружение м-крезола

М-крезол и его s-изомеры о-крезол и п-крезол могут ферментативно окисляться, но с различной эффективностью из-за благоприятного положения заместителей в кольце в их структурах ^{21 , 22} . Мы выбрали м-крезол для каталитической реакции из-за высокой субстратной специфичности при комнатной температуре (RT: 20 ° C).После синтеза cGA-NF мы продемонстрировали, что cGA-NF, активированные карбоксильными группами, проявляют значительно усиленную имитирующую пероксидазу активность по сравнению с GA-NF, образованными из молекулы GA, содержащей неактивированную карбоксильную группу. Причины зависящей от морфологии активности могут быть связаны с высокопористыми и компактными структурами cGA-NF. Как показано на Фигуре ^S1 A, cGA-NF проявляют более высокую пероксидазную активность, чтобы катализировать реакцию между 4-AAP и м-крезолом в присутствии H ₂ O ₂ , чем GA-NF.Затем мы использовали только cGA-NF во всех экспериментах по имитации пероксидазной активности. CGA-NF действовали как реагент Фентона в присутствии H ₂ O ₂ и затем проявляли имитирующую пероксидазу активность посредством реакции Фентона. Потенциальный механизм реакции Фентона состоит в том, что ионы Cu ²⁺ в cGA-NF реагируют с H ₂ O ₂ с образованием Cu ¹⁺ . Следовательно, взаимодействие между Cu ¹⁺ и H ₂ O ₂ привело к образованию высокореакционноспособного гидроксильного радикала (· OH), который катализирует реакцию окислительного сочетания между м-крезолом и 4-AAP с образованием антипиринового красителя в виде окрашенного сложный.Механизм потенциальной реакции Фентона приведен в формуле. ( ¹ ).

Cu2 ++ h3O2 → Cu ++ HOO · + H + Cu ++ h3O2 → Cu2 ++ HO · + OH-

1

Имитирующие пероксидазу активности cGA-NF оценивали в растворе и на мембране фильтра. против м-крезола при различных экспериментальных параметрах. На рис. 2 изучали пероксидазную имитирующую активность cGA-NF, диспергированных в растворе. Соблюдали стандартный протокол активности; окислительное сочетание м-крезола и 4-ААР катализируется cGA-NF с присущей им пероксидазной активностью.CGA-NF (0,5 мг / мл) добавляли в растворы, содержащие 4 мМ 4-AAP, 1 мМ H ₂ O ₂ и м-крезол с рядом концентраций (0,05 мМ, 0,1 мМ, 0,2 мМ, 0,3 мМ, 0,4 мМ, 0,5 мМ), и каждый раствор инкубировали в течение 10 мин, затем его активность проверяли в каждом растворе как функцию концентраций м-крезола (рис. A). Он показывает, что значения поглощения и интенсивность цвета (направление стрелки на фотографии от высокой концентрации к низкой на фиг. A) растворов продуктов увеличивались с увеличением концентрации м-крезола.Использовался тот же протокол активности, что и на рис. А; Активность cGA-NF оценивали по отношению к м-крезолу, фиксированному до 0,4 мМ, в течение разного времени инкубации. 0,4 мМ м-крезол, cGA-NF (0,5 мг / мл), 4 мМ 4-AAP и 1 мМ H ₂ O ₂ смешивали вместе и инкубировали в течение 10 минут, 30 минут, 60 минут и 90 минут. . Оптическую плотность каждого раствора измеряли в УФ-видимом диапазоне. На рисунке B показано, что, хотя интенсивное изменение цвета и высокие значения оптической плотности после каталитических реакций были получены в течение длительного времени инкубации (90 мин и 60 мин), через 10 мин или даже через 5 мин (теперь показаны данные) заметное изменение цвета и увеличение абсорбции были наблюдается (направление стрелки на фото — от большого времени инкубации к короткому на рис.Б). Эффект присутствия H ₂ O ₂ показан на Фигуре ^S2 дополнительной информации. Это показывает, что эффективность реакции окислительного сочетания между 4-ААР и м-крезолом была увеличена с помощью H ₂ O ₂ . Чтобы продемонстрировать активность и стабильность cGA-NF, в реакционный раствор, содержащий 0,5 мг / мл cGA-NF, 0,4 мМ м-крезол, 4-AAP и 1 мМ H ₂ O ₂ , применяли последовательное каталитическое использование. (Рис. C). Мы четко показали, что cGA-NF потеряли 60% своей начальной каталитической активности за шесть циклов, что может демонстрировать высокие каталитические характеристики и стабильность.СЭМ-изображения GA-NF были записаны до реакции (левый на фиг. D) и после шести циклов (правый на фиг. D). Ясно, что морфология GA-NF была немного искажена после шести циклов использования по сравнению с интактным изображением cGA-NF.

