Top → vikis → usage (vikis.tmp) Usage Statistics for vikis.lt Summary Period: May 2015 — Referrer Generated 01-Jun-2015 03:35 EEST yoox com интернет магазин официальный, yoox. com, operated by Yoox Net-a-Porter Group S.p.A., is an internationally-focused online store that generates eCommerce net sales primarily in Italy as well as in the United States and Russia. Pemerintah Provinsi Jawa Barat Ditetapkan FORMASI UMUM 0, FORMASI DISABILITAS 0, FORMASI PUTRA/I TERBAIK 0, FORMASI DIASPORA 0 .’-‘.Pemerintah Kab. Aerial 2100 kupit v spb; Купить ваз 21214 бу и частные объявления в Рязани Шкода октавия 2011 год 1.8 найти в Ряжске Киа спортейдж комплектации в Рязанской области ; Вы смотрите раздел Продажа Лада 2115 Самара.

Переводчик – словарь и онлайн перевод на английский, русский, немецкий, французский, украинский и другие языки. | Как перевести «лада калина кросс характеристики

                                               

Калинины

Калинин-несколько русских дворянских родов, духовных и купеческих династий и фамилия многих русских крестьян, казаков и мещан. Калинин — это русская фамилия, носители которой исторически принадлежали к различным слоям общества и сословий, в большей степени-к крестьянству, мещанам и купцам. Дворянские представители чаще всего получали дворянство для военной или гражданской службы в XVIII — XX веках. а также имеют изначально крестьянское, мещанское или купеческое происхождение. Фамилия встречается в разных уголках России и очень распространена. Преобладание фамилии в различных классах обусловлено тем, что она представляет собой фиксированную форму отчества от мужского церковного имени Каллиник, или в просторечии Калина, Калин. Среди духовенства фамилия Калинин, напротив, может быть связана с модой учителей духовных школ и семинарий в конце XVIII — начале XIX centuries.to дайте выпускникам «растительные» или «птичьи» фамилии. В данном случае фамилия происходит от названия дерева Калина. Всемирно известный крестьянский революционер Михаил Иванович Калинин, к родственникам которого многие семьи его однофамильцев причисляли себя еще в XVI веке, что было обусловлено высокой популярностью Калинина и его приемом большого количества XX из народа. Легенды о том, как представители той или иной семьи «ходоков» шли к высокопоставленному родственнику для решения жилищных, служебных, продовольственных и юридических проблем в бурные годы НЭПа, индустриализации и коллективизации передавались во многих калининских семьях из поколения в поколение по всему СССР, что в большинстве случаев не имеет документального подтверждения. Таким образом, образ Калинина был настолько популярен, что его фамилия также считалась «ходили в Москву», а успех, особенно неожиданный в общении с советской бюрократией, объяснялся не чем иным, как благосклонностью дальнего родственника.

ПЛАНЕТА ОБУВИ — Удобная обувь

Последние отзывы

Спасибо всем работникам за доставленное удовольствие в получении модели…

Спасибо большое магазину за быструю доставку.Обувь аккуратно сложена.Всем весеннего настроения и здоровья…

Приобрела красные кроссовки, 40,5, ступня 27см. Очень классные , все подошло. Давно мечтала о таких, хочу приобрести еще и белые..

Очень красивые!Нога смотрится аккуратно,при том,что она у меня очень отекшая.Моя любовь АСКАЛИНИ,сколько бы не хвалила,все будет мало!Покупай те эту модель не пожалеете…

Отличная работа менеджеров…

Спасибо.Прислали то что заказала.Очень понравились и размер подошел как раз.На мою не полную ногу и не большой подъем то что нужно.Еще не сезон носить и кроме как просто примерка ничего сказать нге мо..

рекомендую покупку поскольку скоро весна и такие ботинки будут кстати..

Заказала у вас сапоги , размерные параметры соответствуют , описание тоже , сапоги подошли , кожа очень хорошая , все понравилось , посмотрю , как будут в носке. Спасибо …

Сапоги удобные. При моем росте 176 и довольно длинных ногах — высокие, заканчиваются на 7 см. выше колена. У меня размер 39.5, длина стельки 25, 5 и ориентируясь на размерную таблицу заказала 41, что..

Очень понравились. Ногам тепло и удобно. ..

Хорошие босоножки ,но только на на узкую ногу, не на полную..

На мои проблемные ноги обувь подобрать трудно, но эти снимать не хочется. Размер соответствует. Покупкой очень довольна !..

Очень понравились сапоги! На длину стопы 27 см хорошо подошел 42 разм. Первый раз пошла в сильный гололед, даже ни разу не поскользнулась!!! У меня нога полная, легко застегнулись на 47 см полноты вве..

Все как в описании,размер,полнота ,обхват.Одно не учла,где мех полнота сужается.Буквально 5 мм и вообще шикарно было бы,а так впритык.Но я оставила новые разойдутся .Португалия на подошве написано. На..

Все хорошо. Покупайте эти ботинки и не пожалеете. ..

Вас приветствует «Планета Обуви».

         Это интернет-магазин, в котором представлены тысячи пар женской обуви элитных брендов Европы и России. Обувь – это ключевой компонент в образе и имидже женщины в целом. «Дайте женщине пару хороших туфель, и она покорит весь мир» – говорила обворожительная Мэрилин Монро. Задавая тон стилю, туфли также определяют легкую походку и комфорт своей обладательницы на протяжении всего дня, вносят изюминку, подчеркивают статус. Чтобы было удобно, стильно, элитарно и презентабельно, выбирайте модель из модных коллекций мировых торговых марок.

Особенности выбора: какими характеристиками наделена идеальная обувь?

         Так какие же характеристики должны непременно преобладать в женской обуви? Женская обувь должна приковывать взгляд, быть элегантной и стильной. В нашем каталоге вы найдете модели, обладающие следующими характеристиками:

трендовыми оттенками; аккуратным фасоном, подчеркивающим женские формы; устойчивой колодкой; дорогими, износостойкими материалами; аккуратным пошивом.

         Не забывайте о своем удобстве. Обувь для женщин может быть красивой и изысканной, даже если это балетки на низком ходу. В нашем каталоге вы найдете ассортимент брендовых моделей – это лодочки на шпильке, босоножки на аккуратной танкетке, туфельки на невысоком каблучке, стильные сапожки, ботинки и полуботинки.

Чем отличается «Планета Обуви»?

         Женская обувь, представленная на нашем сайт, – это продукция обувных брендов с громким именем. Мы не реализуем дешевые модели китайского производства, которые продаются в ближайшей рыночной палатке. Несмотря на такую политику, прямое сотрудничество с производителями позволяет нам сохранять демократичные цены на предложенные модели.

         Ассортимент включает обувь для женщин португальского, французского, германского производства, а также брендов Финляндии, других торговых марок Европы и России. Особенностью нашего ассортимента стал модельный ряд для женщин с нестандартными размерами ног. Большинство производителей делает упор на востребованные типоразмеры, оставляя без внимания обладательниц больших или маленьких ножек. Поэтому миниатюрным женщинам с маленькой ножкой приходится искать свою пару в детских магазинах, а женщинам с размерами от 40-го и выше носить непривлекательную и невзрачную обувь. Ассортимент позволит купить женскую обувь с 33 по 44 размер, учитывая полноту ноги.

Обширный выбор

         Именно женская обувь является базой для создания образа. Подобрав оригинальную, стильную и эксклюзивную пару, можно освежить и преобразить даже самый скромный и простой гардероб. Не хотите, чтобы в вашем окружении были женщины в такой же обуви, что и у вас? Мы предлагаем заказать брендовую обувь, которая будет только у вас, поскольку на нашем сайте представлены модели не только брендов с мировым именем, но и дизайнерские новинки от компании. Свежие решения, актуальные оттенки, стильные акценты, натуральные материалы и высокое производство по европейским стандартам – вот наши приоритеты. Среди ассортимента представлены модные экземпляры брендов:

                                                                                                           Ascalini     Rieker     Caprice     Tamaris     Rieker     Aaltonen     Janita     Francesco Donni     Balex и другие.

Туфли, балетки, босоножки, сабо – на любую ногу и на любой вкус по приятным ценам. Приобретая обувь у нас, будьте уверены в точности размеров, отсутствии брака и дефектов. Также мы гарантируем качественный пошив, ровные швы, износостойкость, практичность каждой модели.

Покупка в «Планете Обуви»

         Чтобы купить женскую обувь, выбирайте модель и оставляйте заявку на сайте. Наш менеджер свяжется с вами для уточнения деталей и попутно ответит на все ваши вопросы. Доставка организовывается по всей территории России, а также и в другие страны. Продажа осуществляется онлайн и в обувной сети: мы развиваемся и имеем розничные точки по всей Москве. Поэтому ждем москвичей и гостей столицы на примерку!

Шины, диски, шиномонтаж в Тамбове

Производитель: ВыберитеACURAADMIRALALFA ROMEOASTON MARTINAUDIBENTLEYBMWBRILLIANCEBUGATTIBUICKBYDCADILLACCHANGANCHERYCHEVROLETCHRYSLERCITROENDADIDAEWOODAIHATSUDATSUNDERWAYSDODGEDONGFENGDSFAWFERRARIFIATFORDFOTONFUQIGAC MOTORGEELYGENESISGREAT WALLHAFEIHAIMAHAVALHONDAHUMMERHYUNDAIINFINITIIRAN KHODROISUZUJACJAGUARJEEPKIALADALAMBORGHINILANCIALANDROVERLANDWINDLEXUSLIFANLINCOLNLOTUSLUXGENMANMASERATIMAXUSMAYBACHMAZDAMERCEDES BENZMINIMITSUBISHINISSANOPELPEUGEOTPLYMOUTHPONTIACPORSCHERANGE ROVERRAVONRENAULTROLLS ROYCEROVERSAABSCANIASEATSENSSKODASMARTSSANG YONGSUBARUSUZUKITESLATIANYETOYOTAVOLKSWAGENVOLVOXINKAIZAZZOTYEZXВАЗГАЗЛУАЗМОСКВИЧОКАТАГАЗУАЗ

Модель: Выберите

Год выпуска: Выберите

Модификация авто: Выберите

Подобрать Очистить

Уважаемые посетители, в интернет-магазине KOLOBOX Вы можете купить автомобильные шины и диски в Тамбове, купить мотошины и шины для квадроциклов, записаться на шиномонтаж или просто получить грамотную консультацию по интересующим Вас вопросам.
Автосервис KOLOBOX предлагает Вам огромный спектр услуг, в том числе: бесплатная диагностика авто, диагностика автоэлектрики, техобслуживание автомобиля, ремонт дисков, правка дисков, замена тормозных колодок и замена тормозных дисков. На нашем сайте представлены летние, зимние и всесезонные шины, а также широкий выбор автомобильных дисков. Вы можете купить шины следующих производителей: Bridgestone (Бриджстоун), Michelin (Мишлен), Goodyear (Гудиер), Nokian (Нокиан), Kumho (Кумхо), Maxxis (Максис), Toyo (Тойо), Continental (Континенталь), Yokohama (Йокохама), Pirelli (Пирелли), Nordman (Нордман), Кама, Goodride (Гудрайд), Dunlop (Данлоп), Matador (Матадор), Nitto (Нитто), Contyre (Контайр), Sailun (Сайлун), Sava (Сава), Cordiant (Кордиант), Tigar (Тигар), Gislaved (Гиславед), Viatti (Виатти), BFGoodrich (БФ Гудрич), Avatyre (Аватайр), Tunga (Тунга), Barum (Барум) и других производителей. Сделать покупку возможно, оставив заказ на сайте или заказать звонок, наши специалисты свяжутся с Вами и помогут подобрать продукцию.
Для самостоятельного выбора колёс для Вашего автомобиля, Вам поможет подбор шин и дисков по авто, либо воспользуйтесь формой подбора на главной странице. На сайте представлены, наиболее полным ассортиментом литые, кованные диски и штамповка. Вы можете купить у нас продукцию следующих производителей: Replay (Реплэй), Slik (Слик), LS (ЛС), TG Racing (ТГ Рэйсинг), Yamato (Ямато), Nitro (нитро), NZ (НЗ), Trebl (Требл), Alcasta (Алкаста), IJI, Yokatta (Йокатта), Vianor (Вианор), Nitro N2O (Нитро Н2О), Slik (Слик), Wiger (Вайгер), Скад, Konig (Кёниг), КРКЗ, Enkei (Энкей), YST, Gold Wheel (Голд вил), Sword (Свод), Kronprinz (Кронпринц), KWM, Barret (Баррет), ТЗСК, KFZ, Icon (Айкон), ФМЗ, Advanti (Адванти), Bantaj (Бантаж), Catwild (Катвилд), Legeartis (Легеартис) и многие другие.

