Лада 13 фото: 2113 ( 2113) — , , , : 566


0
Categories : Разное

Содержание

Лада-2113 выходит в серийное производство — РБК

ОАО «АВТОВАЗ» в 2004г. начнет производство модели LADA-2113. Об этом сообщил РБК источник на предприятии. Предполагаемый объем производства данной модели — 10-15 тыс. автомобилей в год.

Однако, по словам источника, объем производства может быть увеличен в связи с потребностями рынка. LADA-2113 является представителем семейства «Самара-2» и призвана заменить на конвейере модель ВАЗ-21083, производство которой было прекращено в сентябре 2003г.

Семейство «Самара-2» включает в себя трехдверный хэтчбек LADA-2113, пятидверный хэтчбек LADA-2114 и седан LADA-2115. ОАО «АВТОВАЗ» в 2004г. планирует произвести 684 тыс. 800 автомобилей различных модификаций против 699 тыс. 889 автомобилей в 2003г.

Недавно стало известно о том, что ОАО «АвтоВАЗ» планирует увеличить отпускные цены на автомобили в среднем на 0,65%. Это уже третье с начала 2004 года повышение отпускной цены. Ранее компания увеличивала отпускные цены с 1 января, 2 февраля и 6 марта с.г.

В прошлом году предприятие пять раз корректировало отпускные цены — 31 марта, 1 мая, 10 июня, 15 июля и 28 октября. Розничные цены на продукцию завода за 2003г. выросли в среднем более чем на 10%.

ОАО «АвтоВАЗ» в I квартале 2004г. увеличило по сравнению с I кварталом 2003г. производство на 27,1% — до 173 тыс. 866 автомобилей. В марте с.г. было произведено 63 тыс. 760 автомобилей, что на 5,4% больше, чем в марте 2003г. В 2004г. ОАО «АвтоВАЗ» планирует произвести 684 тыс. 800 автомобилей, тогда как в 2003 г. было выпущено 699 тыс. 889 машин.

Автомобиль ВАЗ 2113: Фото #13 из 18, размер изображения

Chrysler Prowler

Совершенно уникальный автомобиль в стиле ретромодернизма и хотрода стал плодом стараний и усердной работы целого коллектива из тысячи энтузиастов. Для создания этой модели были привлечены свободные дизайнеры, которые предоставили свои идеи и мысли по поводу концепции автомобиля концерну-производителю.

De Tomaso Pantera

Автомобиль De Tomaso Pantera выступает в качестве флагмана итальянского производителя De Tomaso. Выпуск данного эксклюзивного спорткара производился на протяжении двадцати лет с 1971 года по 1991 год.

Ford Explorer IV

Ford Explorer представляет собой SUV четвертого поколения. Впервые машина была показана в США в 2006 году.

Infiniti EX

Автомобиль Infiniti EX с пятидверным кузовом «Coupe Crossover» создан на базе модернизированной платформы FM-типа. Для рынка Северной Америки было разработано 2 модификации: с задним и передним приводом.

Renault 15

Переднеприводный спортивный автомобиль, выполненный в кузове «купе» Renault 15, выпускался французской компанией с начала 1970 года по 1980 год. Рено 12 со своей платформой послужил основой разрабатываемого нового Рено15.

a001pk 102 Лада 2113 — гос номер авто

Индивидуальный регистрационный знак (номер) автомобиля.

В России основная часть регистрационных знаков образца 1993 года, в соответствии с ГОСТ Р 50577-93. Отличия по формату и/или размеру от стандартных имеют: номерные знаки маршрутных ТС, военных ТС, ТС дипломатических миссий, ТС МВД, прицепов, строительной техники и мотоциклов.

Стандартные номера состоят из 3 букв и 3 цифр. Буквы означают серию номерного знака, а цифры — номер. Примером может послужить описание автомобильного номера на данной странице, А 001 РК 102 По ГОСТу для использования разрешены 12 букв кириллицы, которыые имеют графические аналоги в латинском алфавите (А, В, Е, К, М, Н, О, Р, С, Т, У, Х). В правой части номерного знака, отделенной вертикальной черной линией, расположены: флаг Российской Федерации и надпись «RUS», в верхней кодовое обозначение субъекта РФ, где был зарегистрирован автомобиль.

Все используемые автомобильные номера зарегистрированы. Для каждого административного района определен свой номер, общий для всех ТС, зарегистрированных в этом округе. Общее количество комплектов регистрационных знаков, которое может быть изготовлено для каждого субъекта России, определяется ГОСТом и составляет 1726272 шт.

Изначально в качестве кодов регионов применялись только числа от 01 до 89, по количеству регионов РФ на 1 января 1993 года. Однако количество регистрируемых автомобилей с каждым годом увеличивается, и номерных знаков с допустимыми комбинациями стало недостаточно. По этой причине в ряде субъектов России вводятся дополнительные кодовые обозначения, которые можно использовать на знаках; сначала началась выдача кодов регионов из девятого десятка (9х) (кроме кода 92), а затем перешли к трёхзначным кодам регионов. Три и более кодов региона используют Москва (коды 77, 99, 97, 177, 199, 197, 777), Московская область (50, 90, 150, 190), Красноярский край (24, 84, 88, 124), Санкт-Петербург (78, 98, 178), Краснодарский край (23, 93, 123), Пермский край (59, 81, 159) и Свердловская область (66, 96, 196), при этом Краснодарский и Пермский края получили еще один код «в наследство» от вошедших в их состав других субъектов федерации, 19 субъектов используют два кода региона. На данной странице указан номер из субъекта РФ: Республика Башкортостан.

После введения ныне действующего ГОСТа номера предыдущих образцов не изымались, по этой причине до сих пор на дорогах России можно встретить автомобили с советскими номерными знаками: образца 1980 года — из четырех цифр и трёх букв на белом фоне, и даже образца 1958 года — из двух двузначных чисел, разделенных дефисом, и идущих за ними трёх букв на чёрном фоне. Желтые номера образца 1947 года очень редко встречаются, часто бутафорские на ретро-автомобилях. На нашем сайте основной частью регистрационных знаков являются номера частных транспортных средств (А 001 РК 102). Для размещения информации о номере автомобиля обязательно требуется фото ТС, его Марка и Модель (Лада 2113).

Отзыв владельца Лада 2113 (Lada 2113) 2012 г.

Лада 2113, 2012 г.в.


Люкс

Год выпуска: 2012

Кузов: Хэтчбек (3 дв.)

Двигатель: 1.6 л, Бензин, МКПП, 82 л.с.

Приобретен: Ноябрь 2012 г.

Пробег: 14,000 км

Привод: Передний

Практичность

Надежность

Динамичность

Комфорт

Управляемость

Расходы на авто низкие

У меня лично это уже второй подобный автомобиль. Первая такая моя ласточка ВАЗ-2113 была в серебристом цвете (2006 г. выпуска). С тех пор автомобиль этой модели по моим ощущениям стал легче в управлении, несмотря на то, что нет гидроусилителя руля, повороты даются очень легко, небольшой угол разворота. В салоне комфортно, в этом автомобиле я уже поставила музыку. На бортовом компьютере всегда можно отслеживать точную скорость движения, таким образом, не нарушая скоростного режима и не попадая в автонарушители, расход бензина (очень экономична). Кузов этого автомобиля по сравнению с тем же ВАЗ-2114 очень крепкий.

В основном все передвигаются по городу поодиночке, ну, максимум вдвоём, поэтому задние двери не особо то и нужны, а вещи и документы, положенные на заднее кресло, никогда не упадут наружу при резком открывании дверей. Стёкла задние все затонированы, поэтому что лежит у меня сзади никто не видит. Багажник очень просторный, задние сидения складываются — можно перевозить крупногабаритные грузы. Правда, мне не приходилось ещё этого делать (только колёса летние или зимние до ближайшего шиномонтажа).

Подвеска надёжная, но в то же время не такая жёсткая как на немецких автомобилях. Обзор за рулём шикарный. Колёсные арки позволяют поменять колёса на диски с большим диаметром, что сейчас очень модно. По крайней мере, вполне можно поставить диски 14 диаметра, соответственно и другую резину. Но особо этим увлекаться не стоит. На резине Нокиан 7 ездить зимой — одно удовольствие. Не смотря на то, что у автомобиля лишь передний привод, зимой, при грамотном обращении с автомобилем на дорогах, парковаться можно везде. Соотношение веса и мощности позволяет это сделать на любом заснеженном участке. Парктроники вообще облегчают движение на любой парковке. Хоть автомобиль и не такой большой по габаритам, но время диктует своё — парктроник в городе совсем не лишнее удовольствие.

Плюсы

Всё описала выше. По крайней мере, этот автомобиль также как и первый, купленный в далёком 2006 году, меня лично не разочаровал, а только порадовал. Полное соответствие цена-качество.

Минусы

Если бы в этой модели ещё был и гидроусилитель, то это был бы вообще спортивный автомобиль.

Стоит ли покупать такой автомобиль? Каким будет Ваше следующее авто?

Всё подробно описала выше. Выбрала, потому что у меня уже был такой автомобиль. Люблю 3-х дверные автомобили, т. к. у них крепче кузов. На задние сидения можно сложить документы, личные вещи. Автомобиль просторный, уютный, несмотря на то, что ваз. багажник просторный, помещаются габаритные грузы.


бампер, капот, пороги, крыло в Нижнем Новгороде

Покраска автомобиля Лада 2113/LADA 2113: бампер, капот, пороги, крыло в Нижнем Новгороде

Главная » Цены на ремонт авто » Lada » Покраска автомобиля LADA 2113

Покраска автомобиля осуществляется в специальной камере с использованием самый лучших лакокрасочных материалов. Наша компания дает гарантию 1 год на все кузовные работы и покраску Вашего авто. Обратитесь к профессионалам! Это станет первым шагом к тому, чтобы Ваш LADA 2113 снова блестел и дарил наслаждение от скоростной и безопасной езды.

Цены на покраску деталей кузова автомобиля Лада 2113:

Крыло переднее, заднее — покраска с расходными материалами и подбором цвета от 5 000 руб
Бампер LADA 2113 — покрасить передний или задний с расходными материалами и подбором цвета от 5 000 руб
Дверь передняя, задняя, правая или левая— с или покрасить с расходными материалами и подбором цвета от 5 000 руб
Капот автомобиля Лада 2113 — окрас или покрасить от 6 000 руб
Крыша — покрасить с расходными материалами и подбором цвета от 6 500 руб
Покраска порогов — расходные материалы + компьютерный подбор эмали от 4 500 руб
Покраска багажника — расходные материалы + компьютерный подбор эмали от 5 000 руб

За более подробной информацией обращайтесь по телефонам в Нижнем Новгороде
8 (831) 291-26-20, 8 (920) 297-19-03

Оставьте заявку на ремонт прямо сейчас

Другие услуги:

Наиболее популярные марки автомобилей:

© 2014-2016 Компания «Кузовной на Деловой» — автосервис в Нижнем Новгороде. Кузовной ремонт, покраска авто.

Телефоны в Нижнем Новгороде:
Телефоны: 8 (831) 291-26-20
8 (920) 297-19-03

В ХК «Лада» сообщили о приостановке финансирования со стороны АвтоВАЗа :: Хоккей :: РБК Спорт

По словам гендиректора «Лады», речи о прекращении спонсорского договора не идет, хоккейный клуб «попросили подождать»

Читайте нас в

Новости Новости

Фото: Официальный сайт Высшей хоккейной лиги

Генеральный директор тольяттинской «Лады» Александр Чеботарев заявил на пресс-конференции, что АвтоВАЗ в конце марта уведомил хоккейный клуб о приостановке финансирования.

«В конце марта поступило официальное письмо от АвтоВАЗа о приостановлении траншей, которые планировались на окончание сезона. Речь не идет о прекращении договора, который заключен сроком до 31 декабря текущего года. Отсрочка на определенный период времени, в том числе и из-за переноса корпоративного отпуска на предприятии, так как нужно единовременно начислить работникам выплаты. Поэтому нас попросили подождать», — сказал Чеботарев.

Он отметил, что «отношения не прекращены». «Если они возобновятся в августе-сентябре, то это не критично для клуба. В случае, если сроки увеличатся, будем реализовывать план Б, сокращать бюджет. Это будет чревато потерями, но другого выхода нет», — сказал гендиректор.

«Лада» в текущем сезоне завершила регулярный чемпионат Высшей хоккейной лиги на седьмом месте, а в плей-офф дошла до четвертьфинала, где уступила тюменскому «Рубину» со счетом 0-4 в серии.

«Северсталь» рассмотрит вариант ухода из КХЛ

По словам Чеботарева, поиски финансирования ведутся и на уровне министерства спорта Самарской области, и самой «Ладой».