Имитирует пероксидазную активность cGA-NF, диспергированных в растворе, в зависимости от концентрации ( A ) м-крезола, ( B ) времени реакции, ( C ) повторного использования ( D ) СЭМ-изображение cGA-NF до реакции и после шестицикловой реакции.

Чтобы использовать cGA-NF в качестве привлекательного нанобиокатализатора, мы нековалентно депонировали cGA-NF на поверхность коммерческой мембраны фильтра, а затем исследовали, как он проявляет имитирующую пероксидазу активность в зависимости от cGA-NF, м-крезола и H ₂ O ₂ концентрация и время реакции. В качестве первого параметра (рис. A) последовательная концентрация cGA-NF была абсорбирована на мембранах фильтра, затем реакционный раствор (4 мМ 4-AAP, 1 мМ H ₂ O ₂ и 0,4 мМ м-крезол ) вводили в каждую мембрану для наблюдения за ее активностью через 15 мин.Замечено, что при использовании фильтрующей мембраны большое количество cGA-NF проявляет очень эффективную каталитическую активность, что вполне согласуется с величиной поглощения и интенсивностью цвета раствора продукта (направление стрелки на фотографии от низкого количества cGA- NFs слишком высоки на мембране фильтра на рис. A). Мы поняли, что адсорбированная фильтрующая мембрана cGA-NFs с концентрацией 2 мг / мл может быть идеальным нанобиокатализатором для дальнейшей реакции благодаря эффективной имитирующей пероксидазе активности. Как упоминалось выше, присутствие H ₂ O ₂ и его концентрация жизненно важны для быстрой и эффективной каталитической активности, как показано на рис.B. Мы зафиксировали концентрацию cGA-NF на мембране фильтра, м-крезола и 4-AAP на уровне 2 мг / мл, 0,4 мМ и 4 мМ, соответственно, затем варьировали концентрации H ₂ O ₂ . Хотя мы не ожидаем какой-либо каталитической активности в отсутствие H ₂ O ₂ , окисление м-крезола осуществлялось катализируемым адсорбированной фильтрующей мембраной cGA-NF, что продемонстрировано величиной поглощения и изменением цвета. Мы предполагаем, что ион Cu ²⁺ в cGA-NF реагирует с м-крезолом с образованием реакции комплексообразования с образованием хелата, затем Cu ²⁺ восстанавливается до Cu ¹⁺ и реакция окислительного связывания m- крезол с 4-ААР возникает в результате окислительно-восстановительной реакции.Интересно, что фильтрующая мембрана проявила наивысшую каталитическую активность как в 40 мМ, так и в 24 мМ H ₂ O ₂ , поскольку значения поглощения и интенсивность цвета раствора продукта определяют это явление (направление стрелки на фотографии — от низкого концентрация H ₂ O ₂ до высокой на рис. B). После определения идеальной концентрации cGA-NF и H ₂ O ₂ исследовали влияние концентрации м-крезола. Рисунок C показывает, что даже самая низкая концентрация м-крезола (0.05 мМ) окислялась мембраной фильтра и обнаруживалась спектрофотометрически и визуально, но через 60 мин, однако, почти такая же каталитическая эффективность была получена при использовании 0,5 и 0,4 мМ м-крезола. Повторное использование фильтрующей мембраны было протестировано в течение шести каталитических циклов, фильтрующая мембрана сохраняла почти 60% своей активности в первом цикле даже после шести циклов (рис. D). Мы предполагаем, что благоприятная конформация cGA-NF может немного измениться после третьего цикла, затем постепенное снижение каталитической активности наблюдалось после третьего цикла.Кроме того, расстояние между лепестками или слоями cGA-NF может уменьшаться, и они могут слипаться друг с другом, тогда на каталитическую активность может отрицательно повлиять после третьего цикла стирки. Мы утверждаем, что cGA-NF, адсорбированные на мембране фильтра, обладали большей прочностью по сравнению с cGA-NF, диспергированными в растворе, поскольку ферментные NF демонстрируют повышенную стабильность по сравнению со свободными ферментами. Мы также отслеживали, как последовательные каталитические реакции влияют на морфологию cGA-NF на мембране фильтра с помощью изображений SEM.СЭМ-изображение фильтрующей мембраны было получено после первого и шести циклов, как видно на верхней части синего столбца (изображение после первого цикла) и оранжевого столбца (изображение после шести циклов), мы проанализировали, что на обоих СЭМ-изображениях не было заметных искажений. Потенциальными причинами снижения каталитической активности фильтрующей мембраны после многократного использования могут быть i) адсорбция избытка м-крезола на поверхности cGA-NF может увеличить ограничения массопереноса и ii) избыток м-крезола может повредить доступный или доступный Ионы Cu ²⁺ и образуют комплексы м-крезол-Cu ²⁺ , оба из которых могут препятствовать выполнению каталитической активности NF.Стоит отметить, что, хотя морфология НФ существенно не изменилась и не нарушилась, каталитическая активность снижается по указанным выше причинам.