Мы рады видеть Вас в качестве наших друзей и партнёров.

Нестационарное течение в канале переменного сечения в условиях периодического импульсного подвода энергии

Джейн Калинина | Вашингтон, округ Колумбия,

Джейн Калинина опирается на свой междисциплинарный фармацевтический и юридический опыт, предоставляя своим клиентам обширные знания о множестве сложных U.S. Регулирующие вопросы Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA).

С начала своей юридической карьеры Джейн сосредоточила свою практику на разработке фармацевтических и биотехнологических продуктов, лицензировании биологических препаратов и применении новых лекарственных средств, управлении жизненным циклом, рекламе и продвижении, а также помощи клиентам в навигации по сложной нормативной базе FDA. В частности, Джейн опирается на свой научный опыт, чтобы по-новому взглянуть на решение юридических проблем, которые тесно связаны с фундаментальными научными проблемами.Во время учебы в юридической школе Джейн закончила программу двойного диплома, чтобы получить свой Pharm.D. и ранее работала в исследовательской лаборатории во время учебы в бакалавриате по микробиологии и клеточным наукам.

Джейн также входит в рабочую группу фирмы по клеточной, тканевой и генной терапии, междисциплинарной группе, которая консультирует компании в этой развивающейся области по меняющимся нормативным и бизнес-проблемам, с которыми они сталкиваются. В составе этой команды Джейн тесно сотрудничает с компаниями, разрабатывающими стволовые клетки, генную терапию, белки и другие клеточные и тканевые продукты, чтобы помочь людям с серьезными проблемами со здоровьем.

Образование и прием

Образование

Доктор медицины, Мэрилендский университет, Школа права Фрэнсиса Кинга Кэри, 2016

Pharm. D., Школа фармацевтики Мэрилендского университета, 2016 г.

Бакалавр наук, Университет Флориды, 2010 г.

Членство

Член Американской ассоциации юристов

Член комитета Austern Writing Awards, Институт права пищевых продуктов и лекарств (2018-2019)

Главный редактор, Maryland Journal of International Law , 2016

Допуск и квалификация адвокатуры

Округ Колумбия

Разговор о «фальшивом пузыре», «пузыре в пузыре» в первый день Открытого чемпионата США

НЬЮ-ЙОРК — Несмотря на все очевидные уступки коронавирусу в U.S. Open — арены почти пустые; тишина, прерываемая редкими хлопками, скрипом кроссовок или ревом струи; отсутствие судей на линии — последствия положительного теста одного игрока вызвали наибольший ажиотаж в День 1.

Да, на первом турнире Большого шлема за почти семь полных месяцев было сыграно много матчей в условиях пандемии.

И да, матчи первого круга были проиграны 16-летней Коко Гауфф среди женщин и девятым сеяным Диего Шварцманом среди мужчин. И выиграли — с посеянным номером 1 Каролина Плишкова, чемпионка 2018 года Наоми Осака и чемпионка 2016 года Анжелика Кербер среди женщин, а также чемпионка №1.1 Новак Джокович, № 4 Стефанос Циципас и № 5 Александр Зверев среди мужчин.

Ad

Но понедельник был значительным для введения в теннисный лексикон таких терминов, как «пузырь в пузыре» и «фальшивый пузырь». Это потому, что семи игрокам разрешили остаться в турнире, в то время как их движения были ограничены. Подвергнутый ежедневному тестированию на COVID-19 после контакта с Бенуа Пэром, француз выбыл с Открытого чемпионата США после положительного результата теста на коронавирус, сообщил Associated Press человек, знакомый с ситуацией.

Игроки не были идентифицированы AP человеком, который говорил на условиях анонимности, потому что Теннисная ассоциация США не объявила имена всех участников.

Но трое игроков из Франции признали свое участие: Кристина Младенович, которая посеяна 30-й в женском одиночном разряде; Адриан Маннарино, 32-е место в мужском одиночном разряде; и Эдуард Роже-Васслен, выступающий в мужском парном разряде.

Младенович и Маннарино рассказали о ситуации после побед в понедельник, сказав, что они были частью группы, которая играла в карты с Пайре.Оба сказали, что трудно сосредоточиться на корте.

Объявление

«Я вроде как морально истощен, но все еще очень рад возможности играть», — сказал Маннарино, который встретится с Джеком Соком из США во втором раунде. «Мне нужно получать от этого как можно больше удовольствия».

Младенович сказала, что она практиковалась с Пэйр около часа и провела 30-40 минут за карточной игрой в холле отеля, используемого USTA для того, что оно назвало «контролируемой средой» — избегая слова « пузырь », используемый такими видами спорта, как НБА, которые более строго ограничивают доступ спортсменов.

«Я в основном нахожусь в новом« пузыре в пузыре », поэтому мне не так уж много разрешено делать, что усложняет мне конкуренцию и психологическую свежесть и готовность», — сказал Младенович, который сложился пополам и громко вскрикнул после победы над Хейли Батист из США 7-5, 6-2.

Батист сказала, что она не знала, что ее противник был одним из игроков, которые контактировали с Пэр. По словам Батиста, она ехала в лифте с Пэр.

Объявление

Маннарино сказал, что его заставили подняться по лестнице в свой гостиничный номер на седьмом этаже, чтобы избежать контакта с другими игроками.

На просьбу описать, что она может и что не может делать, Младенович усмехнулся.

«Давайте упрощаем: мне разрешено сыграть свой матч», — сказала она. «Буквально, ничего другого делать не разрешено».

Директор турнира Стейси Алластер сказала, что игроки, потенциально подверженные воздействию вируса из-за контакта с Пэйр, теперь должны проходить тестирование на COVID-19 ежедневно, а не каждые четыре дня.

Младенович сказала, что ей сказали, что она может проводить время со своим братом, но «ни с кем другим», и ей запретили тренироваться в тренажерном зале и «любых других помещениях, которые были созданы для игроков.

«Мне довольно сложно принять это … потому что я не являюсь частью окружения (Пары)», — сказал Младенович.

Сказал Маннарино: «Мы не в пузыре. Мы живем в «безопасной среде», а это другое дело. Всем действительно трудно чувствовать себя по-настоящему в безопасности ».

Объявление

Пайре, использовавшая термин «фальшивый пузырь» в посте в Instagram, является одним из двух человек, у которых на данный момент был положительный результат теста, и единственным игроком. Другой был фитнес-тренером; два игрока, с которыми он общался — Гвидо Пелла из Аргентины и Уго Деллен из Боливии — были исключены из Western & Southern Open, турнира, предшествовавшего U.S. Открыть на том же сайте.

Что касается разницы между теми двумя игроками, которые потенциально подверглись опасности, когда они были выброшены с поля, и этой более новой группой, оставшейся имеющей право играть, Алластер сказал: «Каждый случай определяется фактами и обстоятельствами. Мы не будем обсуждать, чем они отличаются друг от друга, потому что это защищенная медицинская информация ».

У нее и других официальных лиц есть еще 13 дней, пока они пытаются справиться с проблемами проведения крупного международного спортивного мероприятия в условиях пандемии.

Среди заметных изменений Понедельник: линейные судьи в полном составе только в двух судах; остальные полагаются на судью на кресле и электронные звонки. Все должны носить маски, если они не играют. Игроки должны ходить, чтобы получить свои полотенца, вместо того, чтобы их передавали люди с мячом.

Ad

И, конечно же, никаких хриплых ревов или принижающих голосов.

«Как правило, в первый день Открытого чемпионата США по стадиону обычно царит ажиотаж.Сегодня было просто тихо. Для меня это было очень странно », — сказал Митчелл Крюгер, американец, победивший Педро Соуза, 3-6, 6-2, 7-5, 6-3.« Когда я разминался в 10 утра, это было раз ворота открылись бы в обычный год, и люди (начали бы) бросаться на корты и получать хорошие места для матчей ».

Около 15 человек заняли места на стадионе Луи Армстронга вместимостью 14 000 человек, и Кербер выиграл 6: 4, 6: 4 над Аджлой Томлянович.

Когда Кербер вырвалась, чтобы сыграть первую игру, один человек — ее тренер — хлопнул в ладоши.

«Это какое-то чувство, когда ты играешь, например, тренировочные матчи», — сказал Кербер.

На трибунах Court 11 было семь человек — шесть после того, как один ушел в середине седьмой игры — на 27-м месте Борна Чорич победил Пабло Андухара со счетом 7: 5, 6: 3, 6: 1. Фергус Мерфи насчет управления временем подачи было легко услышать.

Объявление

Андуджар: «На мой взгляд, это слишком быстро…. Не могли бы вы дать еще немного (времени)? »

Мерфи: «Нет».

Андуджар: «Нет?»

И кроме некоторого фальшивого, раздающегося по трубам шума толпы и громкой музыки, ревущей при переключениях, на огромном стадионе Артура Эша почти не было звука во время его первого матча турнира, победы Плисковой 6-4, 6-0 над Анхелина Калинина.

Сказал Плишкова: «Я подумала:« Можно ли мне развеселить себя? »»

___

Следите за сообщениями Говарда Фендрича в Twitter по адресу https: // twitter.com / HowardFendrich

___

Подробнее AP Tennis: https://apnews.com/apf-Tennis и https://twitter.com/AP_Sports

Copyright 2020 The Associated Press. Все права защищены. Этот материал нельзя публиковать, транслировать, переписывать или распространять без разрешения.

Поток генов в генетически модифицированной пшенице

Abstract

Понимание потока генов в генетически модифицированных (ГМ) культурах имеет решающее значение для ответа на вопросы, касающиеся оценки риска и сосуществования ГМ и не ГМ культур. В двух полевых экспериментах мы проверили, различалась ли степень перекрестного опыления между ГМ и не ГМ линиями преимущественно самоопыляющейся пшеницы Triticum aestivum . В первом эксперименте ауткроссинг изучался в пределах поля путем установки «фитометров» одной линии в насаждения другой линии. Во втором эксперименте ауткроссинг изучался на расстоянии 0,5–2,5 м от центрального участка доноров пыльцы до соседних участков реципиентов пыльцы. Перекрестное опыление и ауткроссинг были обнаружены, когда потомство реципиента пыльцы без определенного трансгена содержало этот трансген в гетерозиготном состоянии.Линии ГМ были получены из сортов Bobwhite или Frisal и содержали трансгенов Pm3b или хитиназы /, глюканазы , соответственно, в гомозиготном состоянии. Эти трансгены повышают устойчивость растений к патогенным грибам. Хотя общий уровень ауткроссинга в первом эксперименте составлял всего 3,4%, линии Bobwhite GM, содержащие трансген Pm3b , имели в шесть раз больше шансов дать ауткроссирование потомства, чем контрольные линии без GM. Наблюдались дополнительные вариации в скорости ауткроссинга среди четырех GM-линий, предположительно из-за различных событий инсерции трансгена.Среди доноров пыльцы линия Frisal GM, экспрессирующая трансген хитиназы , вызвала большее ауткроссинг, чем линия GM, экспрессирующая как трансген хитиназы , так и трансген глюканазы . Во втором эксперименте ауткроссинг после перекрестного опыления снизился с 0,7–0,03% на тестовых расстояниях 0,5–2,5 м. Наши результаты показывают, что опосредованный пыльцой поток генов между ГМ и не ГМ пшеницей может вызывать беспокойство только в том случае, если он происходит в пределах полей, например из-за загрязнения семян.Методологически наше исследование демонстрирует, что скорость ауткроссинга между трансгенными и другими линиями внутри сельскохозяйственных культур может быть оценена с использованием фитометрического подхода, и что расстояния между потоками генов могут быть эффективно оценены с помощью анализа ПЦР на уровне популяции.

Образец цитирования: Рибен С., Калинина О., Шмид Б., Целлер С.Л. (2011) Поток генов в генетически модифицированной пшенице. PLoS ONE 6 (12): e29730. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0029730

Редактор: Эдвард Ньюбигин, Мельбурнский университет, Австралия

Поступила: 10 мая 2011 г .; Одобрена: 4 декабря 2011 г .; Опубликовано: 27 декабря 2011 г.