«Что касается нашего уровня, клубного, мы провели ряд переговоров, и несколько предприятий стали спонсорами. Они внесли средства в бюджет клуба, но позиция компаний, прекращавших ранее сотрудничество с «Ладой», больше выжидательная. Спонсоры заходят, но очень осторожно. Но нужно понимать, что в любом случае доля их участия несоизмерима с объемами финансирования от Самарской области и АвтоВАЗа», — сказал Чеботарев.

25 марта АвтоВАЗ сообщил, что вводит четырехдневную рабочую неделю на производственных площадках в Тольятти и Ижевске с 6 июня 2022 года на три месяца. Такое решение принято из-за дефицита поставок электронных компонентов вследствие санкций. Ранее по этой же причине производитель перенес летний корпоративный отпуск на 4–24 апреля, пообещав приложить «максимум усилий для восстановления цепочек поставок комплектующих».

Автор

Анна Сатдинова

Костромские полицейские ищут очевидцев трех ДТП

Сотрудники ГИБДД ищут очевидцев трех разных ДТП.

26 марта 2022 года с 19.30 по 19.45 часов в районе дома 3 по микрорайону Юбилейный, неустановленный водитель на автомобиле (предположительно марки «ГАЗель» врезался в киоск «Ключ Здоровья», причинив собственнику материальный ущерб, после чего покинул место ДТП.

Кроме того, 29 марта с 11.00 по 13 .00 часов в районе дома №5 в деревне Посошниково, неустановленный водитель на автомобиле (предположительно марки «ГАЗель»), врезался в металлический забор, причинив собственнику материальный ущерб, после чего покинул место ДТП.

2 апреля в 21.58 в районе дома №1/48 по улице Маршала Новикова, неустановленный водитель на автомобиле предположительно марки Лада 2113 или 2114 серебристого цвета, при движении врезался в автомобиль Лада Гранта. В результате происшествия был причинен
материальный ущерб, а водитель с места ДТП скрылся.

Костромичей, которые имеют какую – либо информацию по данному происшествию, просят обратиться в ГИБДД по адресу: город Кострома, улица Симановского , 17, кабинет № 407, по телефону: 51-73-54 или в Дежурную часть ГИБДД по телефону: 31-67-41.

Последние новости рубрики

17:35, 08 апреля 2022

Как сообщает Костромастат, по данным выборочного наблюдения 2021 года в Костромской области около 6% опрошенных мужчин и 5% женщин максимально…

17:05, 08 апреля 2022

C 8 апреля в Костромской области начался пожароопасный сезон. МЧС напоминает жителям, что в пожароопасный сезон запрещается:— разводить костры в…

16:30, 08 апреля 2022

Юные костромичи активно участвуют в благотворительных и экологических инициативах. Воспитанники детского сада №79 и их родители собрали более 200 килограммов…

Гриф с нотами на гитаре

Гриф (также называемый гриф ) — это верхняя часть грифа гитары, расположенная между корпусом и головкой грифа. На схеме ниже вы можете узнать все ноты на грифе гитары — после 12-го лада все повторяется (13-й лад такой же, как и 1-й, только на октаву выше).

Для вашего развития как гитариста важно знать положение каждой ноты.Это помогает понять теорию аккордов и облегчает исполнение мелодий, соло и арпеджио.

Схема накладки грифа начинается с открытых струн и продолжается нотами на ладах с 1 по 12.


Изображен гриф на гитаре. С 12 лада все повторяется снова.

Комментарии

На диаграмме грифа используются диезы (#), а не бемоли (b). Если вы, например, ищете ноту Ab (ля-бемоль), это то же самое, что и G# (соль-диез).Обратите также внимание на то, как расстояние между ладами уменьшается по направлению к корпусу.

Изучение грифа – расположение нот

Запоминание грифа займет некоторое время. Простой способ начать — распознавать повторяющиеся шаблоны и сначала выучить несколько нот, чтобы использовать справочные материалы. Например, если вы знаете, что самая нижняя струна на пятом ладу — ля, вы можете найти другую ноту ля на две струны выше и на лады правее. Тот же метод можно использовать для пятой и третьей струн. Например, если вы знаете, что вторая самая нижняя струна на пятом ладу — это ре, вы можете найти другую ноту ре на две струны выше и на лады вправо.Продолжайте смотреть на расположение заметок, и вы найдете больше шаблонов.

Упражнение «Расположение нот на грифе» (pdf)

На первых 12 ладах вы можете найти все ноты на шести позициях, по одной на каждой струне. Гитара отличается от фортепиано тем, что ноты одной высоты можно играть в нескольких разных позициях.

Обратите внимание на сравнение с нотами на открытой струне и пятом ладу. На пятой струне каждая нота на одну позицию ниже (за исключением перехода со второй на третью).Это соотношение зависит от того, что гитара настроена в пятых интервалах: от ми до ля, от ля до ре и так далее.

Совет для изучения грифа по упражнениям — играйте по нотам (нотам). Это заставляет вас думать о названиях нот и о позициях на грифе. (Онлайн-ресурс с бесплатными нотами для гитары — Traditionalsongs.org.)

Если вы действительно хотите научиться игре на грифе, см. электронную книгу «Гриф гитары» с графикой, примерами игры и многим другим.

История точек

Между некоторыми ладами имеются вставки, чаще всего отображаемые точками. Их функция состоит в том, чтобы помочь вам ориентироваться в горизонтальном направлении и облегчить быстрый поиск нужного лада. Инкрустации на грифе расположены схематично на гитаре, и типичное расположение включает одиночные точки на 3-м, 5-м, 7-м, 9-м, 15-м, 17-м, 19-м и 21-м ладах и двойные точки на 12-м и 24-м ладах.

Причина использования двойных ладов на 12-м и 24-м ладах в том, что ноты на этих ладах начинаются заново.Ноты на 12-м ладу на одну октаву выше, чем на открытых струнах, а ноты на 24-м ладу на одну октаву выше, чем на 12-м ладу.

Смолы

Количество нот на гитаре варьируется в зависимости от количества ладов — у всех гитар не одинаковое количество ладов. Также правильнее говорить о высоте тона, ведь есть всего двенадцать уникальных нот, которые повторяются на многих октавах.

Электрогитары, например, имеют от 21 до 24 ладов и, следовательно, имеют от
126 до 144 высоты тона.(Расчет прост, достаточно умножить количество ладов на шесть).

Октавы

На грифе гитары одни и те же ноты представлены много раз, но в разных октавах. Нота C, например, представлена ​​шесть раз на первых двенадцати ладах. Если мы начнем считать слева от самой нижней струны, первые две ноты до будут в одной октаве, следующие три — во второй октаве, а последняя — в третьей октаве.

Если вам очень трудно выучить все ноты на грифе, вы должны хотя бы начать с изучения тонов на низких струнах ми и ля, потому что на этих струнах часто находятся тоники аккордов.И, как вы можете заметить, самая нижняя и самая высокая струны идентичны.

Наклейки для нот на грифе

Если вы все еще не уверены, есть способы обойти это. Например, вы можете приклеить несколько нот сбоку на гриф гитары или, если вы хотите, чтобы это было немного красивее, вы можете использовать специальные наклейки для нот. (#CommissionsEarned), как на картинке ниже.

Онлайн-кампус микроскопии ZEISS | FRET-микроскопия со спектральной визуализацией

Введение

Сложная ассоциация между белками и путями передачи сигнала, которые контролируют клеточную функцию, зависит от множества слабых и преходящих динамических взаимодействий, которые часто трудно или даже невозможно охарактеризовать с помощью традиционной биохимической методологии.Флуоресцентная микроскопия продемонстрировала превосходную чувствительность при обнаружении чрезвычайно низких концентраций меченых биомолекул в очень широких пространственных и временных измерениях. С появлением и разработкой высокоэффективных генетически кодируемых флуоресцентных белков, которые могут стабильно экспрессироваться в живых клетках, появилось несколько методов флуоресценции, которые стали мощными инструментами для визуализации динамических взаимодействий белков in situ в физиологических условиях. В частности, применение резонансного переноса энергии Фёрстера (FRET) становится все более популярным, чтобы служить молекулярной линейкой при определении межмолекулярных расстояний или для демонстрации того, образуются ли вообще молекулярные комплексы.Чтобы сконструировать биомолекулы, потенциально способные к взаимодействию с FRET, можно использовать простые методы молекулярной биологии для слияния кДНК, кодирующей флуоресцентные белки, с кДНК белков-мишеней, которые, как предполагается, участвуют. В настоящее время предпочтительными флуоресцентными белками для FRET-анализа являются производные Aequorea victoria медузы GFP, обладающие голубой и желтой эмиссией (ECFP и EYFP) в качестве доноров и рецепторов соответственно. Хотя ECFP и EYFP использовались в многочисленных исследованиях FRET, несколько более новых и более совершенных вариантов, Cerulean (производное голубого) и Citrine или Venus (производное желтого цвета), доказали свою высокую эффективность в обеспечении увеличенного динамического диапазона, необходимого для внимательно следите за чувствительными сигналами FRET.Кроме того, продолжающееся расширение цветовой палитры флуоресцентных белков предоставляет новых кандидатов в оранжевой, красной и дальнекрасной областях спектра в качестве потенциальных партнеров FRET для существующих голубых, зеленых и желтых белков.

Одним из наиболее полезных применений FRET в клеточной биологии является метод, который включает слияние двух флуоресцентных белков с концами экологически чувствительного белка или пептида, чтобы действовать как биосенсор специфических клеточных функций.Биосенсоры флуоресцентных белков нашли широкое применение в отчетах о разнообразных внутриклеточных процессах. Творчески сочетая FRET-способные пары флуоресцентных белков с биополимерами, которые выполняют важные функции, участвующие в различных аспектах физиологической передачи сигналов, ученые-исследователи разработали множество новых молекулярных зондов, которые можно использовать для оптической визуализации в живых клетках таких важных процессов, как кальциевая волна. индукция, циклические нуклеотидные мессенджеры, рН, флуктуации мембранного потенциала, фосфорилирование и действие внутриклеточных протеаз.Возможно, наиболее широко используемый дизайн биосенсора для скрининга новых или улучшенных пар FRET включает анализ расщепления протеазой (см. Рисунок 1). Простой мотив состоит из двух флуоресцентных белков (в данном случае Cerulean и Venus), связанных между собой коротким пептидом, который содержит сайт расщепления консенсусной протеазой. В целом сенсор демонстрирует очень сильный резонансный перенос энергии, который полностью прекращается при расщеплении линкерной последовательности. Поскольку этот метод обычно имеет высокие уровни динамического диапазона, его можно использовать для скрининга новых голубых и зеленых доноров FRET с желтыми, оранжевыми и красными акцепторами.Принципы резонансной передачи энергии Фёрстера (FRET)

Типичные методы флуоресцентной микроскопии основаны на поглощении света флуорофором на одной длине волны (возбуждение) с последующим испусканием вторичной флуоресценции на более длинной длине волны. Максимумы (пики) спектральных профилей возбуждения и излучения отделены друг от друга переменной шириной полосы в диапазоне от десятков до сотен нанометров. Мечение внутриклеточных компонентов, таких как ядра, митохондрии, цитоскелет и мембраны, специфическими флуорофорами позволяет локализовать их в фиксированных и живых препаратах.При одновременном мечении нескольких субклеточных структур отдельными флуорофорами, имеющими отдельные спектры возбуждения и испускания, можно использовать специальные комбинации флуоресцентных фильтров для изучения близости меченых молекул в одной клетке или срезе ткани. При использовании этого метода молекулы, которые находятся ближе друг к другу, чем предел оптического разрешения, кажутся совпадающими (и говорят, что они совместно локализуются). Эта кажущаяся пространственная близость означает, что молекулярная ассоциация возможна.Однако в большинстве случаев нормальное разрешение флуоресцентного микроскопа, ограниченное дифракцией, недостаточно, чтобы определить, действительно ли имеет место взаимодействие между биомолекулами. FRET представляет собой процесс, при котором происходит безызлучательная передача энергии от флуорофора в возбужденном состоянии (донор ) ко второму флуорофору (акцептор ), находящемуся в непосредственной близости. Поскольку диапазон, в котором может происходить передача энергии, ограничен примерно 10 нанометрами (100 ангстрем), а эффективность передачи чрезвычайно чувствительна к разделяющему расстоянию между флуорофорами, измерения FRET могут быть ценным инструментом для исследования молекулярных взаимодействий.