Имитирующие пероксидазу активности cGA-NF, адсорбированных на мембране фильтра, в зависимости от ( A) концентрации NF, ( B ) H ₂ O _{2 концентрации} , ( C ) концентрации м-крезола , ( D ) многократное использование.

Обсуждение

Таким образом, мы разработали цГА-НФ как НФ нового поколения и исследовали их пероксидазную имитирующую активность посредством реакции Фентона при диспергировании в растворе и адсорбции на мембране фильтра по отношению к м-крезолу.В процессе синтеза карбоксильная группа молекул GA реагировала с Cu ²⁺ с образованием первичных нанокристаллов cGA-Cu ₃ (PO ₄ ) ₂ , затем кинетически образовывались cGA-NF. Мы также активировали карбоксильную группу GA, затем мы показали, как она влияет на морфологию и пероксидазную имитирующую активность cGA-NF. Имитирующие пероксидазу активности cGA-NF в растворе и на мембране фильтра были оптимизированы при различных экспериментальных параметрах. Как синтез cGA-NF, так и получение cGA-NF осажденной фильтрующей мембраны открыли новые возможности в разработке новой биокаталитической системы.Однородные, монодисперсные и пористые цГА-НФ с присущей им пероксидазной активностью могут быть многообещающей альтернативой НФ, включающим ферменты, и найти широкое применение в различных научных и технических областях.

Материалы

Пентагидрат сульфата меди (II) (CuSO ₄ · 5H ₂ O), м-крезол, галловая кислота, 4-аминоантипирин (4-AAP), пероксид водорода (H ₂ O ₂ , 25% мас. / Об.), Предшественник соли PBS (NaCl, KCl, Na ₂ HPO ₄ , KH ₂ PO ₄ , CaCl ₂ .2H ₂ O, MgCl ₂ .6H ₂ O), 1-этил-3- (3-диметиламинопропил) карбодиимид (EDC) и N-гидроксисукцинимид (NHS) были приобретены у Sigma Aldrich. Шприцевые фильтры из ацетата целлюлозы (0,45 мкм) были получены от Isolab. Все растворы были приготовлены на сверхчистой воде (сопротивление 18,2 МОм). Все химические вещества были аналитической чистоты и использовались без дополнительной очистки.

Методы

УФ-видимая спектрофотометрия (Shimadzu UV1800) была использована для определения пероксидазоподобной активности НФ.Сканирующая электронная микроскопия (SEM, ZEISS EVO LS10) использовалась для визуализации морфологии NF. ИК-спектры НФ записаны на FT-IR (Thermo Scientific Nicolet 6700). Кристаллическую структуру NF и первичный кристалл Cu ₃ (PO ₄ ) ₂ анализировали методом рентгеновской дифракции (XRD, модель Bruker AXS D8 Advance).