Авторские права: © 2011 Rieben et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Этот проект поддержан Швейцарским национальным научным фондом и является частью пшеничного кластера.ch, подразделения национальной исследовательской программы NRP 59 (SNF 405940-115607). Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Частое использование генетически модифицированных (ГМ) растений в сельском хозяйстве требует углубленной оценки экологического риска [1] — [6]. Возможным последствием высвобождения ГМ-культур может быть непреднамеренный поток генов к не-ГМ-аналогам или к диким родственникам [7] — [12]. Поток генов может увеличить способность популяции реагировать на изменение окружающей среды из-за увеличения генетического разнообразия [13].У растений поток генов происходит не только за счет миграции особей (распространение семян), но также за счет миграции гамет, то есть распространения пыльцы. Поток генов через распространение пыльцы может происходить внутри и между популяциями, а иногда даже между видами [14], [15]. Понимание этого процесса имеет решающее значение для обеспечения сосуществования без обмена генами ГМ и не ГМ культур [16], [17]. В частности, данные о потоке генов, опосредованном пыльцой, необходимы для установления соответствующих расстояний изоляции между ними [18].На практике расстояния изоляции должны быть достаточно большими, чтобы достичь порога маркировки ГМ-случайного присутствия в Европейском Союзе (ЕС) для пищевых продуктов и кормов, который допускает максимальное загрязнение 0,9% ГМ-материала в продуктах, не содержащих ГМ [19].

Предыдущие исследования потока генов у обычной пшеницы, преимущественно самоопыляемого вида [20], показали, что степень перекрестного опыления составляет 1-2% для растений, находящихся в непосредственной близости [13], [21] — [23], что быстро уменьшается с увеличением расстояния между донором пыльцы и получателем пыльцы [20], [24].Однако Lawrie et al. обнаружили, что степень перекрестного опыления при прямом контакте с колючками внутри пергаминовых пакетов может превышать 10% [25]. Есть несколько причин, по которым у пшеницы низкий уровень перекрестного опыления по сравнению с другими видами зерна. Во-первых, оплодотворение обычно происходит до раскрытия цветков, что делает маловероятным опыление чужеродной пыльцой. Во-вторых, хотя пшеница является ветроопыляемым видом [26], ее пыльца относительно тяжелая и быстро оседает по сравнению с другими видами трав [20]. Несмотря на низкую скорость потока генов, максимальное расстояние перекрестного опыления 2.В литературе сообщается о 75 км [27].

Несмотря на то, что существуют многочисленные исследования потока генов на определенных расстояниях, поток генов в насаждениях сельскохозяйственных культур, включая пшеницу, анализировался редко. Такие исследования необходимы для оценки потенциального распространения ГМ-признаков, если ГМ-растения возникают в результате заражения полей, засеянных не ГМ-культурами, из-за зараженного семенного материала или добровольных саженцев [28]. Обычно предполагается, что ГМ-пшеница будет вести себя аналогично обычным сортам, но лишь скудные доказательства подтверждают эту точку зрения [24].

В настоящем исследовании мы использовали ГМ и не-ГМ линии яровой пшеницы Triticum aestivum L. с трансгенами, придающими устойчивость к грибковым патогенам, в качестве модельной системы для оценки потока генов путем перекрестного опыления в насаждениях и на небольших расстояниях в двух полях. эксперименты. Чтобы оценить поток генов в поле, мы посадили саженцы четырех независимо трансформированных Pm3b и соответствующих контрольных линий без ГМ в качестве «фитометров» [29], [30] на участки с четырьмя различными сортами пшеницы (эксперимент 1).Низкая плотность фитометра по сравнению с другими растениями обеспечивала высокое «давление перекрестного опыления» со стороны последних и имитировала ситуацию присутствия дополнительных ГМ-растений на не-ГМ фоне. События ауткроссинга были идентифицированы по гибридному фенотипу растений, выращенных из семян, полученных от растений-фитометров. Чтобы оценить поток генов на небольших расстояниях, мы вырастили 2,5 м полосы контрольных линий без ГМ к востоку и западу от участков ГМ пшеницы размером 1 × 1 м. В этом втором эксперименте мы определили степень перекрестного опыления путем объединения семян потомков контрольных линий и тестирования их на наличие или отсутствие генов устойчивости с помощью молекулярного анализа на уровне популяции.

Цели исследования состояли в том, чтобы (i) измерить поток генов в пределах поля от двух ГМ и двух не ГМ линий, посаженных в качестве донорской пыльцы, до четырех разных пар сестринских линий ГМ / не ГМ, посаженных в качестве фитометров-реципиентов , (ii) для измерения влияния расстояния между ГМ-донором пыльцы и реципиентом не-ГМ пыльцы на скорость перекрестного опыления трех пар сестринских линий ГМ / не-ГМ и (iii) для анализа специфичных для линий различий в скорости перекрестное опыление.

Материалы и методы

Генетически модифицированная пшеница

Мы использовали шесть ГМ линий яровой пшеницы, полученных от мексиканского сорта Bobwhite SH 98 26 или швейцарского сорта Frisal. Четыре линии ГМ из сорта Bobwhite SH 98 26 были получены путем биолистической трансформации в различных событиях трансформации, и каждая линия несла одну копию трансгена Pm3b [30]. Pm3b придает расово-специфическую устойчивость к мучнистой росе и был клонирован из гексаплоидной пшеницы [31]. Трансген был клонирован под контролем промотора убиквитина кукурузы Zea mays L. [32], и трансформанты были отобраны на среде, содержащей маннозу, с использованием гена, кодирующего изомеразу фосфоманнозы (PMI), в качестве селектируемого маркера [33].После регенерации трансформантов T0 были отобраны четыре независимых семейства T1. От каждого семейства T1 в дальнейшем размножали пару потомков, состоящую из гомозиготного GM-растения (линии GM Pm3b # 1–4) и нулевого сегреганта, то есть растения, которое не унаследовало ни трансген Pm3b , ни селектируемый маркер ( линии управления S3b №1–4; [30]).

Две ГМ-линии сорта Frisal были получены путем биолистической трансформации с использованием плазмиды MAGUCUM, содержащей (1) промотор актина-1, β-1,3-глюканазу семян ячменя ( glu ) и терминатор CaMV, (2) промотор убиквитина-1, хитиназа семян ячменя ( chi ), терминатор CaMV и (3) ген bar для отбора [34].Линия GM A9 chi была положительно выбрана для экспрессии хитиназы, а линия A13 chi / glu — для экспрессии хитиназы и глюканазы [35]. Связанные с патогенезом белки хитиназа и глюканаза известны своим широким противогрибковым действием, и их экспрессия должна приводить к повышенной устойчивости к мучнистой росе [36], [37]. Поскольку для GM-линий Frisal у нас не было нулевых сегрегантов, можно предположить, что различия между GM и не-GM линиями в Frisal были связаны не только с вставкой трансгена, но и с дополнительными событиями, которые произошли во время трансформации. , д.грамм. сома-клональные вариации, полученные во время культивирования тканей.

Для полевых экспериментов мы использовали семена, полученные от пятого поколения ГМ линий Pm3b # 1–4 и их соответствующие сестринские линии S3b # 1–4, не являющиеся ГМ, в качестве контролей, а также семена, полученные от шестого поколения ГМ. линии A9 chi и A13 chi / glu и его сорт Frisal в качестве контроля. Кроме того, мы использовали обычный сорт пшеницы Casana в качестве дополнительной контрольной линии без ГМ.

Эксперимент 1: поток генов на участках

Первой частью эксперимента 1 были полевые испытания с линиями ГМ и не ГМ пшеницы, которые проводились с марта по август 2008 года на сельскохозяйственной исследовательской станции в Цюрихе-Реккенхольце, Швейцария [30]. Семена сорта Frisal, его линии GM A9 chi и A13 chi / glu , а также сорта Casana были посеяны на восьми делянках размером 1 × 1,08 м на линию. Эти стенды служили фоном для сбора пыльцы пшеницы.На каждом участке по 400 семян высевали в шесть рядов с расстоянием между рядами 18 см с использованием сеялки для участков Oyjord (Wintersteiger AG, Рид, Австрия). В то же время сеянцы четырех линий Pm3b и четырех соответствующих контрольных линий (S3b # 1–4) были выращены индивидуально в теплице и пересажены в качестве «фитометров» [38] на каждый из 32 полевых делянок, как только они появятся. показал два или три развернутых листа. Каждая из восьми линий была представлена ​​двумя растениями-фитометрами на делянке, в результате получилось соотношение смешивания 16 пересаженных фитометров на 400 посевных фоновых растений.С помощью этой процедуры посадки мы стремились максимально увеличить шансы переноса пыльцы с фоновых растений на растения-фитометры. Более того, это позволило нам позже обнаружить скрещенных потомков, потому что гибриды между Frisal или Casana и Bobwhite морфологически отличаются от родительских сортов. Период цветения фоновых и фитометрических растений регистрировали непрерывно. После созревания семян все растения-фитометры собирали и обмолачивали по отдельности. Семена, происходящие от одного материнского растения-фитометра, в нижеследующем тексте называются семейством семян.Четыре из восьми повторных полевых делянок на фоновую линию получали удобрения дважды в течение вегетационного периода, то есть когда растения разворачивали первый лист и когда флаговый лист становился видимым (каждый раз 3 г Н · м ^–2 вносили как «Ammonsalpeter 27,5»). ”, Лонца, Висп, Швейцария; см. [30] для получения дополнительных сведений о дизайне поля).

Вторая часть эксперимента 1 проходила с марта по август 2010 г. Мы высадили семена потомства восьми линий фитометра из полевого эксперимента 2008 г. обратно на участок.Использовали только растения-фитометры, которые цвели одновременно с соответствующими фоновыми растениями-донорами пыльцы и дали не менее четырех семян. В общей сложности 146 из 265 семейств семян (4 блока × 2 обработки удобрениями × 4 фоновых строки × 8 линий фитометра) соответствовали этим критериям. От каждой семенной семьи было посеяно минимум 4 и максимум 16 семян, в результате чего получилось 1945 индивидуальных потомков. Мы высеяли семена группами по четыре на каждую семенную семью на десять делянок размером 1 × 4 м вручную.Пятна были распределены по позициям и участкам в полностью рандомизированном порядке. Позиции в пределах делянки образовывали сетку из трех рядов с расстоянием между пачками 18 см (60 семенных лоскутков на делянку). Графики были расположены в виде сетки, выровненной по оси X, ведущей с востока на запад, и оси Y, ведущей с юга на север. Участки были окружены дополнительными буферными растениями сорта Bobwhite, чтобы избежать краевых эффектов на тестируемые растения. Осенью 2009 г. перед посевом семян на участки были внесены фосфорно-калийные удобрения из расчета 46 кг P ₂ O ₅ га ^-1 и 60 кг K ₂ O га ⁻¹ .Количество минерализованного азота, определенное в конце февраля 2010 г. в верхних 100 см почвы, составило 41,7 кг N га ^-1 . Азотные удобрения дополнительно вносили сразу после посева (30 кг N га ^-1 ) и еще 30 кг N га ^-1 , когда стали видны флаговые листья растений. Все участки были опрысканы гербицидным коктейлем Concert SX (40% тифенсульфурон, 4% метусульфурон-метил; Stähler Suisse AG, Цофинген, Швейцария) 18 мая.

Мы определили степень перекрестного опыления, разделив количество зрелых потомков гибридов на общее количество зрелых растений на фитометр. Гибриды, полученные перекрестным опылением Bobwhite с помощью Frisal или Casana, заметно отличались по своей морфологии от потомства, полученного путем самоопыления или перекрестного опыления с другими растениями Bobwhite. Они были выше и имели меньшую длину ости, чем родительские сорта, и страдали легким гибридным некрозом, который может возникнуть при скрещивании неродственных сортов пшеницы [39]. Следует отметить, что наша скорость перекрестного опыления эквивалентна скорости ауткроссинга, то есть мы учитывали только успешное опыление с последующим завязыванием семян и ростом потомства как событие опыления.

Для проверки надежности морфологической оценки статуса гибрида все растения, классифицированные как гибриды, и 65 случайно выбранных растений, не классифицированных как гибриды (= предположительно самоопыленное потомство), были протестированы на наличие или отсутствие трансгенов Pm3b , chi и chi / glu с использованием анализа полимеразной цепной реакции (ПЦР). ДНК выделяли из 200–300 мг свежей ткани листа адаптируя методику [40]. Для амплификации гена Pm3b мы выбрали последовательности праймеров, соответствующие промотору убиквитина (5′-ATCTCTGTCGCTGCCTCTGG-3 ‘и 5′-TGTGCGCTCCGAACAACACG-3’; Sigma-Aldrich GmbH, Buchs, Switzerland).Трансгены chi / glu были обнаружены путем амплификации частей гена bar в плазмиде MAGUCM (‘5-TCAACCACTACATCGAGACA-3’ и ‘5-AGTCCAGCTGCCAGAAAC-3’; Sigma-Aldrich GmbH, Buchs, Switzerland). Амплифицированную ДНК отделяли и визуализировали с помощью гель-электрофореза. В целом 97,5% гибридов и предположительно самоопыленных потомков были идентифицированы правильно на основании тестов присутствия / отсутствия трансгенов Pm3b , chi и chi / glu (данные не показаны).Таким образом, мы пришли к выводу, что метод обнаружения гибридов визуальным фенотипированием был подходящим.