Фундаментальный механизм FRET включает донорный флуорофор в возбужденном электронном состоянии, который способен передавать свою энергию возбуждения соседнему акцепторному флуорофору (или хромофору) безызлучательным образом посредством дальнодействующих диполь-дипольных взаимодействий. Теория, поддерживающая передачу энергии, основана на концепции рассмотрения флуорофора в возбужденном состоянии как колеблющегося диполя, который может обмениваться энергией со вторым диполем, имеющим аналогичную резонансную частоту.В этом отношении резонансная передача энергии аналогична поведению связанных осцилляторов, таких как пара камертонов, вибрирующих на одной частоте. Напротив, радиационный перенос энергии (который не происходит в FRET) требует испускания и последующего повторного поглощения фотона и зависит от физических размеров и оптических свойств образца, а также от геометрии контейнера и путей прохождения волнового фронта. . В отличие от радиационных механизмов, резонансный перенос энергии может дать значительный объем структурной информации о паре донор-акцептор.

Резонансный перенос энергии не чувствителен к окружающей растворяющей оболочке флуорофора и, таким образом, производит молекулярную информацию, уникальную по сравнению с той, которая выявляется зависимыми от растворителя событиями, такими как тушение флуоресценции, реакции в возбужденном состоянии, релаксация растворителя или анизотропные измерения. Основное влияние растворителя на флуорофоры, участвующие в резонансном переносе энергии, заключается в влиянии на спектральные свойства донора и акцептора. Безызлучательный перенос энергии происходит на гораздо большие расстояния, чем короткодействующие эффекты растворителя, а диэлектрическая природа компонентов (растворитель и макромолекула-хозяин), расположенных между задействованными флуорофорами, очень мало влияет на эффективность резонансного переноса энергии, которая зависит в первую очередь от расстояние между донорным и акцепторным флуорофором.

Явление FRET не опосредуется испусканием фотонов и, более того, даже не требует, чтобы акцепторный хромофор был флуоресцентным. Однако в большинстве применений и донор, и акцептор флуоресцируют, и возникновение переноса энергии проявляется в тушении флуоресценции донора и уменьшении времени жизни флуоресценции, что также сопровождается увеличением эмиссии флуоресценции акцептора (от чего зависит экспериментальная эффективность FRET). можно извлечь).Если акцептор является флуоресцентным, он будет излучать фотоны в соответствии со своим характерным спектральным профилем, что приведет к измеримому логометрическому изменению сигнала. Большое отношение интенсивности акцептора к донору свидетельствует о высокой эффективности FRET, что также может быть связано с более коротким расстоянием или более благоприятной ориентацией между флуорофорами. Эффективность процесса передачи энергии ( E FRET ) изменяется пропорционально обратной шестой степени расстояния, разделяющего молекулы донора и акцептора ( r ), как показано в уравнении, представленном ниже.Следовательно, измерения FRET можно использовать в качестве эффективной молекулярной линейки для определения расстояний между биомолекулами, помеченными соответствующим донорным и акцепторным флуорофором, когда они находятся в пределах 10 нанометров друг от друга. Таким образом, эффективность FRET можно математически описать как:

E ЛАД = 1/[1 + (r/R 0 ) 6 ]

, где R 0 (обычно называемое радиусом Фёрстера) представляет характеристическое расстояние, при котором эффективность FRET составляет 50 процентов.В дополнение к требованию близости эффективная передача энергии требует значительного перекрытия спектров между излучением донора и спектрами поглощения акцептора (как показано на рисунке 2). Эффективность повышается за счет увеличения квантового выхода донора и/или коэффициента экстинкции акцептора. Например, ECFP имеет квантовый выход 0,40, тогда как выход Cerulean примерно на 50 процентов больше, что увеличивает эффективность FRET, когда Cerulean заменяет ECFP в качестве донора FRET.Точно так же коэффициент поглощения Венеры примерно на 11 процентов выше, чем у EYFP, что делает Венеру лучшим акцептором FRET. Как правило, спектральное перекрытие между донором и акцептором должно быть достаточным для обеспечения радиуса Фёрстера, который составляет приблизительно 4 нанометра или более. Другим важным параметром, который следует учитывать при выборе флуоресцентных белков в качестве пар FRET, является соответствие относительной скорости созревания. Количество времени, необходимое для созревания хромофора, колеблется от нескольких минут до многих часов, в зависимости от конкретного белка, и может широко варьироваться в пределах близкородственных вариантов.Измерения FRET будут скомпрометированы в тех случаях, когда донорский флуоресцентный белок созревает значительно быстрее или медленнее, чем акцепторный.

Для оптимизации измерений FRET необходимо учитывать множество других факторов. Одной из основных проблем является относительная яркость донорных и акцепторных флуорофоров. В целом из-за ограниченного динамического диапазона большинства микроскопов флуорофоры, сопоставимые по яркости, как правило, дают более удовлетворительные результаты. Значительное рассогласование по яркости часто приводит к тому, что сигнал одного флуорофора насыщает канал детектора, а сигнал другого (более диммерного) флуорофора теряется в шумовом пороге.Другая часто встречающаяся ловушка — это прямое возбуждение акцептора на длине волны, используемой для возбуждения донора, что приводит к избыточному излучению акцептора, которое не является результатом FRET. Этот артефакт называется спектральным просачиванием акцептора . Кроме того, флуоресцентное излучение донора может просачиваться в канал обнаружения акцептора (известный как просачивание спектра донора ), что также приводит к искусственно завышенным значениям FRET (рис. 2). В связи с тем, что эти источники просачивания будут присутствовать практически во всех парах FRET, их неизбежно необходимо устранять во время измерений FRET.Флуоресцентные белки в анализе FRET

Выбор подходящих зондов для исследования FRET в живых клетках ограничен. Синтетические флуорофоры, идеально подходящие для исследования резонансной передачи энергии в фиксированных клетках, трудно вводить и нацеливать на живые клетки. Точно так же квантовые точки можно использовать для маркировки компонентов мембраны для изучения явлений на внешней стороне плазматической мембраны, но эти зонды не могут проникать через мембрану и поэтому малопригодны для внутриклеточных компартментов, таких как ядро, митохондрии, комплекс Гольджи. или эндоплазматический ретикулум.Генетически кодируемые флуоресцентные белки в настоящее время являются одними из лучших флуорофоров-кандидатов для визуализации FRET с высоким разрешением в живых клетках. Однако многие типичные артефакты, возникающие при измерении FRET с помощью синтетических флуорофоров и квантовых точек, особенно остро проявляются применительно к флуоресцентным белкам. Например, в отличие от 30–40 нанометров полной ширины на половине максимума ( FWHM ), характерной для спектральных профилей излучения многих синтетических красителей, профили флуоресцентных белков варьируются от примерно 60 нанометров до значительно более 100 нанометров, что часто приводит к значительные области перекрытия при попытке разделить флуоресценцию донора и акцептора.Таким образом, широкие спектральные профили флуоресцентных белков ограничивают количество зондов, которые можно использовать вместе в FRET и других типах экспериментов по визуализации.

Окружает хромофор флуоресцентного белка полипептид из 220-230 аминокислот, свернутый в трехмерную цилиндрическую структуру размером примерно 2,4 на 4,2 нанометра (называемую бета--бочонком; см. бета — листы, которые окружают и защищают центральную альфа — спираль, содержащую остатки, образующие хромофор.Концы ствола закрыты полуспиральными пептидными областями, которые блокируют проникновение ионов, воды и малых молекул. Внутренняя часть белка настолько плотно упакована боковыми цепями аминокислот и молекулами воды, что остается мало места для диффузии. Эти благоприятные структурные параметры, которые частично ответственны за устойчивую фотостабильность и отличные характеристики флуоресцентных белков, также способствуют снижению эффективности FRET (рис. 3). Большой размер цилиндра эффективно экранирует соседние хромофоры флуоресцентных белков с пептидными остатками (до предельного расстояния близкого сближения в 2-3 нанометра), что приводит к снижению максимальной эффективности FRET, которая может быть получена с флуоресцентными белками, примерно до 40 процентов. теоретическое значение.Несмотря на это, многочисленные преимущества использования флуоресцентных белков для визуализации FRET живых клеток намного перевешивают затраты.

Усугубляет проблемы спектральной ширины полосы и размера, с которыми сталкиваются флуоресцентные белки, также их высокое сродство к олигомеризации. Почти все флуоресцентные белки, открытые к настоящему времени, обладают по крайней мере ограниченной степенью четвертичной структуры, о чем свидетельствует слабая склонность нативного зеленого флуоресцентного белка медузы Aequorea victoria и его производных к димеризации при иммобилизации в высоких концентрациях (например, при ограничивается плазматической мембраной).Этот артефакт также наблюдался в мотиве строгой тетрамеризации нативных желтых, оранжевых и красных флуоресцентных белков, выделенных в рифовых кораллах и морских анемонах. Олигомеризация может быть серьезной проблемой для многих приложений в клеточной биологии, особенно в случаях, когда флуоресцентный белок слит с белком-хозяином, нацеленным на определенное субклеточное место. После экспрессии образование димеров и олигомеров более высокого порядка, индуцированное флуоресцентной белковой частью химеры, может приводить к атипичной локализации, нарушать нормальную функцию, мешать сигнальным каскадам или ограничивать агрегацию продукта слияния внутри специфической органеллы или цитоплазмы.Этот эффект особенно заметен, когда флуоресцентный белок сливается с партнерами, которые сами участвуют в образовании природных олигомеров (такими как актин, тубулин и щелевые контакты; см. рис. 4). Продукты слияния с белками, образующими только слабые димеры (по сути, большинство вариантов Aequorea victoria ), могут не проявлять агрегации или неправильного нацеливания при условии, что локальная концентрация остается низкой. Однако, когда слабодимерные флуоресцентные белки нацелены на определенные клеточные компартменты, такие как плазматическая мембрана, как описано выше, локализованная концентрация белка может стать достаточно высокой, чтобы обеспечить димеризацию.Это явление может вызывать особую озабоченность при проведении межмолекулярных экспериментов FRET, которые часто дают сложные наборы данных, которые иногда скомпрометированы артефактами димеризации. С другой стороны, естественная слабая димеризация белков медуз может в некоторых случаях использоваться для увеличения сигнала FRET в биосенсорах, которые в противном случае демонстрировали бы ограниченный динамический диапазон.

Клеточный дистресс, приводящий к апоптозу или некрозу, является проблемой, возникающей из-за чрезмерных концентраций синтетических флуорофоров и сверхэкспрессии или агрегации плохо локализованных флуоресцентных белков.Кроме того, здоровье и продолжительность жизни оптимально помеченных клеток млекопитающих в камерах микроскопа также могут страдать от ряда других вредных факторов. Главным из них является индуцированное светом повреждение (фототоксичность), возникающее при многократном воздействии на флуоресцентно меченные клетки излучения лазеров, светодиодов и ламп дугового разряда высокой интенсивности. В возбужденном состоянии флуоресцентные молекулы склонны реагировать с молекулярным кислородом с образованием свободных радикалов, которые могут повредить субклеточные компоненты и поставить под угрозу всю клетку.Флуоресцентные белки, как правило, не фототоксичны для клеток, отчасти из-за того, что их флуорофоры скрыты глубоко внутри защитной полипептидной оболочки (см. рис. 3). При планировании экспериментов FRET следует выбирать комбинации флуоресцентных белков с максимально возможной длиной волны возбуждения, чтобы свести к минимуму повреждение клеток коротковолновым освещением, особенно в долгосрочных экспериментах. Таким образом, вместо создания продуктов слияния и биосенсоров с синими или голубыми флуоресцентными белками (возбуждаемыми ультрафиолетовым и синим освещением соответственно) варианты, излучающие в желтой, оранжевой и красной областях спектра, были бы гораздо более идеальными.К сожалению, низкие коэффициенты поглощения и квантовые выходы мономерных оранжевых и красных флуоресцентных белков препятствуют их широкому применению в FRET-анализе. Возможно, когда будут обнаружены новые варианты флуоресцентных белков, зонды в цветовых областях с большей длиной волны станут полезными акцепторами FRET для доноров желтого и зеленого цветов.

Исследователи должны позаботиться о проведении необходимых контрольных экспериментов при использовании новых биосенсоров флуоресцентных белков и клеточных линий, чтобы гарантировать, что артефакты цитотоксичности и фототоксичности не затеняют результаты FRET или не мешают другим важным биологическим явлениям.В некоторых случаях липофильные реагенты вызывают вредные эффекты, которые можно спутать с токсичностью флуоресцентного белка во время визуализации в клеточных линиях после транзиторной трансфекции. Олигомерные флуоресцентные белки рифовых кораллов (обсуждаемые выше) имеют гораздо большую склонность к образованию агрегатов (в сочетании с плохой субклеточной локализацией), чем мономерные белки медуз, но продукты слияния с неправильной укладкой могут встречаться в любом варианте. Недавно сообщалось, что флуоресцентный белок, способный генерировать активные формы кислорода ( ROS ) при освещении зеленым светом, является эффективным средством для инактивации специфических белков с помощью световой инактивации с помощью хромофора ( CALI ).Этот генетически закодированный фотосенсибилизатор, получивший соответствующее название KillerRed, способен убивать как бактерии, так и эукариотические клетки при освещении в микроскоп. Предыдущие исследования фототоксичности ECFP и EYFP показывают, что даже несмотря на то, что хромофоры способны генерировать синглетный кислород, эти зонды неэффективны в качестве фотосенсибилизаторов. Однако длительное освещение клеток, экспрессирующих любой вариант EGFP, может привести к физиологическим изменениям и возможной гибели клеток, что является определенным показателем потенциальной фототоксичности в долгосрочных экспериментах по визуализации.