Формирование наноцветов галловой кислоты

Органические неорганические наноцветки были синтезированы согласно литературным данным с некоторыми модификациями ¹⁶ .Галловая кислота использовалась как органическая часть, а ион Cu ²⁺ действовал как неорганическая часть для синтеза GA-NF. Вкратце, 0,02 мг / мл галловой кислоты растворяли в дистиллированной воде. Водный раствор CuSO ₄ (120 мМ, 660 мкл) и галловой кислоты добавляли к 100 мл фосфатно-солевого буферного раствора (PBS) (10 мМ, pH 7,4). Смесь интенсивно перемешивали в течение 5 мин для увеличения взаимодействия между Cu ²⁺ и галловой кислотой. После инкубации при 25 ° C в течение 3 дней без перемешивания осадки, образовавшиеся на дне раствора, собирали центрифугированием (5000 об / мин, 10 мин) и несколько раз промывали чистой водой.Полученный продукт сушили при 50 ° C.

Для синтеза cGA-NF 0,02 мг / мл растворяли в растворе PBS (10 мМ, pH 7,4). Раствор смешивали с EDC (10 мМ) и NHS (12 мМ) с последующим перемешиванием в течение ночи при комнатной температуре. Затем к смеси добавляли водный раствор CuSO ₄ (120 мМ, 660 мкл) и инкубировали при 25 ° C в течение 3 дней. Полученные продукты нижней части раствора собирали центрифугированием (5000 об / мин, 10 мин) и несколько раз промывали чистой водой.CGA-NF сушили при 50 ° C.

Обнаружение м-крезола в растворе

М-крезол различной концентрации (0,05 мМ, 0,1 мМ, 0,2 мМ, 0,3 мМ, 0,4 мМ и 0,5 мМ) был добавлен к раствору PBS (0,1 М, pH 7,4). ), содержащий cGA-NF (1 мг / мл), H ₂ O ₂ и 4-AAP (4 мМ). Эти растворы инкубировали при комнатной температуре в течение 15 минут с последующим центрифугированием при 8000 об / мин в течение 5 минут для удаления cGA-NF. Оптическую плотность полученных растворов измеряли на спектрофотометре UV – Vis.

Обнаружение м-крезола на мембране фильтра

Суспензию GA-NF в PBS осаждали на мембране фильтра (мембрана из ацетата целлюлозы 0,45 мкм), и воздух пропускали через фильтр для удаления PBS. Затем смесь, содержащую различные концентрации м-крезола, 4 мМ 4-AAP и H ₂ O ₂ , вводили на фильтрацию с помощью шприца. После инкубации при комнатной температуре в течение различных периодов времени на мембране фильтра продукт собирали в стеклянный флакон и оптическую плотность продукта регистрировали спектрофотометром в УФ-видимом диапазоне.

Дополнительная информация

Благодарности

Мы благодарим Центр исследований и внедрения технологий Университета Эрджиес за помощь в работе SEM. Работа поддержана грантом Научно-исследовательского отдела Университета Эрджиес (FCD-2018-8242).

Вклад авторов

S.D. все эксперименты проводил как первый автор. C.C. способствовал экспериментам И.О. задумал оригинальную идею и спроектировал проект. S.D., C.C.и И. в основном написал рукопись.

Конкурирующие интересы

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Сноски

Примечания издателя

Springer Nature сохраняет нейтралитет в отношении юрисдикционных претензий на опубликованных картах и ​​институциональной принадлежности.

Дополнительная информация

доступна для этой статьи по адресу 10.1038 / s41598-020-73778-7.

Ссылки

Посмотрите на волка с Аппалачской тропы — на открытом воздухе и для отдыха — poconorecord.com

За последние несколько лет этот ежемесячный журнал охватил более трех десятков маршрутов в Поконосе, подчеркнув множество возможностей для отдыха на природе.Сегодняшняя колонка представляет собой самую известную тропу в стране, 229 миль которой пролегают в Пенсильвании.

За последние несколько лет этот ежемесячный журнал охватил более трех десятков маршрутов в Поконосе, подчеркнув множество возможностей для отдыха на природе. Сегодняшняя колонка представляет собой самую известную тропу в стране, 229 миль которой пролегают в Пенсильвании.

Аппалачская тропа была изобретена Бентоном Маккеем в 1921 году, когда он предложил непрерывный пешеходный маршрут через горы восточноатлантических штатов.В 1923 году первые две мили этой тропы были построены в нью-йоркском районе Гарриман в межгосударственном парке Палисейдс; в 1937 г. тропа была завершена.