Эксперимент 2: поток генов на коротком расстоянии между соседними участками

Второй полевой эксперимент проводился на той же сельскохозяйственной исследовательской станции, что и эксперимент 1, и длился с марта по август 2009 г. Три линии GM Pm3b # 1, Pm3b # 2 и A9 chi и соответствующие им линии без ГМ S3b # 1, S3b # 2 и Frisal выращивали на трех отдельных участках перекрестного опыления 7 × 1 м (Рисунок S1).Каждый участок состоял из одного участка (1 × 1 м) в центре с ГМ-растениями в качестве доноров пыльцы и четырех участков (0,5 × 1 м) на двух противоположных сторонах с соответствующими растениями без ГМ в качестве реципиентов пыльцы. Противоположные стороны находились в восточном или западном направлении от источника пыльцы, потому что преобладающие ветры на участке поля дуют с запада (Рисунок S1). Расстояния между центральным участком и боковыми участками составляли 0–0,5, 0,5–1, 1–1,5 и 2–2,5 м (участок также имел место между 1,5–2 м, но не собирался).Поскольку было четыре повторяющихся блока x восемь участков с реципиентами пыльцы (удаленные участки) x три комбинации линий, размер выборки составлял 32 для каждой тестируемой линии и 96 в целом. Дистанционные участки были засеяны с помощью системы посева делянки Oyjord (Wintersteiger AG, Швейцария), а центральные делянки с источником ГМ пыльцы были засеяны вручную. Плотность высева составляла 400 семян на метр ^–2 , шесть рядов располагались на расстоянии 18 см друг от друга. Участки перекрестного опыления располагались на расстоянии не менее 2 м друг от друга, а промежутки были заполнены высокорослыми растениями тритикале, действующими как барьер для пыльцы, чтобы минимизировать перекрестное опыление между участками.Периоды цветения участков доноров и рецепторов пыльцы были одинаковыми, чтобы обеспечить перекрестное опыление. Азотные удобрения вносили за день до посева (40 кг N га ^-1 ) 25 марта и снова, когда растения распустили первый лист (30 кг N га ^-1 ). Фосфорные и калийные удобрения вносили дважды из расчета 46 кг P ₂ O ₅ га ^-1 и 60 кг K ₂ O га ^-1 , когда растения распустили первый лист и когда флаг лист стал виден. Участки опрыскивали гербицидным коктейлем Concert SX (40% тифенсульфурон, 4% метусульфуронметил; Stähler Suisse AG) и Starane super (120 гл ^-1 бромоксинила, 120 гл ^-1 иоксинила, 100 г ^-1. Флуроксипирметилгептиловый эфир; Omya Agro AG, Сафенвиль, Швейцария) в начале мая. Участки дважды обрабатывали инсектицидом Karate Zeon (100 г l ^-1 Lambda-Cyhalothrin; Syngenta Agro AG, Дильсдорф, Швейцария) против стеблевой мухи пшеницы ( Chlorops pumilionis Bjerk.) в начале мая и через 2 недели.

Для измерения степени перекрестного опыления (и ауткроссинга) на каждом участке расстояния мы использовали анализ ПЦР на уровне популяции, который обнаружил трансгены Pm3b и A9 chi в партиях семян. Односемянный подход был невозможен из-за низкой ожидаемой скорости перекрестного опыления. Оптимальный размер партий семян был определен в пилотном исследовании с использованием муки из партий семян определенного количества ГМ и не ГМ семян. ПЦР-амплификация ДНК, экстрагированной из муки различных партий семян, показала, что одно ГМ-семя может быть надежно обнаружено в смесях ГМ: не ГМ семян 1-10, 1-50, 1-200 и 1-500.Потенциальные скрещивания будут гетерозиготными и, следовательно, будут содержать только 50% ДНК гомозиготных семян ГМ. Принимая это во внимание, мы выбрали партии семян из 100 семян в нашем эксперименте 2 (Рисунок S2).

Для анализа степени перекрестного опыления мы собрали 5 партий по 100 семян на каждый участок и произвели муку из каждой партии (TissueLyser, Qiagen Instruments AG, Хильден, Германия). Чтобы избежать загрязнения ДНК между партиями, сосуды, используемые для измельчения, опрыскивали ДНК-ExitusPlusTM (AppliChem GmbH, Дармштадт, Германия) и инкубировали при 60 ° C в течение 10 минут для увеличения скорости разложения ДНК [41].

ДНК

экстрагировали из 20 мг муки на образец, адаптировав метод [42]. Чтобы проверить экстракты ДНК на присутствие трансгена, мы использовали тот же протокол ПЦР, который описан выше. Если образец дал положительный результат, повторяли экстракцию ДНК и ПЦР. Таким образом, положительные образцы были основаны как минимум на двух независимых экстракциях ДНК и реакциях ПЦР ().

Анализ данных

Влияние фоновых линий и линий фитометра на перекрестное опыление в пределах участка, измеренное как вероятность того, что отдельное дочернее растение будет гибридом, а не предположительно самоопыленным потомством (эксперимент 1), было проанализировано с использованием обобщенных линейных моделей (GLM) с логитом. функция связи и биномиальное распределение ошибок [43].Чтобы учесть потенциальную избыточную дисперсию, экспериментальные факторы были проверены с помощью приблизительных F-тестов, полученных из анализа таблиц отклонений (см. Таблицу S1; [44]). Экспериментальными факторами были засорение, внесение удобрений, линия фитометра с четырьмя контрастами Pm3b по сравнению с контролем, Pm3b # 2 по сравнению с другими тремя линиями Pm3b , вариация между этими тремя линиями Pm3b и вариация между четырьмя контрольными линиями. , фоновая линия с тремя контрастами Frisal vs.Casana, Frisal GM по сравнению с контролем Frisal и Frisal A9 по сравнению с Frisal A13, взаимодействия между этими терминами и индивидуальным фитометром (семя семян; «Остаточные» в Таблице S1). Растения, которые не прорастали или погибали из-за заражения вредителями, были исключены из дальнейшего анализа.

Данные из эксперимента 2, эксперимента с генами на коротких расстояниях, были проанализированы с использованием GLM с функцией логит-связи и биномиальным распределением ошибок (Таблица S2). Зависимой переменной была вероятность найти трансген в партии из 100 семян.В одной модели экспериментальное факторное расстояние было разложено на логарифм контраста (расстояние) и остаточную вариацию между классами расстояний, поскольку коэффициенты перекрестного опыления, вероятно, будут логарифмически уменьшаться с увеличением расстояния до источника пыльцы [45]. Чтобы исследовать различия между очень коротким (0–0,5 м) и удаленным (0,5–2,5 м) потоком генов, мы разделили набор данных и проанализировали оба подмножества по отдельности. Наивысшая возможная оценка степени перекрестного опыления была рассчитана путем деления наблюдаемого количества положительных партий на общее количество партий.Это делает крайне маловероятное предположение, что во всех положительных партиях все 100 семян являются результатом перекрестного опыления. Наименьшая возможная оценка степени перекрестного опыления была рассчитана путем деления положительных образцов на общее количество образцов, умноженное на 100. Это предполагает, что во всех положительных партиях только 1 семя из 100 является результатом перекрестного опыления. Следуя оценке максимального правдоподобия для биномиальных данных, мы вычислили значения, которые с наибольшей вероятностью дали наблюдаемые результаты [46].Таким образом, наш подход обеспечивает оценку, а не прямое измерение количества генного потока. Оценка вероятности: p = 1 — ((n – z) / n) ^{(1 / J)} , где n — общее количество партий, z — положительные партии, а J — количество семян в партия, то есть 100. Все статистические анализы были выполнены с помощью статистической программы R 2.9.2 [47]. Критический уровень значимости для всех анализов составлял 0,05.

Результаты

Эксперимент 1: поток генов на участках

40 из 1192 зрелых растений можно было визуально идентифицировать как гибриды, что указывает на то, что 3.36% всех посевных семян получили пыльцу иностранных сортов пшеницы (фон). В целом 14,4% всех материнских растений дали по крайней мере одно гибридное семя, и 19,6% всех семян таких растений были идентифицированы как гибриды. 21 из 40 гибридов были скрещиваниями между двумя линиями GM, что привело к естественному, но гетерозиготному пирамидированию трансгенов Pm3b и chi или chi / glu .

Идентичность материнской линии, то есть растений-фитометров, значительно влияла на скорость гибридизации (Таблица 1 и Таблица S1): 7. Было гибридизировано 25% всех семян Pm3b , что в 6,2 раза больше, чем для соответствующих контрольных линий без ГМ (P <0,001 при тестировании против семейства семян как остаток в таблице S1). Также наблюдались значительные различия между четырьмя линиями GM, что можно объяснить контрастом между линией Pm3b # 2, у которой было меньше гибридов, и другими линиями Pm3b (P = 0,018). Эта разница между линиями в группе линий GM была, однако, намного меньше, чем разница между линиями GM и контрольными линиями, что можно увидеть, сравнив отклонения в таблице S1 (2.3% против 16,1% от общего отклонения). Не было значительных различий между четырьмя контрольными линиями без ГМ (P = 0,4), что указывает на то, что события во время процесса трансформации и культивирования ткани не вызывали дополнительных изменений между линиями.

Идентичность отцовской линии, то есть фоновых растений, также значительно влияла на скорость гибридизации (Таблица 1 и Таблица S1). Среди отцов Frisal A9 chi опылил больше растений, чем A13 chi / glu (P <0.001 для разницы A9 / A13). Гибриды с отцами Casana имели более короткие ости, чем гибриды с отцами Frisal (P = 0,013 для разницы между отцом Casana / отцом Frisal). У отцов сорта Frisal растения, опыляемые отцами Frisal GM (A9 chi , A13 chi / glu ), имели более короткие ости, чем при опылении отцов из контрольной группы Frisal (P = 0,02 для разницы Frisal A9 и A13 отец / Отец Frisal control).

Наконец, было несколько значительных взаимодействий между материнскими и отцовскими линиями (Таблица S1).Контрольные отцы Frisal опыляли больше матерей контрольной группы, чем отцы Frisal GM, которые, в свою очередь, опыляли предпочтительно GM (= Pm3b ) матерей (P = 0,03 для взаимодействия Pm3b против контроля x Frisal GM против контроля Frisal).

Эксперимент 2: поток генов на коротком расстоянии между соседними участками

Верхняя и нижняя границы предполагаемых коэффициентов перекрестного опыления показаны на Рисунке 1A. Верхняя граница показывает уровни перекрестного опыления, предполагая, что все семена образца из 100 семян были генетически модифицированы, если одно семя было положительным, тогда как нижняя граница предполагает, что только 1 семя в образце из 100 семян было положительным.Используя модель log (расстояние), мы обнаружили более высокую вероятность перекрестного опыления на западе, чем на востоке (P = 0,048 для разницы запад / восток, таблица S2). Более того, растения Frisal A9 chi были более склонны к ауткроссированию, чем растения Bobwhite (P = 0,02 для разницы Bobwhite / Frisal A9 chi ). Мы не обнаружили существенных различий между двумя линиями Pm3b , если объединить данные всех расстояний. Однако, если мы проанализируем участки, наиболее близкие к источнику пыльцы (0–0.5 м) по отдельности, Pm3b # 1 с большей вероятностью вытеснит Pm3b # 2 (P = 0,05 для разницы Pm3b # 1/ Pm3b # 2). Ни разновидности, ни линии, ни направление ветра существенно не различались на участках, удаленных от источника пыльцы (0,5–2,5 м).

Рис. 1. Перекрестное опыление ГМ-пшеницы на короткие расстояния и при двух направлениях ветра.