В экспериментах с живыми клетками флуоресцентные белки очень полезны для длительной покадровой визуализации из-за их меньшей скорости фотообесцвечивания по сравнению с синтетическими флуорофорами. Хотя существует высокая степень некоррелированной изменчивости между флуоресцентными белками с точки зрения фотостабильности, большинство вариантов можно использовать для краткосрочной визуализации (от 1 до 25 захватов), в то время как некоторые из более фотостабильных белков можно использовать в цейтраферных последовательностях, которые охватывают периоды продолжительностью 24 часа и более (в течение которых собираются от сотен до тысяч изображений).Однако долговременная стабильность любого конкретного белка должна быть исследована для каждого сценария освещения (широкопольного, конфокального, вращающегося диска, многофотонного и т. д.), потому что различия в фотостабильности часто наблюдаются для одного и того же белка при освещении дугой. газоразрядная лампа по сравнению с лазерной системой. Таким образом, с точки зрения фотостабильности выбор флуоресцентных белков диктуется многочисленными параметрами, включая условия освещения, систему экспрессии и эффективность установки для визуализации.

Первой парой флуоресцентных белков, разработанной для анализа FRET, был вариант синего белка (EBFP) в сочетании с EGFP, предназначенный для возбуждения источником ультрафиолетового света. К сожалению, относительно плохие фотофизические свойства EBFP, наряду с потенциальной фототоксичностью коротковолнового освещения, сделали эту комбинацию непрактичной. Новые варианты синих флуоресцентных белков могут возродить эту стратегию спаривания для краткосрочных наблюдений, но им все равно будет препятствовать необходимость высокоэнергетического возбуждения, что исключает использование синих флуоресцентных белков для долгосрочной визуализации.Наиболее эффективной парой флуоресцентных белков FRET остается высокоэффективный вариант ECFP в качестве донора, соединенный с высокоэффективным вариантом EYFP в качестве акцептора. Другие пары включают производное EGFP или EYFP в качестве донора оранжевых и красных вариантов, таких как мономерный Kusabira Orange или mCherry. Среди проблем, связанных с применением оранжевых и красных флуоресцентных белков (все они получены из рифовых кораллов и морских анемонов) в качестве акцепторов FRET, являются длинные хвосты возбуждения, характерные для спектральных профилей поглощения.Во многих случаях спектры поглощения простираются в голубую и зеленую области спектра, что приводит к артефактам прямого возбуждения акцептора.

Свойства пар флуоресцентных белков для спектральной визуализации FRET

Флуоресцентный
Белковый
Пара
Донор
Возбуждение
Максимум
(нм)
Акцептор
Излучение
Максимум
(нм)
Донор
Квант
Выход
Акцептор
Гашение
Коэффициент
Förster
Расстояние
(нм)
Яркость
Соотношение
EBFP2-mEGFP 383 507 0.56 57 500 4,8 1:2
ECFP-EYFP 440 527 0,40 83 400 4,9 1:4
Лазурно-Венера 440 528 0.62 92 200 5,4 1:2
МиЦи-МКО 472 559 0,90 51 600 5,3 1:2
TFP1-mVenus 492 528 0.85 92 200 5.1 1:1
CyPet-YPet 477 530 0,51 104 000 5.1 1:4,5
EGFP-mCherry 507 510 0.60 72 000 5.1 2,5:1
Венера-mCherry 528 610 0,57 72 000 5,7 3:1
Venus-tdTomato 528 581 0.57 138 000 5,9 1:2
Venus-mPlum 528 649 0,57 41 000 5,2 13:1
Таблица 1

Недавнее расширение цветовой палитры флуоресцентных белков для создания вариантов, обладающих широким спектром спектральных профилей, в сочетании с возрастающей сложностью конструкции белковых химер (слияний, а также биосенсоров) привело к появлению ряда потенциальных пар флуоресцентных белков, которые потенциально полезно в экспериментах FRET (см. Таблицу 1).Применение флуоресцентных белков для FRET включает либо интеграцию выбранной пары в биосенсор (единая генетически кодируемая конструкция, как кратко обсуждалось выше), либо проведение межмолекулярных измерений между двумя отдельными белками, каждый из которых слит с другим флуоресцентным белком. Последний подход использовался для изображения различных белковых взаимодействий, включая олигомеризацию рецепторов и выяснение функций факторов транскрипции. Однако проведение анализов FRET на независимо экспрессируемых белковых химерах гораздо сложнее из-за вариабельной стехиометрии, которая неизбежно возникает при экспрессии отдельных флуоресцентных объектов в живых клетках.Методы измерения FRET

В связи с тем, что практически всем комбинациям флуорофоров, используемым для мониторинга FRET, препятствуют определенные и часто уникальные проблемы, которые усложняют их применение для этого метода, для исследователя крайне важно полностью понять методологию, в соответствии с которой проводится FRET. измерено. Исследователи должны использовать как можно больше различных методов измерения при проведении пилотных экспериментов с новыми комбинациями FRET с биологическими последствиями.После точной настройки системы и получения согласованных и понятных результатов можно использовать простейшие экспериментальные подходы для дополнительных измерений. Хотя для измерения FRET было разработано большое количество методов, многие из них очень сложны и требуют оборудования, которого нет в большинстве основных лабораторий микроскопии. Наиболее практичные подходы к измерению FRET ограничены несколькими методами, которые будут обсуждаться ниже.

Высокая степень спектрального перекрытия между профилями излучения донора и профиля поглощения акцептора, необходимая для FRET, также создает значительный уровень фонового шума, который может существенно мешать обнаружению сигналов FRET.Как обсуждалось ранее, спектральное просачивание, возможно, является основной проблемой при разделении сигналов FRET для анализа. Как донор, так и акцептор обычно вносят вклад в просачивание, которое можно обнаружить в канале FRET. Просачивание от донора является результатом перекрытия профилей эмиссии флуоресценции донора и акцептора, которые часто бывают очень широкими (более 100 нанометров) и их трудно разделить. Напротив, просачивание от акцептора является результатом прямого возбуждения акцепторных флуорофоров освещением, которое используется для возбуждения донора и получения FRET.Широкий спектр других источников шума также может искажать измеряемый сигнал FRET. К ним относятся автофлуоресценция, детектор микроскопа и оптический шум, а также изменения спектральной чувствительности в донорных и акцепторных каналах. В результате наиболее полезный подход к измерению точных сигналов FRET требует применения методологии, которая может либо избежать, либо успешно удалить загрязняющие фоновые сигналы.

Просвечивания сигнала можно в значительной степени избежать с помощью методов FRET, таких как фотообесцвечивание акцептора (также обычно называемое дегашением донора ; см. другие ограничения.Метод фотообесцвечивания акцептора используется для определения эффективности FRET путем измерения величины сигнала погашенного донора (рис. 5(а)) в присутствии акцептора с последующим измерением сигнала непогашенного донора после того, как флуоресценция акцептора была разрушена фотообесцвечивание (рис. 5(b) и 5(c)). Основная концепция фотообесцвечивания акцептора FRET заключается в том, что флуоресценция донора гасится в результате резонансной передачи энергии акцептору. В результате фотообесцвечивание акцептора увеличивает флуоресценцию донора из-за потери эффекта тушения.Таким образом, если между донором и акцептором происходит FRET, флуоресценция донора должна увеличиваться, когда акцептор эффективно удаляется после фотообесцвечивания. Одним из преимуществ акцепторного фотообесцвечивания является то, что каждая исследуемая клетка служит своим собственным контролем, что делает этот метод одним из наиболее точных для измерения FRET.

Основная задача при выполнении измерений FRET фотообесцвечивания акцептора состоит в том, чтобы убедиться, что донор также не подвергается фотообесцвечиванию, и что акцептор фотообесцвечивается (как минимум) примерно на 10 процентов от его начального значения.Любое фотообесцвечивание донора приведет к недооценке эффективности FRET из-за потери сигнала. Кроме того, поскольку акцептор подвергается необратимому фотообесцвечиванию (фактически разрушается), методика фотообесцвечивания акцептора не может быть повторена на одной и той же клетке. Кроме того, из-за высокой фотостабильности, проявляемой многими флуоресцентными белками, фотообесцвечивание акцептора может занять несколько минут и менее полезно для динамических измерений в живых клетках. Измерения фотообесцвечивания акцептора также могут быть скомпрометированы, если вся клетка не обесцвечивается за один шаг.Фотообесцвечивание выбранной области цитоплазмы обеспечивает приток свежих флуорофоров в обесцвеченную область, что увеличивает время, необходимое для обесцвечивания всех акцепторных молекул в клетке. Помимо этих проблем, фотообесцвечивание акцептора по-прежнему широко используется для определения эффективности FRET и обеспечивает превосходный контроль после проведения экспериментов, основанных на альтернативных методах.

Мониторинг времени жизни флуоресценции донора в экспериментах FRET можно использовать, чтобы избежать многих проблем, часто возникающих при использовании методов фотообесцвечивания акцептора.FLIM, возможно, является наиболее строгим методом, используемым для измерения FRET, и менее склонен к просачиванию артефактов, поскольку он измеряет только колебания флуоресценции донора. Все флуорофоры, включая флуоресцентные белки, демонстрируют экспоненциальное затухание флуоресцентного излучения, которое можно измерить в наносекундном масштабе. Скорость этого экспоненциального затухания чувствительна к любым процессам, влияющим на возбужденное состояние, включая множество переменных окружающей среды, которые могут погасить флуоресценцию.Таким образом, основная концепция, связанная с FLIM, связана с фотообесцвечиванием акцептора в том смысле, что его можно использовать для обнаружения изменений времени жизни флуоресценции донора, которые сопровождают передачу энергии акцептору. Фактически флуоресценция донора гасится FRET, и степень этого тушения можно определить путем измерения изменений времени жизни флуоресценции донора в присутствии и в отсутствие акцептора.

Сочетание FLIM с FRET может облегчить проблемы с артефактами прямого возбуждения акцептора, которые усложняют другие методологии, и этот метод также можно использовать для мониторинга FRET с использованием акцепторов, которые сами по себе не являются флуоресцентными.Однако у FLIM есть ограничения, которые не позволяют ему стать самым популярным методом визуализации FRET. Основное соображение заключается в том, что измерения времени жизни в наносекундах чрезвычайно сложны и должны проводиться на дорогостоящем оборудовании, которое не является широко доступным. Кроме того, FLIM часто требуется несколько минут для сбора каждого изображения, что сильно ограничивает его применение для быстрых динамических событий. Еще одной сложностью являются многоэкспоненциальные кривые затухания времени жизни, которые обычно встречаются со многими флуорофорами, что обычно требует более полных стратегий сбора данных и усложняет анализ FRET.Наконец, измерения FLIM чувствительны к факторам окружающей среды за пределами FRET, которые могут сократить измеряемый срок службы, включая автофлуоресценцию, вязкость, колебания pH и присутствие ионов металлов. Все только что описанные переменные снижают эффективность использования только методов фотообесцвечивания акцептора и FLIM, однако они представляют собой важный контроль для проверки измерений FRET, полученных другими методами.

Самый простой и простой метод измерения FRET известен как сенсибилизированное излучение (обычно называемое в литературе двухцветным логометрическим изображением ; см. наборы фильтров.При сенсибилизированном излучении донорный флуорофор возбуждается определенным диапазоном длин волн, и сигнал собирается с использованием двух наборов эмиссионных фильтров, настроенных либо на донорную, либо на акцепторную флуоресценцию. Этот метод может давать результаты очень быстро (ограниченный только ограничениями переключения колес фильтров) и поэтому весьма полезен при динамической визуализации живых клеток. В маловероятном случае отсутствия просачивания между возбуждением и испусканием двух флуорофоров преобладающим методом измерения FRET будет сенсибилизированное испускание.К сожалению, просачивание обычно является серьезной проблемой, особенно при использовании флуоресцентных белков, а сенсибилизированное излучение требует обширных контрольных экспериментов, чтобы установить наличие или отсутствие FRET. Кроме того, эти элементы управления должны подвергаться значительной обработке изображения, чтобы исключить просачивание, ограничение, которое замедляет время сбора данных, увеличивает уровень шума и вносит относительно высокую степень неопределенности в измерения.