Сегодня он простирается на 2175 миль от горы Катахдин в штате Мэн до горы Спрингер на севере Джорджии. Самая высокая точка всемирно известной пешеходной дорожки (входящей в состав Службы национальных парков) составляет 6 642 фута на Куполе Клингмана в Грейт-Смоки-Маунтинс.

В нашем регионе Аппалачская тропа фактически не выходит на плато Поконо.Вместо этого он проходит вдоль Киттатинни-Ридж, который образует южную и юго-восточную границу Поконо.

Киттатинни — это название, данное Аппалачским горам в Нью-Джерси и области Делавэр Уотер Гэп (которую пересекает тропа). В штате Нью-Йорк это название меняется на горы Шаванганк (где расположены Мохонк и Минневаска), а в более юго-западных частях Пенсильвании название становится Голубой горой.

Как и в других штатах, Аппалачская тропа обычно идет до вершин горных хребтов, открывая захватывающий вид на окружающие долины, но также приводя к довольно скалистому и труднопроходимому маршруту.

В деревне Делавэр Уотер Гэп к Аппалачской тропе можно добраться со стоянки на Маунтин-роуд возле озера Ленапе. Это очень популярный участок, в основном для людей, которые хотят подняться на высоту от 1 до 2 миль, чтобы полюбоваться великолепным видом на Водный разрыв с горы Минси. Гора Минси и ее партнер из Нью-Джерси, гора Таммани, находятся на высоте около 1500 футов над уровнем моря и резко поднимаются на 1000 футов над рекой Делавэр, которая создала знаменитый Водный разрыв, прорезав здесь гору Киттатинни.

Другой популярный, но менее многолюдный участок Аппалачской тропы находится в нескольких милях к югу от Страудсбурга, где тропа пересекает гребень Маршрута 191. На западной стороне дороги есть свитер, где можно припарковать несколько автомобилей. От этой точки доступа тропа ведет на юг к красивой местности, известной как Волчья скала, с видом на Черри-Вэлли и Поконос. Расстояние в одну сторону составляет около двух миль, и это довольно легко, но вид на Волчью скалу находится над простором упавших валунов, поэтому следует надеть прочные ботинки.

Лес на этом участке тропы состоит из лиственных деревьев второго роста, преимущественно дубов нескольких пород: белого, черного, красного, алого и каштанового дуба. Есть также гикори пигнут и шагбарка, красные и полосатые клены, сассафрас и много черной вишни, черной березы и шадбуша.

Самый крупный представитель рода калины в наших краях, блэкхоу, также обычен в этих засушливых молодых лесах. Многие ростки американского каштана растут из старых корневых систем по всему подлеску леса, что указывает на то, насколько важным было это дерево 100 лет назад до азиатского грибкового ожога.

Другие, менее распространенные деревья, встречающиеся на этом участке тропы: белый ясень, липа, сахарный клен, желтая береза, тюльпанное дерево, американский бук, черный тупело, серая береза, осина с большими зубами, кизил с чередующимися листьями и гамамелис. В нижнем ярусе кустарников преобладает калина кленнолистная, меньшее значение имеют лесной орех, ежевика, малина, малина и серый кизил.

Интересный, частично паразитический член семейства львиных зевов — камышник обыкновенный, или вшейник, — также растет из опавших листьев и дает красивые желтовато-пурпурные цветы над своими папоротниковыми листьями.

Гнездящиеся птицы включают плиссированных и краснобрюхих дятлов, древесного дрозда, алого танагра, овсянки индиго, жареных птиц, а также камышевок и камышевок с каштановыми боками. Летом по лесу порхают также многие тигровые, пряные и черные бабочки-парусники.

На панораме Волчьей скалы внезапно появляются высокие белые сосны и старые рододендроны, а также несколько редких американских рябин. На самом деле это вовсе не ясень, а, скорее, член семейства розово-яблоневых. Это небольшое, в основном канадское дерево дает густые грозди ярких, алых плодов, падающих с верхушек своих ветвей на этот открытый, голый, скалистый утес.Осень также является сезоном, когда можно увидеть перелетных ястребов, проходящих мимо этого мыса на своем пути на юг.