A: Верхняя и нижняя границы оценок скорости перекрестного опыления (среднее ± 1 SE, обратное преобразование из логит-шкалы) для западных и восточных удаленных участков.Данные по всем линиям были объединены. B: Оценка максимальной вероятности степени перекрестного опыления для западных и восточных участков для линий Pm3b # 1, Pm3b # 2 и A9 chi . Эти оценки указывают на степень перекрестного опыления от 1,2% до 0,16% на ближайших участках и от 0,05% до 0,0% на самых дальних участках.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0029730.g001

Фактические коэффициенты перекрестного опыления находятся между оценками верхней и нижней границы.Мы рассчитали наиболее вероятную скорость перекрестного опыления для каждого участка расстояния, используя метод максимального правдоподобия (рис. 1B). Мы обнаружили, что расчетный общий коэффициент перекрестного опыления составил 0,8% на западе и 0,5% на востоке, если измерять на расстоянии 0–0,5 м от источника пыльцы. Скорость перекрестного опыления снижалась более или менее линейно с логарифмическим увеличением расстояния до источника пыльцы. Тем не менее, наши методы были достаточно точными, чтобы обнаружить случаи перекрестного опыления на расстоянии 2,5 м от источника пыльцы.Обнаруженные нормы 0,05% на западе и 0,02% на востоке будут достаточно низкими, чтобы соответствовать уровням чистоты семян, установленным Европейским Союзом [19].

Обсуждение

Увеличение потока генов до

Pm3b линий пшеницы на поле

О больших различиях между сортами пшеницы в отношении потока генов, опосредованных пыльцой, сообщалось и раньше, и они часто объяснялись различиями в мужской фертильности и морфологических признаках [18], [25], [26]. Однако мы не нашли других сообщений, показывающих более высокую скорость передачи генов, опосредованной пыльцой, к ГМ-растениям, чем к не-ГМ растениям.Поскольку в нашем эксперименте 1 были дополнительные различия между четырьмя GM-линиями Bobwhite, можно предположить, что в зависимости от события вставки конкретный трансген увеличивал скорость ауткроссинга в большей или меньшей степени. Это согласуется с фенотипическими различиями между четырьмя линиями ГМ [30], [48]: линии Pm3b # 2 и # 4 имели, измеренные на других растениях, но в том же полевом испытании, сильно повышенные уровни инфекции спорыньи, что позволяет предположить что их стигматы были открыты в течение длительного периода времени, что также увеличило бы их шансы получить чужеродную пыльцу [30].Длительная экспозиция стигматов могла, в свою очередь, быть связана со снижением мужской фертильности соответствующих GM-линий [18]. Однако остается несоответствие, поскольку линия Pm3b # 2, у которой была высокая инфекция спорыньи и предполагалась пониженная мужская фертильность, на самом деле имела самый низкий уровень материнской гибридизации по сравнению с тремя другими линиями Pm3b .

Помимо способности принимать чужеродную пыльцу, способность опылять другие растения, по-видимому, важна для потока генов, о чем свидетельствуют различия в скорости опыления между отцовскими растениями из разных линий.В этом случае, однако, разница между линиями Frisal non-GM и GM не была значимой, тогда как разница между двумя линиями GM была очень значительной. В отличие от линий Bobwhite GM, у нас не было нулевых сегрегантов для линий Frisal GM. Следовательно, интерпретировать различия между донорами пыльцы труднее, чем между линиями-реципиентами пыльцы. Наконец, значительные взаимодействия между донорскими и реципиентными линиями в нашем эксперименте 1 с более высоким успехом скрещивания для комбинаций не-GM x не-GM и GM x GM, чем для других комбинаций, намекают на сложность способности генетического комбинирования между конкретными линиями [ 49], что демонстрирует важность проверки поведения пересечения линий GM в каждом конкретном случае.

Мы обнаружили, что в среднем 3,36% всех протестированных семян являются результатом гибридизации с соседними растениями. Однако этот коэффициент перекрестного опыления варьировал среди восьми испытанных линий пшеницы в пределах 0,5–8,5%. Эти измерения имеют решающее значение для ответа на вопросы, касающиеся порогового значения 0,9% ЕС для ГМ-семян в урожае [28]. Исследование кукурузы Zea mays L с использованием цветного маркера показало повышенный процент помеченных семян при сборе урожая по сравнению с посевом [50]. Процент заражения при посеве составил 1%, в среднем 2.При сборе урожая в 8 раз больше. Поэтому авторы пришли к выводу, что загрязнение при посеве должно быть на уровне 0,2–0,5%, чтобы гарантировать пороговое значение 0,9% ЕС при сборе урожая. Другими словами, в случае кукурузы чистота семян 0,9% при посеве будет недостаточной для обеспечения порогового значения. Однако для пшеницы, в основном самоопыляемой, увеличение процента ГМ-семян от посева до сбора урожая будет намного меньше даже при наихудших сценариях: при условии, что степень перекрестного опыления составляет 8,5% (максимум, указанный выше) и начальная доля ГМ из 0. 9%, доля при сборе урожая возрастет до 1,084% (семена, гомо- или гетерозиготные по трансгену). В качестве предостережения мы должны упомянуть, что наши растения-фитометры встречались на своих участках с большей частотой, чем можно было бы ожидать от случайных ГМ-растений в культурах, не содержащих ГМ.

Поток генов в пшенице: короткий и случайный

Поток генов на короткие расстояния, оцененный в нашем эксперименте 2 для пшеницы, совпадает с результатами предыдущих наблюдений, в которых средняя скорость перекрестного опыления составляла около 1% в непосредственной близости и быстро снижалась с удалением от источника пыльцы [13].Планируя наш эксперимент, мы ожидали найти более сильное перекрестное опыление на востоке, чем на западе, из-за преобладающих ветров на участке исследования. Как и ожидалось, во время цветения в основном дул западный или северо-западный ветер (данные не показаны). Однако неожиданно мы оценили более высокие показатели перекрестного опыления на западных участках. Данные с ближайшей метеостанции показали, что было несколько часов с восточными или северо-восточными ветрами, в то время как 23% материнских растений цвели. Возможно, перекрестное опыление происходило в основном в эти часы, что затем привело к более высокому перекрестному опылению на западных участках.Поток генов также происходил в основном в направлении, противоположном преобладающим ветрам, в исследовании Gatford et al. [24]. Таким образом, мы пришли к выводу, что для перекрестного опыления важны не только преобладающие ветры, но и ветры в точное время цветения. Следовательно, поскольку время цветения у пшеницы обычно короткое [20], перекрестное опыление может происходить во всех направлениях. Это следует учитывать при планировании экспериментов по перекрестному опылению и определении расстояний изоляции.

Мы смогли обнаружить значительные различия в потоке генов между сортами Bobwhite и Frisal на расстоянии <0.5 мес. При сравнении сортов на делянках, которые находились на расстоянии не менее 0,5 м от источника пыльцы, существенных различий обнаружить не удалось. В соответствии с результатами эксперимента 1, Pm3b # 1 пересекло значительно больше, чем Pm3b # 2, на расстоянии 0,5 м от источника пыльцы. Таким образом, мы пришли к выводу, что различия между разновидностями и линиями в основном проявляются на небольших расстояниях между донором и реципиентом пыльцы.

В качестве методологического следствия наши результаты эксперимента 2 показывают, что объединение может быть подходящим методом для получения информации обо всей популяции.Выборка из 100 собранных семян оказалась оптимальным размером для оценки степени перекрестного опыления на небольших расстояниях с использованием метода максимального правдоподобия. Объединенные измерения на больших расстояниях или отдельные измерения даже на самом коротком расстоянии привели бы к (слишком) большому количеству отрицательных результатов. Выбор правильного расстояния позволяет не только определить наличие или отсутствие потока генов, но и оценить количество перенесенной пыльцы на основе вероятностных расчетов.

Выводы

Наши результаты показывают, что ГМ линии пшеницы могут отличаться по поведению ауткроссинга от не ГМ контрольных линий. Мы обнаружили, что материнские растения Bobwhite с трансгеном Pm3b были более склонны к гибридизации с другими сортами пшеницы, чем материнские растения Bobwhite без ГМ. Эта вероятность варьировалась даже для разных линий GM. Одной из возможных причин этого могло быть более или менее продолжительное время цветения и проявление стигматизации среди ГМ-линий из-за более или менее сниженной мужской фертильности [18].Мы также обнаружили, что отцовские растения Frisal с трансгеном chi давали больше потомства, чем отцовские растения Frisal с трансгенами chi и glu , снова демонстрируя различное поведение ауткроссинга даже среди разных ГМ-линий. Наконец, мы смогли продемонстрировать, что гибриды с двумя или даже тремя трансгенами могут возникать, если разные ГМ-растения высаживаются в непосредственной близости. Такие заводы могут еще больше усложнить оценку экологического риска.

Поскольку степень перекрестного опыления сильно различалась между ГМ и не-ГМ линиями, а также между ГМ-линиями, может быть трудно разработать универсальные модели опосредованного пыльцой потока генов в пшенице.Наши результаты показывают, что вместо этого потребуется индивидуальный подход [5]. Скорость потока генов, которую мы измерили в нашем эксперименте 2, показывает, что поток генов у пшеницы в основном происходит на короткие расстояния. Однако в пределах поля 14,4% всех материнских растений получали пыльцу от соседних растений, а 3,4% всех семян потомства были получены от соседних растений. Каждое гомозиготное ГМ-растение, вероятно, будет скрещиваться с несколькими соседями, что приведет к растениям, гетерозиготным по трансгену. Следовательно, доля ГМ-растений в популяции, вероятно, увеличится.Если мы возьмем степень перекрестного опыления 3,4% и предположим, что исходное загрязнение ГМ составляет 0,9%, 0,931% всех семян потомства будут содержать по крайней мере одну копию трансгена. Если бы все растения подвергались перекрестному опылению, этот показатель увеличился бы до 1,79% за одно поколение. Мы пришли к выводу, что определение уровней перекрестного опыления на поле может быть более важным, чем перекрестное опыление на расстоянии, чтобы определить соответствующие пороговые пределы, необходимые для сосуществования ГМ и традиционных систем земледелия.

Благодарности

Мы благодарим Y. Hautier, X. Li и M. Zach за обсуждения и комментарии, S. Geinitz за математические советы, национальную исследовательскую станцию ​​Agroscope Reckenholz-Tänikon ART за организацию полевых экспериментов, S. Nägeli за волонтерство и многочисленных помощников. в области оказания помощи, Г. Херрену, С. Бруннеру, К. Диасу Кихано и Р. Хуси за помощь в лаборатории и Метео Швейц за предоставление климатических данных. Мы очень благодарны за очень полезные комментарии двух анонимных рецензентов и Дэна Флинна.

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: BS SZ OK. Проведены опыты: СР СЗ ОК. Проанализированы данные: СР СЗ БС. Написал статью: SR SZ BS.