На рис. 6 показана серия изображений, полученных при широкопольном флуоресцентном освещении кальциевых волн, пересекающих цитоплазму клеток карциномы человека ( HeLa ), экспрессирующих циркулярно пермутированный камелеоновый вектор YC3.60. Этот биосенсор содержит варианты ECFP и EYFP, которые состоят из белкового кальмодулина и кальций-кальмодулин-связывающего домена киназы легкой цепи миозина ( M13 ) в виде линейной химеры. В присутствии повышенных уровней внутриклеточного кальция домен M13 связывает пептид кальмодулина, вызывая увеличение FRET между флуоресцентными белками. На рис. 6(а) представлено реальное цветное изображение двух соседних клеток перед добавлением гистамина для индуцирования связывания кальция с биосенсором.На рисунках с 6(b) по 6(h) показаны псевдоцветные изображения кальциевых волн, распространяющихся через цитоплазму двух клеток HeLa. Обратите внимание, что волна распространяется сверху вниз в верхней ячейке и справа налево в нижней ячейке. Общее время прохождения кальциевой волны через цитоплазму в этих клетках составляло примерно 1,5 секунды. Уровень FRET указывается путем сравнения логометрических псевдоцветов с легендой, представленной на рисунке 6 (а). Изображения на рисунке 6 были получены с использованием двухдиапазонного дихроматического светоделителя, соединенного с фильтрами возбуждения и излучения, настроенными на оптимальные диапазоны длин волн для визуализации ECFP и EYFP с минимальным просачиванием.

Описан ряд корректирующих подходов к сенсибилизированному излучению с использованием нескольких различных комбинаций фильтров с контролями, которые содержат только донор, только акцептор, или образец FRET с донором и акцептором. Элементы управления позволяют исследователю определить уровень просачивания возбуждения и эмиссии и вычесть его из измерения FRET. Однако из-за всех необходимых поправочных коэффициентов количество шума в конечном FRET-изображении может превышать уровень сенсибилизированного излучения в ситуациях, когда взаимодействия между донором и акцептором слабы.Спектральная визуализация в измерениях FRET

В приложениях FRET спектральную визуализацию можно рассматривать как разновидность метода сенсибилизированного излучения, основанного на возбуждении только донора с последующим получением всего спектра излучения как флуоресценции донора, так и акцептора вместо сбора данных в двух независимых каналах. До появления лазерных сканирующих конфокальных микроскопов, предназначенных для получения спектральных изображений, этот метод в значительной степени ограничивался экспериментами по спектроскопии с использованием кювет и очищенных флуорофоров.Спектральная визуализация FRET предполагает, что сбор всего спектра флуоресценции позволит разделить перекрывающиеся спектральные профили в соответствии с отчетливыми формами спектров, а не просто контролировать интенсивность излучения в ограниченной области полосы пропускания с помощью фильтра. Таким образом, собирая весь спектр как от донора, так и от акцептора (см. рис. 7(а)), можно с помощью спектральной визуализации определить уровни флуоресценции донора и акцептора, а на основе этой информации (в сочетании с контролями) рассчитать эффективность FRET.

Представленное на рисунке 7 логометрическое измерение спектральной визуализации для биосенсора кальция с флуоресцентным белком, известного как камелеон YC3.60, как описано выше. Спектральные профили YC3.60 в присутствии (красная кривая; рис. 7(а)) и в отсутствие (желтая кривая) кальция демонстрируют широкий динамический диапазон зонда при 530 нм. Мультяшные рисунки биосенсора камелеона представлены в присутствии (рис. 7(b)) и в отсутствие (рис. 7(c)) кальция, чтобы проиллюстрировать, как щелочной металл вызывает конформационные изменения в M13, чтобы переместить две части флуоресцентного белка ближе друг к другу. .Стек лямбда-изображений с интервалом 10 нанометров клеток, экспрессирующих камелеон в присутствии высокой концентрации кальция, показан на рисунке 7(d). Отметим, что самые высокие интенсивности наблюдаются для лямбда-плоскости, содержащей длины волн излучения от 530 до 540 нм.

Сравнение спектральной визуализации с линейным разделением и сенсибилизированным излучением с двумя длинами волн возбуждения для определения FRET показывает, что отношение сигнал/шум для методов сенсибилизированного излучения ниже, чем при спектральной визуализации (хотя это не всегда так и зависит сильно зависит от параметров и конфигурации прибора).Это несоответствие связано с тем, что фильтры излучения с относительно узкой полосой пропускания, необходимые для отделения излучения от близко перекрывающихся флуорофоров, блокируют большинство пригодных для использования фотонов, которые в противном случае обнаруживаются с помощью спектральной визуализации. Отбрасывание большого количества излучения приводит к значительной потере информации, которая в некоторых случаях приближается к 50 процентам имеющихся данных. Кроме того, спектральное изображение обеспечивает оптимальное взвешивание в соответствии с шумом, присутствующим в отдельных каналах данных, в отличие от традиционных методов (часто произвольно отбрасываемых).Спектральная визуализация требует предварительного определения уровня просачивания из-за прямого возбуждения акцептора, но этот метод может выиграть от использования двух длин волн возбуждения с инструментами, которые так оборудованы.

Конфокальные микроскопы для получения спектральных изображений, оснащенные акустооптическими перестраиваемыми фильтрами ( AOTF ) и специализированными детекторными системами, могут использоваться для получения серии изображений в дискретных полосах с ограниченным диапазоном длин волн для создания так называемых лямбда-стеков (изображения боковых ( x,y ) плоскость как функция длины волны).Спектральные характеристики ( эмиссионные отпечатки ) для отдельных флуорофоров или флуоресцентных белков и загрязняющих фоновых сигналов (таких как аутофлуоресценция) получаются путем деконволюции лямбда-стеков. Метод линейного разделения может быть применен к лямбда-стеку для разделения вкладов отдельных сигналов флуорофора в каждом пикселе полученного изображения. Таким образом, спектральная визуализация в сочетании с линейным разделением может определять и устранять вклад просачивания донором в сигнал FRET.Однако в связи с тем, что флуоресцентное излучение, создаваемое прямым возбуждением акцептора (обозначаемое как просачивание акцептора, см. выше), идентично по спектральным характеристикам флуоресцентному сигналу, создаваемому FRET, необходимо разработать средства контроля, помогающие определить и устранить вклад просачивания акцептора, чтобы получить эффективность FRET. Спектральную визуализацию также можно комбинировать с фотообесцвечиванием акцептора или использовать для изучения динамических изменений эффективности FRET в биосенсорах флуоресцентных белков без использования контролей.Последняя стратегия, возможно, является наиболее широко применяемой техникой исследования FRET с помощью спектральной визуализации.

Для устранения спектрального просачивания акцептора из-за перекрестного возбуждения в приложениях спектральной визуализации FRET большинство подходов основано на предположении, что при визуализации в идентичных условиях динамика этих артефактов будет практически одинаковой в контрольных клетках, которые экспрессируют только акцептор (по сравнению с экспериментальными клетками, которые экспрессируют как донор, так и акцептор).Однако из-за того, что для определения вклада просачивания в экспериментальных ячейках используются разные ячейки, непосредственное сравнение отдельных местоположений пикселей невозможно. В большинстве случаев можно провести сравнение между пикселями как в контрольных, так и в экспериментальных клетках, которые имеют одинаковые уровни флуоресценции. Этот метод основан на алгоритме, который определяет уровни флуоресценции пиксель за пикселем и устанавливает уровень просачивания в контрольных клетках, которые экспрессируют только акцептор.Эти контрольные значения просачивания затем применяются в качестве поправочного коэффициента к соответствующим совпадающим пикселям в экспериментальных клетках, которые экспрессируют как донорные, так и акцепторные флуорофоры.

В парах FRET флуоресцентных белков, которые созданы с вариантами голубых и желтых флуоресцентных белков (ECFP и EYFP), спектральная визуализация требует возбуждения голубого варианта с использованием лазерной спектральной линии, которая перекрывается с профилем поглощения флуоресцентного белка. Современные конфокальные микроскопы оснащены диодными и газовыми лазерами со спектральными линиями 405, 440 и 458 нанометров, каждый из которых полезен для возбуждения голубых флуоресцентных белков.Однако 458-нанометровая спектральная линия аргон-ионного газового лазера приводит к значительному просачиванию акцептора (примерно 20 процентов) в канал FRET для пар ECFP-EYFP. Напротив, 405- и 440-нанометровые диодные лазеры будут генерировать меньшее просачивание (примерно 4 и 8 процентов соответственно), но для точного расчета сигнала FRET все же необходимо удалить загрязняющий сигнал от прямого возбуждения акцептора. После установления соотношения интенсивностей изображения донора в присутствии ( I DA ) и в отсутствие ( I D ) акцептора эффективность FRET можно определить, применяя следующую зависимость:

E ЛАД = 1 — (I DA /I D )

Расчет эффективности FRET таким образом был подтвержден с использованием пар FRET флуоресцентных белков, которые были слиты вместе с короткими пептидными линкерами, а также с гораздо более сложной задачей исследования FRET между зондами, которые экспрессируются по отдельности.Результаты показали очень похожие значения эффективности FRET при сравнении спектральной визуализации с методологией на основе интенсивности и FLIM. Тем не менее, спектральная визуализация позволяет избежать потенциальных проблем, связанных с просачиванием акцепторного сигнала в донорный канал, что характерно для сенсибилизированного излучения на основе фильтров и визуализации с многофотонным возбуждением. С осторожностью отметим, что компонент просачивания спектра акцептора часто незначителен и может создавать проблемы при количественной оценке уровня сигнала при использовании детекторов фотоумножителей, которые имеют нестабильный отклик при очень низких значениях интенсивности.Этот артефакт можно преодолеть, определяя протекание при разных уровнях интенсивности в контрольных клетках.

Перекрестного возбуждения акцептора можно избежать, выбирая пары FRET флуоресцентных белков, которые имеют донор с большим стоксовым сдвигом. Например, mT-Sapphire и mAmetrine представляют собой производные GFP, которые поглощают свет в ультрафиолетовых длинах волн (приблизительно 400 нанометров), но излучают либо в зеленой (510 нанометров), либо в желтой (530 нанометров) областях спектра.Когда эти доноры соединяются с акцепторами оранжевого или красного флуоресцентного белка, возбуждение пары FRET приводит к незначительному просачиванию акцептора и не требует никаких корректирующих факторов или контролей. Например, сочетание производного GFP, известного как GFP2, с EYFP привело к образованию пары FRET, которую можно возбудить с помощью 405-нанометрового диодного лазера и успешно наблюдать с помощью спектральной визуализации. Поскольку спектры испускания GFP2 и EYFP сильно перекрываются, линейное разделение данных FRET позволяет выявить вклад каждого флуорофора в общее испускание флуоресценции.Аналогичным образом, сочетание mAmetrine с тандемным димером Tomato (tdTomato) привело к образованию пары FRET, которая испускает оранжево-красную флуоресценцию при возбуждении на длине волны 405 нанометров. Возбуждение одного tdTomato на этой длине волны практически не дает заметного сигнала, поэтому при использовании этой пары поправка на просачивание акцептора не требуется. Подобные пары FRET, скорее всего, дадут идентичные результаты.

Из-за неспособности конфокальной микроскопии спектральной визуализации различить сигнал излучения акцептора, генерируемый посредством FRET, и сигнал, происходящий от прямого возбуждения акцептора во флуоресцентном белке и других парах флуорофоров, которые имеют сильно перекрывающиеся спектральные профили, необходимые для FRET, несколько исследователей объединили спектральное изображение с методами фотообесцвечивания акцептора для определения эффективности FRET.На рисунке 8 показан пример спектральной визуализации флуоресцентных белков с фотообесцвечиванием акцептора для анализа FRET. Флуорофор представляет собой химеру mCerulean и mVenus, слитых вместе с линкером из 10 аминокислот. При экспрессии в клетках млекопитающих (кроличьи почки) вектор слияния распространяется по цитоплазме и проникает в ядро. Спектральное изображение экспрессированного вектора в клетках, полученное от 450 до 650 нанометров, представлено на рисунке 8 (а) со спектрально разрешенными изображениями эмиссии mCerulean и mVenus, показанными на рисунках 8 (b) и 8 (c), соответственно.При фотообесцвечивании mCerulean в ячейке, показанной в нижней части окна светом с длиной волны 514 нм (рис. 8(f)), флуоресцентная эмиссия mCerulean увеличивается (рис. 8(d) и 8(e)) вследствие донора. растушевка.