Alimay Events

Живя в джунглях, заполненных бетоном, мы называем Нью-Йорком, иногда прикосновение природы — это именно то, что доктор прописал. Мы твердо убеждены в важности цветочных композиций. Великолепные аранжировки могут занять пространство и действительно превратить его в пространство . Независимо от того, украшаете ли вы место встречи или украшаете наш офис, мы всегда ищем повод обратиться за идеями к блестящему Льюису Миллеру из Lewis Miller Design.Вы знаете тот момент, когда все уходят с приема, а невеста лихорадочно раздает украшения? Мы связались с Льюисом в его штаб-квартире в Ист-Виллидж, 12 ^-й, -стрит, чтобы спросить его, что именно мы должны делать с этими договоренностями, когда вы их доставите домой. Здесь он разбирает центральный предмет 5 различными способами.

Столько возможностей вырисовывается в центре внимания. Несмотря на то, что он великолепен сам по себе, вы также можете сломать его и получить от него немного больше.В сегодняшней композиции главными героями являются следующие цветы; Розы Ив Пиаже, местные бордовые лютики, местная сирень, гвоздики, астильба, пионы Red Charm, калина Snowball, калина Lace.

Для контейнеров Льюис выбрал некоторые предметы, которые можно найти дома, начиная от миски и заканчивая стаканом для питья, или вообще все, что способно удерживать воду. Мы твердо убеждены в том, что использование того, что есть в вашем доме, и повторное использование — всегда лучший вариант, вы знаете, что все будет хорошо сочетаться.

ОБРАЗ 1: Маленькие синие старинные бутылочки с лекарствами

Начиная с маленьких синих старинных бутылочек с лекарствами, возьмите одну-две веточки астильбы, ранункулюса и гвоздики. Гвоздики, как правило, ведут противоречивый образ жизни. Льюис считает иначе. «Они дешевые, хорошо пахнут, такие красивые и бывают разных цветов. Они уродливы, когда видишь их в винном погребе и сочетаешься с не тем. Гвоздики из Голландии, они могут быть великолепными и выглядеть старомодно.Вот небольшой витрины для вашей ванной ». Бинго.

Льюис предлагает снимать листья со всех цветов, чтобы листья не плавали в воде. Это важный совет, потому что листья будут гнить и помещать в воду бактерии, в результате чего ваши цветы умирают быстрее — кто знал? Вы также можете использовать немного подкормки для цветов. Нет под рукой? Используйте лимонно-лаймовую соду, например Sprite. Сделайте ½ Sprite, ½ воды. В Sprite есть лимонная кислота и сахар, это то же самое, что и корм для цветов.

ОБРАЗ 2: Белый Вотив

Поскольку большинство цветов в центральных украшениях имеют короткие стебли, вам понадобится хороший неглубокий контейнер.Белая вотивная чашка отлично подойдет для прикроватной тумбочки. Льюис рекомендует повторно обрезать цветы из композиции под углом 45 градусов с помощью садовых секаторов и вносить свежую воду, чтобы продлить срок службы композиции. Небольшой контейнер может вместить много дырок.

ОБРАЗ 3: Маленькая чаша, большая чаша

«Не бойтесь использовать чаши при расстановке цветов!» Льюис объясняет. У вас будет все, что осталось от композиции, например, красивая гортензия с помпонами, кружево вирбурнум или сирень.Просто запустите их туда ». Они станут отличным дополнением к любому журнальному столику или креденцам.

ОБРАЗ 4: синяя чашка для питья

Для следующего расположения Льюис предлагает обычный стакан для питья. Что-нибудь простое, что можно найти дома. Он использует розы Yves Piaget, выбирая один цвет, чтобы сделать эту небольшую композицию действительно интересной. Он убирает некоторые увядшие лепестки и убирает часть зелени, оставшуюся в центре. «Нет никаких причин, по которым вы не можете создать великолепный миниатюрный силуэт! Не бойтесь использовать зелень цветов.Это отличный наполнитель, благодаря которому вещи выглядят свежо и красиво «.

LOOK 5: Классическая и прозрачная ваза

Для своей последней аранжировки Льюис берет все, что осталось, и создает что-то простое и свободное. «Не переусердствуйте с ними и не задумывайтесь над этим. Просто позволь цветам упасть и делать свое дело ».

Забавно видеть, как вы можете взять что-то, что было размещено в качестве предмета внимания, и создать 5 новых композиций, которые вы можете разложить по всему дому.