Список литературы

1. 1. Вольфенбаргер Л.Л., Файфер П.Р. (2000) Экологические риски и преимущества генетически модифицированных растений. Наука 290: 2088–2093.
2. 2. Челлини Ф., Чессон А., Колкухун И., Констебль А., Дэвис Х. В. и др. (2004) Непредвиденные эффекты и их обнаружение в генетически модифицированных культурах.Пищевая и химическая токсикология 42: 1089–1125.
3. 3. Коннер AJ, Glare TR, Nap JP (2003) Выпуск генетически модифицированных сельскохозяйственных культур в окружающую среду. Часть II. Обзор оценки экологического риска. Журнал растений 33: 19–46.
4. 4. Snow AA, Andow DA, Gepts P, Hallerman EM, Power A и др. (2005) Генетически модифицированные организмы и окружающая среда: текущее состояние и рекомендации. Экологические приложения 15: 377–404.
5. 5. Andow DA, Zwahlen C (2006) Оценка экологических рисков трансгенных растений.Письма по экологии 9: 196–214.
6. 6. Группа EFSA по генетически модифицированным организмам (ГМО) (2010) Руководство по оценке экологического риска генетически модифицированных растений. EFSA Journal 8 (11): 1879. DOI 10.2903 / j.efsa.2010.1879.
7. 7. Jørgensen RB, Andersen B (1994) Спонтанная гибридизация между масличным рапсом ( Brassica napus ) и сорняком Brassica campestris (Brassicaceae) — рост выращивания генетически модифицированного масличного рапса.Американский журнал ботаники 81: 1620–1626.
8. 8. Даниелл Х (2002) Молекулярные стратегии сдерживания генов в трансгенных культурах. Природная биотехнология 20: 581–586.
9. 9. Ригер М.А., Ламонд М., Престон С., Поулс С.Б., Руш Р.Т. (2002) Опосредованное пыльцой перемещение устойчивости к гербицидам между коммерческими полями канолы. Наука 296: 2386–2388.
10. 10. Мерсер К.Л., Уэйнрайт Д.Д. (2008) Поток генов от трансгенной кукурузы к старым сортам в Мексике: анализ.Сельское хозяйство, экосистемы и окружающая среда 123: 109–115.
11. 11. Пиньейро-Нельсон А., Ван Хеерваарден Дж., Пералес Х. Р., Серратос-Эрнандес Дж. А., Рангель А. и др. (2009) Трансгены мексиканской кукурузы: молекулярные доказательства и методологические соображения для обнаружения ГМО в популяциях староместных сортов. Молекулярная экология 18: 750–761.
12. 12. Schoenenberger N, Guadagnuolo R, Savova-Bianchi D, Küpfer P, Felber F (2006) Молекулярный анализ, цитогенетика и линии фертильности и интрогрессии от трансгенной пшеницы до хозяина Aegilopsis cylindria.Генетика 174: 2061–2070.
13. 13. Густафсон Д.И., Хорак М.Дж., Ремпель С.Б., Мец С.Г., Gigax DR и др. (2005) Эмпирическая модель потока генов, опосредованного пыльцой пшеницы. Crop Science 45: 1286–1294.
14. 14. Левин Д., Керстер Х. (1974) Поток генов в семенных растениях. Эволюционная биология 7: 139–220.
15. 15. Хедрик П.В. (2004) Генетика популяций. Садбери, США: Джонс и Бартлетт Обучение. 737 с.
16. 16. Вебер В.Е., Бринджезу Т., Броер И., Эдер Дж., Хольц Ф. (2007) Сосуществование зерновых культур с ГМ и без ГМ — протестировано в 2004 году на уровне поля (Erprobungsanbau 2004).Журнал агрономии и растениеводства 193: 79–92.
17. 17. Pla M, Paz J-L, Peñas G, García N, Palaudelmàs M и др. (2006) Оценка методов на основе ПЦР в реальном времени для количественной оценки опосредованного пыльцой потока генов от GM до обычной кукурузы в полевых исследованиях. Трансгенные исследования 15: 219–228.
18. 18. Waines JG, Hegde SG (2003) Внутривидовой поток генов в мягкой пшенице под влиянием репродуктивной биологии и экологии опыления цветов пшеницы. Наука о растениеводстве 43: 451–463.
19. 19. Beckie HJ, Hall LM (2008) От простого к сложному: моделирование потока генов, опосредованного пыльцой сельскохозяйственных культур. Растениеводство 175: 615–628.
20. 20. Де Фрис А.П. (1971) Биология цветения пшеницы, особенно с точки зрения производства гибридных семян — обзор. Euphytica 20: 152–170.
21. 21. Де Фрис А.П. (1974) Некоторые аспекты перекрестного опыления пшеницы ( Triticum aestivum L.). 4. Засев семян на растения с мужской стерильностью зависит от расстояния от источника пыльцы, соотношения опылителя и мужской стерильности и ширины полосы мужской стерильности.Euphytica 23: 601–622.
22. 22. Griffin WB (1987) Ауткроссинг у новозеландских пшениц, измеренный по появлению пурпурного зерна. Новозеландский журнал сельскохозяйственных исследований 30: 287–290.
23. 23. Мартин Т.Дж. (1990) Ауткроссинг у двенадцати твердых сортов красной озимой пшеницы. Crop Science 30: 59–62.
24. 24. Гатфорд К., Басри З., Эдлингтон Дж., Ллойд Дж., Куреши Дж. И др. (2006) Генетический поток трансгенных пшеницы и ячменя в полевых условиях. Euphytica 151: 383–391.
25. 25. Лори Р.Г., Матус-Кадис М.А., Хукл П. (2006) Оценка показателей ауткроссинга яровой пшеницы с использованием контактного метода. Наука о растениеводстве 46: 247–249.
26. 26. Истхэм К., Свит Дж. (2002) Генетически модифицированные организмы (ГМО): значение потока генов через перенос пыльцы; Д.Г., редактор. Копенгаген, Дания: Европейское агентство по окружающей среде. 75 с.
27. 27. Matus-Cádiz MA, Hucl P, Dupuis B (2007) Пыльце-опосредованный поток генов в пшенице в промышленных масштабах.Crop Science 47: 573–579.
28. 28. Грациано С.М., Бартлетт М., Перрингс С. (2007) Поток генов ландшафта, сосуществование и пороговый эффект: случай генетически модифицированного устойчивого к гербицидам масличного рапса ( Brassica napus ). Экологическое моделирование 205: 169–180.
29. 29. Клементс Ф. Э., Голдсмит Г. В. (1924) Фитометрический метод в экологии: растения и сообщества как инструменты. Вашингтон: Институт Карнеги Вашингтона. 106 с.
30. 30.Зеллер С.Л., Калинина О., Бруннер С., Келлер Б., Шмид Б. (2010) Взаимодействия трансгена × среда в генетически модифицированной пшенице. PloS ONE 5: e11405.
31. 31. Yahiaoui N, Srichumpa P, Dudler R, Keller B (2004) Анализ генома на разных уровнях плоидности позволяет клонировать ген устойчивости Pm3b к мучнистой росе из гексаплоидной пшеницы. Журнал растений 37: 528–538.
32. 32. Christensen AH, Quail PH (1996) Векторы на основе промотора убиквитина для высокого уровня экспрессии селектируемых и / или скрининговых маркерных генов в однодольных растениях.Трансгенные исследования 5: 213–218.
33. 33. Рид Дж., Привалл Л., Пауэлл М.Л., Мегджи М., Доусон Дж. И др. (2001) Фосфоманнозоизомераза: эффективный селективный маркер для трансформации растений. In vitro клеточная биология и биология развития растений 37: 127–132.
34. 34. Блиффельд М., Манди Дж., Потрикус И., Футтерер Дж. (1999) Генная инженерия пшеницы для повышения устойчивости к мучнистой росе. Теоретическая и прикладная генетика 98: 1079–1086.
35. 35.Bieri S, Potrykus I, Futterer J (2003) Эффекты комбинированной экспрессии противогрибковых белков семян ячменя в трансгенной пшенице на инфекцию мучнистой росы. Молекулярное разведение 11: 37–48.
36. 36. Лия Р., Томмеруп Х, Свендсен И., Манди Дж. (1991) Биохимическая и молекулярная характеристика трех белков семян ячменя с противогрибковыми свойствами. Журнал биологической химии 266: 1564–1573.
37. 37. Zhu Q, Maher EA, Masoud S, Dixon RA, Lamb CJ (1994) Повышенная защита от грибковой атаки путем конститутивной коэкспрессии генов хитиназы и глюканазы в трансгенном табаке.Природная биотехнология 12: 807–812.
38. 38. Калинина О., Целлер С.Л., Шмид Б. (2011) Конкурентоспособность трансгенной пшеницы, устойчивой к мучнистой росе. PLoS ONE 6: e28091.
39. 39. Hermsen JGT (1963) Гибридный некроз как проблема селекционера пшеницы. Euphytica 12: 1–16.
40. 40. Stein N, Herren G, Keller B (2001) Новый метод экстракции ДНК для высокопроизводительного анализа маркеров у видов с большим геномом, таких как Triticum aestivum. Селекция растений 120: 354–356.
41. 41. Esser K, Marx WH H, Lisowsky T (2006) Обеззараживание ДНК: новый продукт DNA-ExitusPlus ™ по сравнению с обычными реагентами. БиоТехники 40: 238–239.
42. 42. Кан Х.В., Чо Ю.Г., Юн У.Х., Ын М.Ю. (1998) Метод быстрой экстракции ДНК для анализа ПДРФ и ПЦР из одного сухого посевного материала. Репортер по молекулярной биологии растений 16: 1–9.
43. 43. McCullagh P, Nelder JA (1989) Обобщенные линейные модели (Монографии CRC по статистике и прикладной вероятности).Лондон: Чепмен и Холл. 532 с.
44. 44. Кроули MJ (2007) Книга R. Чичестер, Великобритания: John Wiley & Sons. 950 с.
45. 45. Альбрехт М., Дуэлли П., Обрист М.К., Клейн Д., Шмид Б. (2009) Эффективное распространение пыльцы на большие расстояния у Centaurea jacea. PloS ONE 4: e6751.
46. 46. Фишер Р.А. (1922) О математических основах теоретической статистики. Философские труды Лондонского королевского общества 222: 309–368.
47. 47.R Development Core Team (2010) R: Язык и среда для статистических вычислений. Вена, Австрия: Фонд R для статистических вычислений.
48. 48. Бруннер С., Хурни С., Херрен Г., Калинина О., фон Бург С. и др. (2011) Трансгенные линии пшеницы Pm3b демонстрируют устойчивость к мучнистой росе в полевых условиях. Журнал биотехнологии растений: Журнал биотехнологии растений 9: 897–910.
49. 49. Schmid B, Dolt C (1994) Влияние материнской и отцовской среды и генотипа на фенотип потомства Solidago altissima L.Эволюция 48: 1525–1549.
50. 50. Dietiker D, Oehen B, Ochsenbein C, Westgate ME, Stamp P (2011) Полевое моделирование дисперсии примеси трансгенных семян в кукурузе с синим маркером цвета ядра. Наука о растениеводстве 51: 829–837.

Наталья Калинина | МГУ

Наталья Калинина | МГУ — Academia.edu

Academia.edu больше не поддерживает Internet Explorer.

Для просмотра Academia.edu и более широкий Интернет быстрее и безопаснее, пожалуйста, обновите свой браузер за несколько секунд.

Papers

RNA, 2012

Ранее мы обнаружили, что подавление сайленсинга белком 2b и шестью мутантами коррелировало как … подробнее Ранее мы обнаружили, что подавление сайленсинга белком 2b и шестью мутантами коррелировали как с их способностью связывать к двухцепочечным (ds) малым РНК (мРНК) in vitro и с их ядерной / ядрышковой локализацией.Чтобы еще больше различить вклад в активность супрессии связывания мРНК и ядерной локализации, мы охарактеризовали кинетику связывания in vitro с дц-мРНК, одноцепочечной (оц) мРНК и микроРНК (миРНК) нативного 2b белок и восемь мутантных вариантов. Мы также добавили сигнал ядерного экспорта (NES) к белку 2b и оценили, как он влияет на субклеточное распределение и супрессорную активность. Мы обнаружили, что в растворе нативный белок связывает ds siRNA, miRNA и ss sRNA с высоким сродством при молярном соотношении белок: РНК ~ 2: 1.Из четырех мутантов, которые сохранили супрессорную активность, три показали профили связывания мРНК, аналогичные профилям нативного белка, тогда как оставшийся один связывал оц-мРНК в молярном соотношении 2: 1, но обе дц-мРНК с аффинностью в 1,5-2 раза немного ниже. Три из четырех мутантов, лишенных супрессорной активности, не смогли связываться с какой-либо мРНК, тогда как оставшийся один связал их в гораздо более высоких соотношениях. NES-меченный белок 2b стал цитоплазматическим, но супрессивная активность в тестах с пластырем осталась неизменной. Эти результаты подтверждают связывание с мРНК в молярных соотношениях, равных или близких к 2: 1, что является критическим для супрессорной активности белка 2b.Они также показывают, что локализованный в цитоплазме белок 2b сохраняет супрессорную активность и что устойчивая ядерная локализация не требуется для этой функции.

PaperRank:

Читатели Упоминания по темеПросмотреть влияние

PLoS ONE, 2013

PaperRank:

Читатели Упоминания по темеПросмотреть влияние

Molekuliarnaia biologiia

РЕЗЮМЕ Было проведено исследование взаимодействия in vitro вирионов (CP) белков оболочки th … подробнее РЕФЕРАТ Было проведено исследование in vitro взаимодействия вирионов и белка оболочки (CP) вируса X картофеля (PVX) с микротрубочками (MT).И вирионы, и ЦП совмещены с МТ, стабилизированным таксолом. В присутствии PVX CP тубулин полимеризуется с образованием структур, устойчивых к холоду. Электронная микроскопия выявила аберрантный характер образующихся полимеров тубулина (протофиламентов и их листов), которые отличались от МТ, собранных в присутствии клеточного MAP2. Напротив, вирионы PVX индуцировали сборку морфологически нормальных МТ, чувствительных к холоду. Было показано, что вирионы конкурируют с MAP2 за связывание MT, что предполагает перекрытие сайтов MT, взаимодействующих с MAP2 и с вирионами PVX.Предполагалось, что вирионы ХВК взаимодействуют с МТ in vivo и, следовательно, элементы цитоскелета участвуют во внутриклеточной компартментализации генома ХВК.