Фотообесцвечивание акцептора обычно осуществляется с использованием спектральной линии лазера, которая перекрывает область с высоким коэффициентом экстинкции (как можно ближе к пику) в спектре поглощения акцептора. Например, в комбинации ECFP-EYFP FRET линия аргон-ионного лазера с длиной волны 514 нм обычно используется для фотообесцвечивания EYFP, таким образом уменьшая гашение ECFP с последующим увеличением сигнала донора (рис. 8(d)–8(f)).Поскольку EFYP подвергается постепенному фотообесцвечиванию, лямбда-сканирование спектральных изображений проводится с использованием линии аргон-ионного лазера с длиной волны 548 нм (возбуждающей ECFP) между каждым событием фотообесцвечивания, чтобы регистрировать изменения спектрального отклика. Как правило, лямбда-стеки собираются в диапазоне длин волн от 465 до 600 нанометров в дискретной полосе пропускания (примерно 10 нанометров). Этот экспериментальный подход предназначен для минимизации ошибки отдельных измерений путем подгонки изменений интенсивности к стандартной кривой.Значения максимального увеличения интенсивности ECFP затем можно экстраполировать из этой кривой, даже если EYFP никогда не подвергается полному фотообесцвечиванию. Конечная цель состоит в том, чтобы избежать повреждения живых клеток и нежелательного фотообесцвечивания ECFP в ходе эксперимента. Методы фотообесцвечивания акцептора дают оптимальные результаты, когда донор фотостабилен, а акцептор фотозависим, ситуацию, которую можно контролировать, выбирая подходящие варианты флуоресцентного белка, такие как Cerulean и Venus.

Чтобы рассчитать эффективность FRET с использованием метода фотообесцвечивания акцептора, необходимо выполнить ряд шагов в стратегии анализа данных. Первый этап состоит из линейного разделения компонентов ECFP и EYFP (или других флуорофоров, если они используются вместо них). Затем за измерением средней интенсивности донора ECFP и акцептора EYFP следует расчет изменений интенсивности для определения эффективности FRET. После получения стеков лямбда линейное разделение используется для создания изображений донора ECFP и акцептора EYFP из стеков.Общий успех линейного разделения зависит от наличия образцов с хорошим соотношением сигнал-шум и использования эталонных спектров, точно представляющих спектры, содержащиеся в образце FRET. В большинстве случаев клетки, экспрессирующие только ECFP или EYFP (контроль), используются для создания эталонных спектров. Контрольные спектры должны быть получены в тех же условиях, что и для образца FRET, включая настройки усиления, смещение, диапазон длин волн, объектив и дихроматическое зеркало. Изображения должны быть получены с минимальной насыщенностью сигнала и минимальной интенсивностью пикселей, установленной чуть выше нуля, чтобы получить максимально возможный динамический диапазон.После вычитания фона эффективность FRET рассчитывается с использованием уравнения, представленного выше, где ( I DA ) и ( I D ) представляют нормированные интенсивности донора до и после 100-процентного фотообесцвечивания акцептора. Из-за того, что EYFP почти никогда полностью не обесцвечивается, значение для ( I D ) обычно экстраполируется из линейной аппроксимации графика, описывающего процентное увеличение эмиссии ECFP по сравнению с процентным уменьшением EYFP.Аналогичным образом метод фотообесцвечивания акцептора можно использовать с другими парами флуоресцентных белков (например, EGFP и mKusabira Orange).

Уникальный подход к измерению FRET с помощью спектральной визуализации был назван lambda FRET и оказался высокоспецифичным, чувствительным и надежным методом анализа резонансной передачи энергии в живых клетках. Алгоритм лямбда-FRET основан на отображении образца FRET на нескольких длинах волн излучения с последующим разделением спектра FRET на его донорную и акцепторную составляющие для расчета эффективности FRET на основе пикселей.Lambda FRET применяет новую процедуру предварительной калибровки для коррекции спектрального просачивания на основе получения эталонных изображений отражения и была подтверждена с использованием стандартов синтетических флуорофоров FRET (таких как Alexa Fluor 488 и Cy3), а также слияний флуоресцентных белков. (ECFP и EYFP) с различной длиной линкера и стехиометрией. Уникальная процедура коррекции, основанная на использовании изображений отражения для нормализации для различных интенсивностей излучения света, в принципе аналогична методам сенсибилизированного излучения, но дает результаты с меньшим шумовым загрязнением.Было продемонстрировано, что лямбда-FRET полезен в случаях, когда сильное спектральное перекрытие и артефакты аутофлуоресценции присутствуют как в фиксированных, так и в сценариях визуализации живых клеток.

Помимо исследования межмолекулярных взаимодействий и определения эффективности FRET с использованием методов фотообесцвечивания акцептора и коррекции просачивания, спектральная визуализация оказалась очень полезной для изучения биосенсоров флуоресцентных белков для определения наличия или отсутствия FRET в ответ на биологический стимул. .Методология требует получения спектра биосенсора в присутствии и в отсутствие стимулятора, чтобы определить, наблюдается ли FRET или устраняется, и контролировать динамический диапазон ответа (см. Рисунок 7). Таким образом, путем творческого слияния пар флуоресцентных белков с биополимерами, которые выполняют критические функции, связанные с различными аспектами физиологической передачи сигналов или другой биологической активности, ряд исследователей разработали множество новых молекулярных зондов, которые можно использовать для оптической визуализации важных клеток в живых клетках. метаболические и сигнальные процессы.Как правило, два флуоресцентных белка (обычно голубой и желтый вариант) вставляются на противоположных концах последовательности сенсорного белка или пептида (см. Фигуру 9), как кратко описано выше. Изменения в конформации сенсорного белка вызывают соответствующие третичные изменения в структурной организации комплекса и, таким образом, уровень FRET, который можно наблюдать между фланкирующими флуоресцентными белками. Рационометрическое изменение выхода флуоресценции донора и акцептора с использованием одного параметра возбуждения в сочетании со спектральной визуализацией становится популярной методологией для исследования этих биосенсоров.

На рисунке 9 представлена ​​карикатура, иллюстрирующая распространенные стратегии конструирования биосенсоров на основе флуоресцентных белков. Голубые цилиндры представляют собой CFP, серые цилиндры представляют YFP без FRET, а желтые цилиндры представляют YFP с FRET. Синие молнии указывают на возбуждение на 450 нм, а параллельные волны — на флуоресцентное излучение (на 475 нм — голубой; или на 530 нм — желтый). Сенсорные домены окрашены в телесный цвет, а эффекторные агенты имеют форму сфер или эллипсов. На рис. 9(а) показан межмолекулярный FRET между отдельным сенсорным доменом и субстратом, слитым с CFP и YFP, соответственно, тогда как на рис. 9(b) показан биосенсор флуоресцентного белка с одним сенсорным доменом и эффекторным лигандом.Связывание субстрата с сенсорным доменом на рис. 9(а) вызывает FRET, тогда как связывание лиганда на рис. 9(б) вызывает конформационные изменения в сенсорном домене, чтобы привести флуоресцентные белки в правильную близость для переноса энергии (см. также Рисунки 7(b) и 7(c)). В некоторых случаях домены субстрата и сенсорного белка связаны (рис. 9(с)) для создания единой генетической единицы экспрессии для внутримолекулярного FRET, в отличие от ситуации на рис. 9(а). Биосенсор флуоресцентного белка, который обнаруживает расщепление субстрата (рис. 1 и рис. 9 (d)) действует путем устранения FRET после индукции соответствующей протеазы.Биосенсоры расщепления протеазы являются популярными индикаторами апоптоза.

За последние несколько лет было сообщено о большом количестве новых биосенсоров, использующих различные пары FRET. Несмотря на ограничения динамического диапазона, наблюдаемые в нескольких биосенсорах FRET, использующих голубые и желтые производные, использование этих флуоресцентных белков получило широкое распространение, вероятно, из-за простоты логометрических измерений, широкой доступности и простоты сравнения с другими сенсорами, имеющими аналогичные свойства. .Начинают появляться альтернативные пары FRET, включая донорные флуоресцентные белки голубого и бирюзового цветов, связанные с желтыми и оранжевыми акцепторными флуоресцентными белками, а также доноры зеленых флуоресцентных белков, связанные с акцепторами красных флуоресцентных белков. Однако на сегодняшний день полезность флуоресцентных белков, полученных из рифовых кораллов и актиний, ограничена. Несколько многообещающих биосенсоров сочетают сапфировое или желтое производное GFP с красным флуоресцентным белком для получения репортера с длинным сдвигом Стокса, как обсуждалось выше.Усовершенствованные биосенсоры, без сомнения, появятся с использованием более точно настроенных комбинаций флуоресцентных белков, которые служат для увеличения динамического диапазона и других свойств этого очень полезного класса зондов. С этой целью спектральная визуализация в сочетании с линейным разделением будет по-прежнему рассматриваться как один из предпочтительных методов для анализа FRET.

Выводы

Разработан ряд методов анализа FRET во флуоресцентных белках, а также в синтетических красителях и квантовых точках.Для визуализации живых клеток спектральная визуализация в сочетании с линейным разделением обеспечивает надежный метод измерения FRET с использованием флуорофоров с сильно перекрывающимися спектральными профилями, что обычно происходит с образцами FRET. Новые биосенсоры флуоресцентных белков обещают расширить горизонты динамических исследований субклеточной активности, и спектральная визуализация должна оказаться очень полезным инструментом в этой области. Для дальнейшего улучшения аналитических методов спектральное изображение можно комбинировать с методами фотообесцвечивания в течение всего срока службы или акцепторного фотообесцвечивания.Кроме того, возможность проведения экспериментов FRET с использованием двух разных акцепторов (имеющих разные спектры излучения) находится в области спектральной визуализации, но ее гораздо сложнее выполнить с использованием традиционной методологии.

ДОБРО ПОЖАЛОВАТЬ В МИР

С ДОБРО ПОЖАЛОВАТЬ В ТРЕТ, ОБНОВЛЕНО НОЯБРЬ 2011

Здравствуйте, Luthiers и другие любители гитары. Вы сейчас на 13 th Fret, один из самых популярных гитарных сайтов в мире.Когда я говорю это, люди склонны не верить мне, но так получилось, что Лада, как мы ее называем, существует с 1992 года, когда его основатель Дэйв Сковрон начал вместе и собираемся связать его со всем, что существовало на тот момент. Мир. Вспомните, что вы делали 20 лет назад. Бьюсь об заклад, это не так включать ссылки на гитарные сайты полный рабочий день! Я не думаю, что проходит день, когда мы не получить хотя бы один запрос на ссылку на тот или иной гитарный сайт.

Я подчеркиваю это из-за некоторых проектов, которые мы предпринимаем, чтобы помочь мастеров и тех, кто работает в гитарной индустрии в целом.Это предполагает лучшее связывание этого сайта на сайт Ньюпортского гитарного фестиваля, который, в свою очередь, ссылается на сотни часов гитарных фотографий, рекламы и демонстраций в высоком разрешении, которые мы постоянное обновление и размещение на YouTube и в других местах, которые имеют чрезвычайное влияние на ссылки на наши сайты. Это нечто похожее на то, что мы можно только назвать вирусной ссылки. Оно невидимо, но мощно, и я мог бы добавить, непредвиденный. Некоторые производители гитар сообщили нам, что когда мы размещаем их демонстрации или баннеры через НАШИ сайты, трафик увеличивается в двадцать раз, чтобы ИХ сайты (десятки тысяч в месяц), так что мы должны что-то делать Правильно.В результате мы еще больше связываем гитарный мир. проект в подсобке здесь, что включает в себя наши постоянные усилия по добавлению новых модули к Ладе без его сбоя, на который у нас ушло несколько лет научиться делать.

            Если вы новый, или даже если вы старый посетитель Лады, я хочу также подчеркнуть архивный аспект Лады. У него самое старое живое воспоминание о гитаре. lutherie world в Интернете, включая советы, обсуждения и все вокруг слухи.Это будет становиться все более важным для всех нас, поскольку становится необходимым использовать происхождение или дополнительную информацию для доказательства происхождения древесины, материалов и методов, используемых при сертификации гитар для международный транзит. Подробнее об этом я расскажу в следующих постах. Тот самый Область, которая не имеет большого значения здесь, — это наши объявления. Объявления имеют никогда не было сильной стороной Лады, и, к сожалению, это та область, где мы все чаще подвергаются атакам со стороны хакеров и спамеров за пределами отрасли. Поэтому наслаждайтесь Fret за его связи в отрасли и его удивительные возможности. архивы, но не рассчитывайте на то, что объявления будут существовать намного дольше.

            У нас есть несколько грядут другие сюрпризы, которые вы увидите, а некоторые вы не увидите, но почувствуете, если у вас есть бизнес в гитарном мире. Он включает в себя все, от необычного возможности продвижения, некоторые возможные решения Закона Лейси и СИТЕС проблемы, преследующие нашу отрасль (в конце концов, я юрист по международной торговле обучение), так что держитесь за шляпы и следите за нами некоторое время.Вы не будете сожалеть!

Всего наилучшего, Генри Левенштейн, управляющий партнер, 13 й лад

Подписывайтесь на нас

Поиск нот на грифе: правило 5 ладов

Несмотря на то, что я всегда рекомендую студентам учиться читать ноты на гитаре, простой факт заключается в том, что многие гитаристы никогда не учатся читать, и, кроме того, чтение нот не необходимых для величия как гитариста. Я также всегда чувствовал, что игрок, который не читает, не должен быть исключен из изучения грифа музыкальным путем.Итак, я разработал различные способы обучения студентов, которые не умеют читать ноты на гитаре, музыкальному пониманию грифа.

Все хорошие игроки так или иначе разбираются в грифе в большей или меньшей степени. Вы должны, чтобы научиться импровизировать, аранжировать и так далее. Тем не менее, у многих студентов возникают проблемы с этим предметом, и часто это происходит из-за непонимания основной логики построения грифа. Я хочу дать вам это базовое понимание не только для вашей общей музыкальности, но и для того, чтобы вы могли выполнять множество упражнений и упражнений, связанных с изучением трезвучий, которые я вам дал, и тех, которым нужно следовать.

Важные факты о расположении шеи

Вот самые важные факты, которые нужно твердо усвоить:

1) Между всеми B и C на грифе всегда есть расстояние в один лад, а также между всеми E и F.

2) Все ноты открытых струн повторяются на 12-м ладу, и вы должны запомнить открытые струны.

3) Любая нота может быть взята на следующей нижней струне на 5 ладов выше по грифу, кроме струн между 2 и 3, где она на 4 ноты выше.

Вооружившись этими фактами, вы можете найти любую ноту на грифе, если знаете названия открытых струн. Вы также можете найти одну и ту же заметку в разных местах. Давайте рассмотрим несколько практических примеров.

Иллюстрация: Если вы знаете, что 3-й лад 1-й струны — соль, то вы можете сыграть ту же самую соль на следующей нижней струне, 2-й струне, используя правило 5 ладов и добавляя 5 к 3. Итак, это G также находится на 2-й струне на 8-м ладу.

Если вы знаете, что C# находится на 2-м ладу 2-й струны, то этот же C# можно сыграть на следующей нижней струне, 3-й, прибавив 4 к 2.Так вот, этот C# тоже встречается на 3-й струне, 6-м ладу.

Вот несколько фотографий, чтобы донести мысль:

Одно из золотых правил преподавания — никогда ничего не принимать за
само собой разумеющееся, поэтому я не буду предполагать, что все на самом деле знают названия всех открытых
струн на гитаре! Итак, на всякий случай, если вы не знаете или немного шатаетесь в своем понимании
, вот они:

И обратите внимание на чрезвычайно важный факт: все открытые струны повторяются на 12-м ладу.Вы должны всегда думать о грифе таким образом, когда вы тренируетесь, а не просто как об огромной пустоши, как только вы пройдете 3-й или 4-й лад. Все очень логично и упорядоченно, и не очень сложно (потому что я бы тоже не понял, если бы это было так!).

Open is 12 Правило: Как видите, ноты открытой струны повторяются на 12-м ладу. Мы используем тот факт, что открытые ноты повторяются на 12-м ладу, чтобы раскрыть тайну грифа за 12-м ладом. Мы просто рассматриваем 13-й лад и визуализируем его в уме, как если бы это был 1-й лад той же струны.Итак, когда я думаю о 13-м ладу 3-й струны, я думаю о 1-м ладу 3-й струны. Это G#. На 13 ладу будет на октаву выше, чем на первом, вот и все. (Это также сразу говорит мне, что это то же самое, что и G# на 4-м ладу 1-й струны, поскольку это следующая более высокая G#, независимо от того, где она может быть).

Если вы находитесь высоко на грифе и вам нужно найти ноту с тем же названием буквы на октаву ниже на той же струне, вы можете сделать это, вычитая 12 из более высокого лада и играя получившееся число на ладу на той же струне.Так, F# на 16-м ладу 4-й струны играется на октаву ниже на 4-м ладу 4-й струны. Затем я могу использовать правило 5 ладов и сыграть ту же октавную ноту на 5-й струне на 9-м ладу. Таким образом, я могу найти все F# на каждой струне.

Научитесь переопределять географию грифа: Когда вы изучаете любую часть грифа, скажем, первые 3 лада 1-й струны, немедленно мысленно представьте себе, что 6-й, 7-й и 8-й лады грифа 2-я строка точно такая же.Это не вопрос изучения всех ладов на грифе, это вопрос понимания взаимосвязей, а затем применения каждого кусочка информации к остальной части грифа.

Одной из уникальных особенностей гитары, которая делает ее более сложной, чем многие другие инструменты, а также более универсальной, является тот факт, что одну ноту можно сыграть в 2, 3, 4, а иногда и в 5 разных местах на грифе. . Это имеет огромное значение для всего, что мы делаем или хотим делать на гитаре.Единственные ноты, которые можно сыграть только в одном месте, — это 5 самых низких нот гитары: G#, G, F#, F и низкая ми.

Интеграционное упражнение: Если вы не можете мгновенно найти какую-либо ноту на грифе, вам нужно поработать в этой области. Например, если бы я сказал: «Сыграйте не F# на каждой струне, с 1-й по 6-ю, вы сможете это сделать, независимо от того, читаете ли вы ноты на грифе или нет».

Итак, если вы не можете этого сделать, выполняйте эти ежедневные упражнения, пока не сможете, и не волнуйтесь, если вам потребуется несколько недель или даже месяцев, чтобы начать вникать, это нормально.Просто уделяйте этому 5 минут в день, этого достаточно.

Дрель: Выберите случайную ноту из музыкального алфавита. Используя «правило 5 ладов» и правило «Open is 12», найдите его на каждой струне, начиная с первой.

Гитара со стальными струнами, 13 ладов без мензуры, длина 63 см, с синим верхом

Настоящий синий!

Для этого PT 59 наш клиент хотел синий верх. Было особенно важно, чтобы зерно все еще оставалось видимым.Такого результата мы добились с помощью традиционной морилки и тонкого слоя нитроцеллюлозного лака. Таким образом, мы отказались от покрытия тонального блеска, покрывая поверхность полиуретановым лаком, что очень часто встречается с цветными гитарами заводского изготовления.

Синяя верхняя часть, вероятно, является самой яркой особенностью этого индивидуального заказа, но есть и другие дополнения.

Подходит для предметного столика

Для частых выступлений на сцене смена струн должна быть максимально простой и удобной.Машины для настройки D’Addario Planet Waves Auto Trim автоматически обрезают лишнюю струну во время настройки. Благодаря соотношению 18:1 они обеспечивают большую точность, чем большинство стандартных тюнеров. Они также гарантируют более высокую стабильность строя даже во время самой сложной игры.

13 ладов без корпуса

Наименее бросающейся в глаза, но, пожалуй, самой необычной особенностью этой гитары со стальными струнами является переход грифа в корпус на 13-м ладу. Для этой PT 59 наш покупатель хотел типичного звучания 12-ладовой гитары, но не хотел упускать и удобство в высоких регистрах, которое предлагает гитара с переходом на 14-м ладу.Итак, мы встретились посередине и немного изменили крепление, чтобы добиться желаемого звука.

Пикап

PT 59 Custom оснащен звукоснимателем McLoud с регулятором громкости. Как и просили, мы установили ручку сбоку. Его яркий цвет палисандра хорошо сочетается с красным деревом, используемым для задней и боковых сторон. Выход расположен внизу параллельно замку безопасности.

Звук и играбельность

В зависимости от роста нашего клиента была рекомендована длина шкалы 63 см.Наряду с плоским струнным строем и шириной верхнего порожка 46 см эта гитара позволяет виртуозно и комфортно играть даже маленьким рукам. Слегка уменьшенный размер корпуса в сочетании с необычным переходом на 13-м ладу дает потрясающе приятный звук на высоких частотах, сбалансированную середину и тонкий, но выразительный басовый диапазон. Несмотря на свой размер, он обладает мощным звуком и, таким образом, обеспечивает воспроизведение сценических постановок без усиления.

лояльных пользователей Instagram беспокоятся о охвате Facebook | ABC13 Хьюстон | абв13.com

НЬЮ-ЙОРК (AP) — 11 апреля 2012 г.

Во-первых, их любимое приложение для обмена фотографиями переходит от эксклюзивности только для iPhone к массовым телефонам Android. Неделю спустя Facebook проглатывает крошечный стартап, стоящий за приложением, за 1 миллиард долларов. Покупка вызвала опасения, что Facebook может закрыть Instagram или изменить его к худшему, собирая их личную информацию или размещая рекламу в своих тщательно отобранных фотопотоках.

«Я очень старался не быть частью экосистемы Facebook», — говорит Дарвин Поблете, архитектор из Бруклина, Нью-Йорк, который использует Instagram с первых дней его существования.«Теперь я чувствую, что покупка затянула меня. Мне нужно посмотреть, как изменятся настройки конфиденциальности, чтобы решить, оставлю ли я ее».

Менее чем за два года Instagram привлек более 31 миллиона пользователей. Его почти культовыми первыми последователями были лояльные пользователи iPhone, которые стекались в приложение из-за его простоты использования, его игривых фильтров, которые могут сделать даже скучные фотографии художественными, а также отсутствия рекламы, обновлений статуса и других помех. В 2011 году Apple назвала Instagram приложением года для iPhone.

Справедливости ради стоит отметить, что и генеральный директор Facebook Марк Цукерберг, и генеральный директор Instagram Кевин Систорм стремились убедить людей в том, что приложение никуда не денется. По словам руководителей, в отличие от всех других стартапов, купленных Facebook, Instagram останется доступным для людей, которые не используют Facebook или не хотят подключать его к своим учетным записям в самой густонаселенной социальной сети в мире.

«Миллионы людей во всем мире любят приложение Instagram и бренд, связанный с ним, и наша цель — помочь распространить это приложение и бренд среди еще большего числа людей», — написал Цукерберг на своей странице в Facebook, объявив о покупке в понедельник.

Однако трудно сказать, что Facebook может сделать через год или два. В конце концов, постоянная эволюция его сайта была большой причиной его успеха. Делать что-то по-старому только потому, что несколько пользователей жалуются, — это не путь Facebook.

Для Саманты Хатмахер перемены — это не обязательно плохо. Студентка колледжа, которая использует и Facebook, и — с прошлой недели — Instagram, говорит, что если Facebook доработает приложение, «я полагаю, оно станет более креативным».

В то время как многие люди жалуются, когда Facebook вносит изменения на свой сайт, Хатмахер говорит, что она «не может точно определить время», когда она хотела, чтобы на ее странице Facebook не было новых функций, которые компания добавляла на протяжении многих лет.

«Это как бы прирастает к вам», — говорит Хатмахер, изучающий начальное школьное образование в Университете Миссури в Колумбии, штат Миссури.

Instagram уже немного похож на Facebook, но без всего этого шума обновлений статуса, ссылок, рекламы, видео и игр. Это часть его привлекательности и большая часть того, почему Facebook увидел в нем такую ​​большую угрозу, что заплатил 1 миллиард долларов, чтобы купить его.

«Они растут как сумасшедшие на мобильных устройствах, а мобильная платформа Facebook (включая ее приложение) в лучшем случае посредственна», — написал технический блогер Ом Малик во вторник на GigaOm.«Facebook не ориентирована на мобильные устройства, и они не думают с точки зрения мобильных устройств. Внутренняя идеология Facebook — это идеология интернет-компании, ориентированной на настольные компьютеры».

Instagram — это социальная сеть только для фотографий, но даже они разные. Кажется, что пользователи больше думают и заботятся о фотографии в Instagram, чем о типичном снимке на Facebook. Это не групповые снимки с вашей вечеринки, помеченные именами всех присутствующих, и не бесконечно перепостованные фотографии котят с прикрепленными к ним забавными цитатами.Вместо этого пользователи чаще делятся, скажем, фотографией чашки чая с примененным к ней фильтром, так что она выглядит так, как будто она была сделана на пленочную камеру 30 лет назад. Дети тоже популярны, как и тюльпаны и пасхальные яйца, когда они в сезон.

Деб Джонсон из Лонг-Бич, Калифорния, любит публиковать фотографии своих собак, двух родезийских риджбеков. Она также публикует снимки еды, которую ест, совсем недавно блюдо из шотландского лосося, которое она ела в ресторане. По ее словам, чтобы оценить Instagram, «вы действительно должны ценить визуальный опыт.»