PaperRank:

Читатели Статьи по теме УпоминанияView Impact

Journal of General Virology, 2015

Белок движения Hordeivirus, кодируемый первым геном тройного генного блока (белок TGB1, TG … подробнее Белок движения Hordeivirus, кодируемый первым геном тройной блок генов (белок TGB1, TGBp1) взаимодействует in vivo с вирусными геномными и субгеномными РНК с образованием частиц рибонуклеопротеина (РНП), которые считаются формой вирусного генома (не-вирионной транспортной формой), способной к передаче от клетки к клетке. и перенос на большие расстояния инфицированных растений.Структура этих RNP не выяснена. Полулатентный вирус Poa (PSLV) TGBp1 содержит структурированный C-концевой домен NTPase / геликазы и N-концевую область удлинения, состоящую из двух доменов — полностью внутренне неупорядоченный крайний N-концевой домен и внутренний домен (ID) со структурой, напоминающей частично неупорядоченная расплавленная глобула. Здесь мы охарактеризовали структуры, собранные in vitro с помощью полноразмерного PSLV TGBp1 отдельно или в присутствии вирусной РНК. PSLV TGBp1 был способен к мультимеризации и самосборке в протяженные высокомолекулярные комплексы.Эти комплексы распадаются на мономеры при инкубации с АТФ. При инкубации с вирусной РНК, PSLV TGBp1 in vitro образовывал структуры РНП, которые выглядели как нитчатые частицы, напоминающие вирионы спиральных нитчатых вирусов растений по морфологии и размерам. Сравнивая биофизические характеристики PSLV TGBp1 и его доменов в присутствии и в отсутствие РНК, мы показываем, что ID играет основную структурную роль в самовзаимодействиях и РНК-взаимодействиях TGBp1, ведущих к сборке вирусоподобных частиц РНП.

PaperRank:

Читатели Связанные статьи УпоминанияView Impact

Методы молекулярной биологии (Клифтон, Нью-Джерси), 2008 г.

Вирусы растений распространяются от первоначально инфицированных клеток к остальной части растения различными способами … подробнее Вирусы растений распространяются из первоначально инфицированные клетки остальной части растения в несколько различных стадий. Сначала вирус (в форме вирионов или белковых комплексов нуклеиновых кислот) перемещается внутриклеточно от мест репликации к плазмодесматам (PD, межклеточные мембранные каналы, специфичные для растений), затем вирус пересекает PD для межклеточного распространения (от клетки к клетке). движение клеток).Перемещение вируса на большие расстояния происходит через ситовые трубки флоэмы. Процессы перемещения вирусов растений контролируются специфическими белками вирусного перемещения (MPs). У МП, принадлежащих к разным таксономическим группам вирусов растений, не обнаружено обширного сходства последовательностей. Более того, было показано, что разные MP используют разные пути и механизмы для транспорта вируса. Некоторым вирусным транспортным системам требуется один MP, в то время как другим необходимы дополнительные белки, кодируемые вирусом, для транспортировки вирусных геномов. В этом обзоре мы сосредоточимся на функциях и свойствах различных классов MPs, кодируемых RNA con…

PaperRank:

Читатели Статьи по теме УпоминанияView Impact

Журнал общей вирусологии, 2001

Различные функции белка перемещения от клетки к клетке (MP) вируса розетки арахиса (GRV) были … подробнее Различные функции белка перемещения от клетки к клетке (MP) вируса розетки арахиса (GRV). Иммунофлуоресцентная микроскопия показала, что белок, кодируемый ORF4 GRV, генерирует трубчатые структуры, которые выступают из поверхности протопласта.Белок, кодируемый ORF4, оценивали также на РНК-связывающие свойства. Этот белок был помечен на его С-конце шестью остатками гистидина, продуцирован в Escherichia coli с использованием вектора экспрессии и очищен с помощью аффинной хроматографии. Анализ задержки геля показал, что, в отличие от многих других вирусных MP, включая 3a MP вируса мозаики огурца (CMV), белок, кодируемый ORF4, некооперативно связывается с вирусной ssRNA и образует комплексы с низким соотношением белок: РНК. Эксперименты по конкурентному связыванию показали, что белок, кодируемый ORF4, связывается как с оцРНК, так и с оцДНК без специфичности последовательности, но не связывается с дцДНК.УФ-сшивание и анализы удержания нитроцеллюлозной мембраны подтвердили, что как GRV, так и …

PaperRank:

Читатели Связанные статьи MentionsView Impact

Журнал общей вирусологии, 2001

The 63 kDa & # 39; 63K & # 39; белок движения, кодируемый тройным блоком генов полулатентного вируса poa … подробнее The 63 kDa & # 39; 63K & # 39; Белок движения, кодируемый тройным блоком генов полулатентного вируса осо (PSLV), включает C-концевой домен NTPase / геликазы и N-концевой домен удлинения, который содержит два положительно заряженных мотива последовательности, A и B.В этом исследовании были проанализированы in vitro РНК-связывающие свойства PSLV 63K и его мутантов. Иммобилизованные на мембране 63K и N-63K (изолированный N-концевой домен удлинения) связывают РНК при высоких концентрациях NaCl. Напротив, C-63K (изолированный домен NTPase / геликазы) был способен связывать РНК только при концентрациях NaCl до 50 мМ. В анализах смещения геля C-63K связывает РНК с образованием комплексов, которые не могут проникать в агарозный гель, тогда как комплексы, образованные N-63K, могут проникать в гель. Полноразмерная 63К образовывала комплексы обоих типов.Визуализация комплексов РНК-белок, образованных 63K, N-63K и C-63K, с помощью атомно-силовой микроскопии показала, что каждый комплекс имел различную форму. В совокупности эти данные показывают, что 63K имеет два различных RN …

PaperRank:

Читатели Связанные статьи УпоминанияView Impact

Журнал общей вирусологии, 2000

Предполагаемый белок инициации репликации (Rep) вируса гниения листвы кокосового ореха (CFDV) был expres … подробнее Предполагаемый белок инициации репликации (Rep) вируса гниения кокосовых листьев (CFDV) был экспрессирован в виде 6-кратного рекомбинантного белка His в E.coli и рекомбинантный бакуловирус. Было продемонстрировано, что очищенный белок 6x His-Rep обладает неспецифической последовательностью РНК- и оцДНК-связывающей активностью, а также магний-зависимой активностью АТФазы / ГТФазы. Дрожжевая двугибридная система показала, что CFDV Rep может взаимодействовать с самим собой. Субклеточное распределение CFDV Rep изучали путем фракционирования клеток насекомых, инфицированных рекомбинантным бакуловирусом, экспрессирующим белок 6x His-Rep, и с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии эпидермальных клеток Nicotiana benthamiana, подвергнутых бомбардировке конструкцией, кодирующей CFDV Rep, слитый с GFP.Было показано, что CFDV Rep связывается преимущественно с ядрами и мембранами инфицированных / трансфицированных клеток. Эти активности Rep, кодируемых CFDV, очень похожи на активности, описанные для Reps геминивирусов.

PaperRank:

Читатели Похожие статьи УпоминанияView Impact

Intervirology, 1974

Относительная эффективность трансляции мРНК клетки-хозяина и РНК вируса энцефаломиокардита (emc) . .. подробнее Относительная эффективность трансляции мРНК клетки-хозяина и энцефаломиокардита (emc) РНК вируса была исследована в бесклеточных препаратах из неинфицированных и инфицированных вирусом EMC клеток Drebs-II.Способность внеклеточных экстрактов из инфицированных клеток транслировать экзогенно добавленную РНК вируса EMC и общую мРНК клеток Кребса-II была заметно снижена, но не было получено никаких доказательств избирательного ингибирования трансляции мРНК клетки-хозяина в этих системах.

PaperRank:

Читатели Статьи по теме УпоминанияView Impact

Достижения в вирусных исследованиях, 2010

Ядрышко — это динамическое субъядерное тело, играющее роль в биогенезе субъединицы рибосомы, посредничество … подробнее субъединичный биогенез, опосредование реакции клеток на стресс и регуляция роста клеток.Все большее количество сообщений показывает, что, подобно белкам вирусов животных, многие белки вирусов растений локализуются в ядрышке, чтобы отвлечь ядрышковые белки хозяина от их естественных функций, чтобы проявить новую роль (и) в цикле вирусной инфекции. В этой главе будут освещены исследования, показывающие, как вирусы растений задействуют ядрышковые функции для облегчения трансляции и репликации вируса, перемещения вируса и сборки вирусспецифических рибонуклеопротеиновых (RNP) частиц, а также для противодействия защитным реакциям растения-хозяина.Вирусы растений также являются ценным инструментом для получения нового представления о новых ядрышковых функциях и процессах. Изучение взаимодействий между вирусами растений и ядрышком облегчит разработку новых стратегий борьбы с вирусными инфекциями растений.

PaperRank:

Читатели Связанные статьи УпоминанияView Impact

РНК, 2012

Ранее мы обнаружили, что подавление молчания белком 2b и шестью мутантами коррелировало как … подробнее Ранее мы обнаружили, что подавление молчания белком 2b и шестью мутантами коррелировали как с их способностью связываться с двухцепочечными (ds) малыми РНК (мРНК) in vitro, так и с их ядерной / ядрышковой локализацией. Чтобы еще больше различить вклад в активность супрессии связывания мРНК и ядерной локализации, мы охарактеризовали кинетику связывания in vitro с дц-мРНК, одноцепочечной (оц) мРНК и микроРНК (миРНК) нативного 2b белок и восемь мутантных вариантов. Мы также добавили сигнал ядерного экспорта (NES) к белку 2b и оценили, как он влияет на субклеточное распределение и супрессорную активность. Мы обнаружили, что в растворе нативный белок связывает ds siRNA, miRNA и ss sRNA с высоким сродством при молярном соотношении белок: РНК ~ 2: 1.Из четырех мутантов, которые сохранили супрессорную активность, три показали профили связывания мРНК, аналогичные профилям нативного белка, тогда как оставшийся один связывал оц-мРНК в молярном соотношении 2: 1, но обе дц-мРНК с аффинностью в 1,5-2 раза немного ниже. Три из четырех мутантов, лишенных супрессорной активности, не смогли связываться с какой-либо мРНК, тогда как оставшийся один связал их в гораздо более высоких соотношениях. NES-меченный белок 2b стал цитоплазматическим, но супрессивная активность в тестах с пластырем осталась неизменной. Эти результаты подтверждают связывание с мРНК в молярных соотношениях, равных или близких к 2: 1, что является критическим для супрессорной активности белка 2b.Они также показывают, что локализованный в цитоплазме белок 2b сохраняет супрессорную активность и что устойчивая ядерная локализация не требуется для этой функции.

PaperRank:

Читатели Упоминания по темеПросмотреть влияние

PLoS ONE, 2013

PaperRank:

Читатели Упоминания по темеПросмотреть влияние

Molekuliarnaia biologiia

РЕЗЮМЕ Было проведено исследование взаимодействия in vitro вирионов (CP) белков оболочки th … подробнее РЕФЕРАТ Было проведено исследование in vitro взаимодействия вирионов и белка оболочки (CP) вируса X картофеля (PVX) с микротрубочками (MT).И вирионы, и ЦП совмещены с МТ, стабилизированным таксолом. В присутствии PVX CP тубулин полимеризуется с образованием структур, устойчивых к холоду. Электронная микроскопия выявила аберрантный характер образующихся полимеров тубулина (протофиламентов и их листов), которые отличались от МТ, собранных в присутствии клеточного MAP2. Напротив, вирионы PVX индуцировали сборку морфологически нормальных МТ, чувствительных к холоду. Было показано, что вирионы конкурируют с MAP2 за связывание MT, что предполагает перекрытие сайтов MT, взаимодействующих с MAP2 и с вирионами PVX.Предполагалось, что вирионы ХВК взаимодействуют с МТ in vivo и, следовательно, элементы цитоскелета участвуют во внутриклеточной компартментализации генома ХВК.

PaperRank:

Читатели Статьи по теме УпоминанияView Impact

Journal of General Virology, 2015

Белок движения Hordeivirus, кодируемый первым геном тройного генного блока (белок TGB1, TG … подробнее Белок движения Hordeivirus, кодируемый первым геном тройной блок генов (белок TGB1, TGBp1) взаимодействует in vivo с вирусными геномными и субгеномными РНК с образованием частиц рибонуклеопротеина (РНП), которые считаются формой вирусного генома (не-вирионной транспортной формой), способной к передаче от клетки к клетке. и перенос на большие расстояния инфицированных растений.Структура этих RNP не выяснена. Полулатентный вирус Poa (PSLV) TGBp1 содержит структурированный C-концевой домен NTPase / геликазы и N-концевую область удлинения, состоящую из двух доменов — полностью внутренне неупорядоченный крайний N-концевой домен и внутренний домен (ID) со структурой, напоминающей частично неупорядоченная расплавленная глобула. Здесь мы охарактеризовали структуры, собранные in vitro с помощью полноразмерного PSLV TGBp1 отдельно или в присутствии вирусной РНК. PSLV TGBp1 был способен к мультимеризации и самосборке в протяженные высокомолекулярные комплексы.Эти комплексы распадаются на мономеры при инкубации с АТФ. При инкубации с вирусной РНК, PSLV TGBp1 in vitro образовывал структуры РНП, которые выглядели как нитчатые частицы, напоминающие вирионы спиральных нитчатых вирусов растений по морфологии и размерам. Сравнивая биофизические характеристики PSLV TGBp1 и его доменов в присутствии и в отсутствие РНК, мы показываем, что ID играет основную структурную роль в самовзаимодействиях и РНК-взаимодействиях TGBp1, ведущих к сборке вирусоподобных частиц РНП.

PaperRank:

Читатели Связанные статьи УпоминанияView Impact

Методы молекулярной биологии (Клифтон, Нью-Джерси), 2008 г.

Вирусы растений распространяются от первоначально инфицированных клеток к остальной части растения различными способами … подробнее Вирусы растений распространяются из первоначально инфицированные клетки остальной части растения в несколько различных стадий. Сначала вирус (в форме вирионов или белковых комплексов нуклеиновых кислот) перемещается внутриклеточно от мест репликации к плазмодесматам (PD, межклеточные мембранные каналы, специфичные для растений), затем вирус пересекает PD для межклеточного распространения (от клетки к клетке). движение клеток).Перемещение вируса на большие расстояния происходит через ситовые трубки флоэмы. Процессы перемещения вирусов растений контролируются специфическими белками вирусного перемещения (MPs). У МП, принадлежащих к разным таксономическим группам вирусов растений, не обнаружено обширного сходства последовательностей. Более того, было показано, что разные MP используют разные пути и механизмы для транспорта вируса. Некоторым вирусным транспортным системам требуется один MP, в то время как другим необходимы дополнительные белки, кодируемые вирусом, для транспортировки вирусных геномов. В этом обзоре мы сосредоточимся на функциях и свойствах различных классов MPs, кодируемых RNA con…

PaperRank:

Читатели Статьи по теме УпоминанияView Impact

Журнал общей вирусологии, 2001

Различные функции белка перемещения от клетки к клетке (MP) вируса розетки арахиса (GRV) были … подробнее Различные функции белка перемещения от клетки к клетке (MP) вируса розетки арахиса (GRV). Иммунофлуоресцентная микроскопия показала, что белок, кодируемый ORF4 GRV, генерирует трубчатые структуры, которые выступают из поверхности протопласта. Белок, кодируемый ORF4, оценивали также на РНК-связывающие свойства. Этот белок был помечен на его С-конце шестью остатками гистидина, продуцирован в Escherichia coli с использованием вектора экспрессии и очищен с помощью аффинной хроматографии. Анализ задержки геля показал, что, в отличие от многих других вирусных MP, включая 3a MP вируса мозаики огурца (CMV), белок, кодируемый ORF4, некооперативно связывается с вирусной ssRNA и образует комплексы с низким соотношением белок: РНК. Эксперименты по конкурентному связыванию показали, что белок, кодируемый ORF4, связывается как с оцРНК, так и с оцДНК без специфичности последовательности, но не связывается с дцДНК.УФ-сшивание и анализы удержания нитроцеллюлозной мембраны подтвердили, что как GRV, так и …

PaperRank:

Читатели Связанные статьи MentionsView Impact

Журнал общей вирусологии, 2001

The 63 kDa & # 39; 63K & # 39; белок движения, кодируемый тройным блоком генов полулатентного вируса poa … подробнее The 63 kDa & # 39; 63K & # 39; Белок движения, кодируемый тройным блоком генов полулатентного вируса осо (PSLV), включает C-концевой домен NTPase / геликазы и N-концевой домен удлинения, который содержит два положительно заряженных мотива последовательности, A и B.В этом исследовании были проанализированы in vitro РНК-связывающие свойства PSLV 63K и его мутантов. Иммобилизованные на мембране 63K и N-63K (изолированный N-концевой домен удлинения) связывают РНК при высоких концентрациях NaCl. Напротив, C-63K (изолированный домен NTPase / геликазы) был способен связывать РНК только при концентрациях NaCl до 50 мМ. В анализах смещения геля C-63K связывает РНК с образованием комплексов, которые не могут проникать в агарозный гель, тогда как комплексы, образованные N-63K, могут проникать в гель. Полноразмерная 63К образовывала комплексы обоих типов.Визуализация комплексов РНК-белок, образованных 63K, N-63K и C-63K, с помощью атомно-силовой микроскопии показала, что каждый комплекс имел различную форму. В совокупности эти данные показывают, что 63K имеет два различных RN …

PaperRank:

Читатели Связанные статьи УпоминанияView Impact

Журнал общей вирусологии, 2000

Предполагаемый белок инициации репликации (Rep) вируса гниения листвы кокосового ореха (CFDV) был expres … подробнее Предполагаемый белок инициации репликации (Rep) вируса гниения кокосовых листьев (CFDV) был экспрессирован в виде 6-кратного рекомбинантного белка His в E.coli и рекомбинантный бакуловирус. Было продемонстрировано, что очищенный белок 6x His-Rep обладает неспецифической последовательностью РНК- и оцДНК-связывающей активностью, а также магний-зависимой активностью АТФазы / ГТФазы. Дрожжевая двугибридная система показала, что CFDV Rep может взаимодействовать с самим собой. Субклеточное распределение CFDV Rep изучали путем фракционирования клеток насекомых, инфицированных рекомбинантным бакуловирусом, экспрессирующим белок 6x His-Rep, и с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии эпидермальных клеток Nicotiana benthamiana, подвергнутых бомбардировке конструкцией, кодирующей CFDV Rep, слитый с GFP.Было показано, что CFDV Rep связывается преимущественно с ядрами и мембранами инфицированных / трансфицированных клеток. Эти активности Rep, кодируемых CFDV, очень похожи на активности, описанные для Reps геминивирусов.

PaperRank:

Читатели Похожие статьи УпоминанияView Impact

Intervirology, 1974

Относительная эффективность трансляции мРНК клетки-хозяина и РНК вируса энцефаломиокардита (emc) … подробнее Относительная эффективность трансляции мРНК клетки-хозяина и энцефаломиокардита (emc) РНК вируса была исследована в бесклеточных препаратах из неинфицированных и инфицированных вирусом EMC клеток Drebs-II.Способность внеклеточных экстрактов из инфицированных клеток транслировать экзогенно добавленную РНК вируса EMC и общую мРНК клеток Кребса-II была заметно снижена, но не было получено никаких доказательств избирательного ингибирования трансляции мРНК клетки-хозяина в этих системах.

PaperRank:

Читатели Статьи по теме УпоминанияView Impact

Достижения в вирусных исследованиях, 2010

Ядрышко — это динамическое субъядерное тело, играющее роль в биогенезе субъединицы рибосомы, посредничество … подробнее субъединичный биогенез, опосредование реакции клеток на стресс и регуляция роста клеток.Все большее количество сообщений показывает, что, подобно белкам вирусов животных, многие белки вирусов растений локализуются в ядрышке, чтобы отвлечь ядрышковые белки хозяина от их естественных функций, чтобы проявить новую роль (и) в цикле вирусной инфекции. В этой главе будут освещены исследования, показывающие, как вирусы растений задействуют ядрышковые функции для облегчения трансляции и репликации вируса, перемещения вируса и сборки вирусспецифических рибонуклеопротеиновых (RNP) частиц, а также для противодействия защитным реакциям растения-хозяина.Вирусы растений также являются ценным инструментом для получения нового представления о новых ядрышковых функциях и процессах. Изучение взаимодействий между вирусами растений и ядрышком облегчит разработку новых стратегий борьбы с вирусными инфекциями растений.

PaperRank:

Читатели Упоминания по темеПросмотреть влияние Войти через Facebook
Войти через Google

Зарегистрироваться через Apple

аталия — организационный психолог и стратег, специализирующийся на объединении инноваций, предпринимательства и влияния на общество.Она фокусируется на создании взаимосвязанных сообществ и динамичных экосистем, в последнее время возглавив расширение Кембриджского инновационного центра (CIC) в Майами, стремясь углубить и придать нюанс разговора о предпринимательстве и навести ощутимые мосты к инновационным центрам и Латинской Америке. В рамках этих усилий она курирует основной трехлетний бизнес стоимостью 4 миллиона долларов, параллельно с генеральным планированием инновационного района, который требует установления совместной повестки дня между государственным, академическим и частным секторами в Майами.

До этого она работала директором по инновациям и технологиям в некоммерческой организации, работающей на Кубе, а также была одним из шести стратегов по продуктам в компании по разработке программного обеспечения для персонала с оборотом 5 млрд долларов.

Наталья — основательница Awesome Foundation MIAMI, которая выделила 100 тысяч долларов в виде грантов на небольшие массовые идеи по всему Майами. Она также является основателем Aminta Ventures, образовательного центра, ориентированного на обучение и расширение возможностей профессиональных и филантропических женщин, чтобы они могли стать бизнес-ангелами.Для этой и другой работы Наталья была назначена в Комиссию губернатора по общественным работам — орган, который курирует выделение 32 миллионов долларов федерального, государственного и местного финансирования для реализации высокоэффективных образовательных и волонтерских программ в штате Флорида.

Совсем недавно Наталья возглавила запуск беспартийной массовой кампании под названием Immigrant Powered. Миссия проекта состоит из трех частей: подчеркнуть положительное влияние иммигрантов на экономику в наших сообществах, расширить возможности предприятий, работающих на иммигрантах, и предоставить малому и среднему бизнесу возможности для пропаганды ответственной иммиграционной политики.

Она также активно работает с государственным и частным сектором в Латинской Америке, часто взаимодействуя с правительствами, министерствами, инвесторами и участниками экономического развития. Она также взаимодействует с многосторонними участниками, такими как Всемирный экономический форум и Межамериканский банк развития, в областях, связанных с предпринимательством, взаимодействием между заинтересованными сторонами и инклюзивными инновациями, и была приглашена для участия в их мероприятиях и выступлений на них.

Наталья писала в таких изданиях, как The Huffington Post, Всемирный экономический форум, Mic и La Nacion.Она имеет степень бакалавра искусств. Имеет степень магистра психологии и государственного управления Гарвардского университета и степень магистра организационной психологии Колумбийского университета. Она дважды была иммигрантом, кубинцами и русскими по происхождению.

Нина Калинина — Убей мою любовь (2021)

Некоторым людям может быть очень трудно смириться с разрывом отношений. Именно это Нина Калинина с помощью Лена взяла за основу своего сингла «Kill My Love». Через мечтательные и мягкие тона трека они рассказывают историю человека, который оплакивает отказ от разрыва, пытается изменить мнение другого человека, а затем понимает, что его поведение было проблемой все время.

Эта сказка о безнадежной реализации сочетает в себе электронные попсовые звуки Калининой с вдохновенным вокалом Лена. Эти двое были представлены друг другу другом их друга и прошли через пандемию на трассе, но на самом деле никогда не встречались. Сказка с двух точек зрения, сингл — прекрасный вариант баллад о расставании.

---

---

«Kill My Love» открывается вокалом Лена, который привлекает вас прекрасным тоном альтернативной поп-музыки. В его голосе есть мягкость, в которую вы погружаетесь, когда он ведет вас к разрыву лирики.Его вокал становится немного мрачнее, когда он переносит вас на другую сторону отношений и пытается заставить изменить свое мнение. В треке есть несколько действительно потрясающих вокальных движений, поскольку вы проходите через три фазы. Его выступление проведет вас через горечь окончания отношений, тьму изменения чьего-то решения и, наконец, завершится легкой нотой с просьбой о прощении.

Под его вокалом звучит трогательная мелодия, предлагающая мягкие вибрации и глубину эмоций.По мере того, как отношения подходят к концу, в перетасовке дебюта покоится печаль. Более высокие тона — это мерцающие огни, которые приятно взаимодействуют с более глубокими тонами нижних уровней. По мере того, как тьма проникает в вокал, между битами пробивается что-то зловещее.