«Сегодня я сфотографировал какую-то глупость», — говорит Джонсон, работающий в области информационных технологий и тестирующий системы для страховых компаний. Кто-то в ее доме поместил маленький дозатор Cookie Monster Pez внутрь большего дозатора Cookie Monster Pez, сделав своего рода дозатор-дозатор Pez. Итак, Джонсон сделал фото. Instagram настолько прост в использовании, что именно эти типы изображений появляются. Чтобы поделиться изображением в Instagram, достаточно трех касаний пальца.

«Существуют сотни тысяч приложений.Приложения — это не вопрос «создайте их, и они появятся», — говорит Ребекка Либ, аналитик Altimeter Group. «Цена указывает на то, что у Instagram были и другие поклонники».

Другими словами, Facebook не просто купил какую-либо компанию.

«Если бы кто-то мог разлить по бутылкам свой рецепт успеха, я гарантирую, что он бы это сделал. Он прост в использовании, работает очень хорошо и добавляет дополнительный уровень функциональности (с фильтрами)», — говорит Либ. «Все это в совокупности создает моджо, которым является бренд.Почему не каждый безалкогольный напиток Coca-Cola? Потому что это не так.»

Немедленный успех Instagram напоминает другое элегантное, простое в использовании приложение, которое быстро завоевало множество пользователей — Pinterest. Обе компании используют желание людей делиться маленькими жизненными моментами, когда они случаются. И оба предоставляют пользователям социальную сеть, более простую и менее шумную, чем Facebook.

«Существует множество интересных социальных сетей, — говорит аналитик Gartner Брайан Блау. «И это конкуренты Facebook.Один вокруг фотографий, (это) одна из самых популярных вещей, которые мы делаем. Это идеальное дополнение к Facebook.»

Задача Facebook будет заключаться в том, чтобы лояльные пользователи Instagram оставались довольными, даже если сервис расширяется и включает в себя гораздо больше людей.

«Мы видели, как это случалось раньше, когда Facebook открыл свою членскую базу из (студентов колледжа) для всех», — говорит Либ.

В то время люди ворчали, что это конец Facebook. Это не так.

«Людям не нравятся изменения, но поведение пользователей показывает, что люди примут изменения», — говорит она.

Copyright © 2022 КТРК-ТВ. Все права защищены.

ДНК-конструкции Cy3/Cy5 с внутренней меткой демонстрируют значительно повышенную фотостабильность в экспериментах FRET с одной молекулой

. 2014 май; 42(9):5967-77. doi: 10.1093/нар/гку199. Epub 2014 13 марта.

Принадлежности Расширять

Принадлежности

  • 1 Орегонский центр оптики и химический факультет Орегонского университета, Юджин, штат Орегон 97403, США Институт молекулярной биологии и химический факультет Орегонского университета, Юджин, штат Орегон 97403, США.
  • 2 Институт молекулярной биологии и кафедра химии Орегонского университета, Юджин, штат Орегон, 97403, США [email protected]
  • 3 Орегонский центр оптики и химический факультет Орегонского университета, Юджин, штат Орегон 97403, США Институт молекулярной биологии и химический факультет Орегонского университета, Юджин, штат Орегон 97403, США [email protected]
Бесплатная статья ЧВК

Элемент в буфере обмена

Вонбэ Ли и др.Нуклеиновые Кислоты Res. 2014 май.

Бесплатная статья ЧВК Показать детали Показать варианты

Показать варианты

Формат АннотацияPubMedPMID

.2014 май; 42(9):5967-77. doi: 10.1093/нар/гку199. Epub 2014 13 марта.

Принадлежности

  • 1 Орегонский центр оптики и химический факультет Орегонского университета, Юджин, штат Орегон 97403, США Институт молекулярной биологии и химический факультет Орегонского университета, Юджин, штат Орегон 97403, США.
  • 2 Институт молекулярной биологии и кафедра химии Орегонского университета, Юджин, штат Орегон, 97403, США [email protected]
  • 3 Орегонский центр оптики и химический факультет Орегонского университета, Юджин, штат Орегон 97403, США Институт молекулярной биологии и химический факультет Орегонского университета, Юджин, штат Орегон 97403, США [email protected]

Элемент в буфере обмена

Полнотекстовые ссылки Параметры отображения цитирования

Показать варианты

Формат АннотацияPubMedPMID

Абстрактный

ДНК-конструкции, меченные цианиновыми флуоресцентными красителями, являются важными субстратами для одномолекулярных (см) исследований функциональной активности комплексов белок-ДНК.Ранее мы изучили флуктуации локального остова ДНК конструкций репликационной вилки и ДНК-матрицы праймеров, меченных донорно-акцепторными парами хромофоров Cy3/Cy5 с резонансным переносом энергии Фёрстера (FRET), и показали, что, в отличие от красителей, связанных «внешне» с основаниями с гибкими Привязи, прямая «внутренняя» (и жесткая) вставка хромофоров в сахаро-фосфатные остовы привела к конструкциям ДНК, которые можно было использовать для изучения внутренних и вызванных белком флуктуаций остова ДНК как с помощью smFRET, так и sm флуоресцентного линейного дихроизма (smFLD).Здесь мы показываем, что эти жестко вставленные хромофоры Cy3/Cy5 также обладают двумя дополнительными полезными свойствами, демонстрируя как высокую фотостабильность, так и минимальное влияние на локальную термодинамическую стабильность конструкций ДНК. Повышенная фотостабильность внутренних меток значительно снижает долю ложноположительных «фоновых» сигналов преобразования smFRET, тем самым упрощая интерпретацию как экспериментов smFRET, так и smFLD, в то время как уменьшенное влияние внутренних зондов на локальную термодинамическую стабильность также приводит к флуктуациям, обнаруживаемым с помощью эти зонды более репрезентативны для ненарушенной структуры ДНК.Мы предполагаем, что маркировка внутреннего зонда может быть полезна при изучении многих систем ДНК-белкового взаимодействия.

© Автор(ы), 2014. Опубликовано Oxford University Press от имени Nucleic Acids Research.

Цифры

Рисунок 1.

Используемые ДНК-конструкции, меченные Cy3/Cy5…

Рисунок 1.

ДНК-конструкции, меченные Cy3/Cy5, используемые в этих исследованиях. ( A ) Cy3…

Фигура 1.

ДНК-конструкции, меченные Cy3/Cy5, используемые в этих исследованиях.( A ) Хромофоры Cy3 и Cy5 присоединены к тиминовым основаниям на противоположных цепях с помощью гибкого линкера из 16 атомов. Поскольку хромофоры расположены снаружи дуплекса ДНК, субстрат обозначается как ДНК, меченная дуплексом eCy3/eCy5. ( B ) Хромофоры Cy3 и Cy5 жестко включены в основу сахаро-фосфатной ДНК с использованием фосфорамидитной химии. Субстрат с внутренней меткой обозначается как «ДНК с дуплексной меткой iCy3/iCy5». ( C ) В этой ДНК-конструкции праймер/матрица (p/t) хромофор Cy3 присоединен к 3′-концу цепи праймера, а хромофор Cy5 расположен внутри матричной цепи рядом с соединением p/t .Этот субстрат обозначается как «меченая ДНК endCy3/iCy5 p/t». ( D ) Хромофоры Cy3 и Cy5 расположены внутри на стыке одноцепочечной и двухцепочечной вилки репликации ДНК. Субстрат обозначается как «меченная вилкой iCy3/iCy5» ДНК.

Рисунок 2.

Эффект «внутреннего» против…

Рис. 2.

Влияние «внутренней» и «внешней» маркировки Cy3/Cy5 на спектры КД…

Фигура 2.

Влияние «внутреннего» по сравнению с «внешним» мечением Cy3/Cy5 на спектры CD полностью отожженных конструкций вилки репликации ДНК и составляющих цепей одноцепочечной ДНК. ( A ) Дуплексная ДНК-конструкция, меченная iCy3/iCy5, демонстрирует большой сигнал CD вблизи максимума поглощения зонда (красная кривая), что указывает на то, что хромофоры жестко закреплены внутри дуплексного сахаро-фосфатного остова.Напротив, не наблюдалось значительного сигнала CD для отдельных цепей одноцепочечной ДНК, меченных iCy3 и iCy5 (зеленая и синяя кривые соответственно), а также для полностью отожженных конструкций дуплексной ДНК, меченных eCy3 и eCy5 (желтая кривая). Все конструкции измеряли при концентрации молекул ДНК 5 мкМ. ( B ) Спектры КД внутренне и внешне меченных конструкций Су3/Су5-дцДНК при λ < 300 нм и концентрациях 1 мкМ показывают, что пары оснований дуплексных частей конструкций ДНК остаются полностью сложенными в присутствии либо внутренние или внешние зонды красителя Cy3/Cy5, и что присутствие зонда любого типа существенно не нарушает общую конформацию B-формы дуплексных областей.

Рисунок 3.

Количество обнаруженных Cy3/Cy5…

Рисунок 3.

Количество обнаруженных пар хромофоров Cy3/Cy5 FRET в фиксированной области изображения…

Рисунок 3.

Количество обнаруженных пар хромофоров Cy3/Cy5 FRET в пределах фиксированной области изображения в зависимости от времени непрерывного освещения образца. ( A ) Мощность лазера была установлена ​​на ~ 22 мВт. Каждая из четырех конструкций ДНК демонстрировала экспоненциальную фотодеградацию, зависящую от времени, со временем жизни τ B , которое зависит от положения сайта встраивания хромофора и химического состава. Обратите внимание, что различные субстраты обозначены схематично. ( B ) Результаты для конструкции ДНК, меченной дуплексом iCy3/iCy5, показаны в зависимости от мощности лазерного возбуждения.

Рисунок 4.

Примеры траекторий smFRET для…

Рисунок 4.

Образцы траекторий smFRET для ДНК-конструкции, меченной дуплексом eCy3/eCy5.Траектории записаны…

Рисунок 4.

Образцы траекторий smFRET для ДНК-конструкции, меченной дуплексом eCy3/eCy5. Траектории записывались с интервалом ~120 с. Траектория, показанная на верхней панели, демонстрирует «обратимое» преобразование FRET на отметке 13 с. Позже по той же траектории происходит «необратимое» преобразование, связанное с фотообесцвечиванием хромофоров Су3 и Су5.На средней и нижней панелях показаны примеры траекторий, которые демонстрируют наиболее часто наблюдаемые события фотообесцвечивания.

Рисунок 5.

Одномолекулярные (sm) события конверсии FRET…

Рисунок 5.

Одномолекулярные (sm) события конверсии FRET, наблюдаемые для четырех исследованных ДНК-субстратов. (…

Рисунок 5.

Одномолекулярные (sm) события конверсии FRET, наблюдаемые для четырех исследованных ДНК-субстратов. ( A ) События преобразования smFRET были классифицированы как (обратимые) колебания сахаро-фосфатного остова ДНК или как (необратимое) фотообесцвечивание цианиновых хромофоров.Для каждого из четырех субстратов указан процент каждого типа процесса. ( B ) Процент обратимых событий преобразования smFRET, связанных с флуктуациями скелета ДНК, показан отдельно для каждого из исследованных ДНК-субстратов [те же данные, что и на панели (A)].

Рисунок 6.

Флуоресцентные изображения Cy5…

Рис. 6.

Флуоресцентные изображения области обнаружения Cy5 для конструкций ДНК, меченных дуплексом iCy3/iCy5…

Рисунок 6.

Флуоресцентные изображения области обнаружения Cy5 для конструкций ДНК, меченных дуплексом iCy3/iCy5, и репрезентативные траектории Cy3 и Cy5 sm. ( A ) Флуоресцентные изображения области обнаружения Cy5 для конструкций ДНК, меченных дуплексом iCy3/iCy5. Изображения были получены с 20-минутными интервалами при непрерывном лазерном возбуждении (около 10 мВт, см. Дополнительный рисунок S8).( B ) Репрезентативные траектории Cy3 и Cy5 sm, записанные с ДНК-конструкций, меченных дуплексом iCy3 / iCy5, в течение 30-секундного интервала после ~ 60 минут лазерного возбуждения (~ 10 мВт). После ∼60 минут непрерывного лазерного возбуждения ∼33% пар FRET оставались стабильными и не мигали для обеих пар FRET донор-акцептор Cy3/Cy5 (как показано на панелях 1, 2 и 3). Нечастое появление событий фотообесцвечивания Cy3 и Cy5 также можно было наблюдать в течение того же периода сбора данных (как показано на панелях 4 и 5).

Рисунок 7.

Гипотетические поверхности электронной потенциальной энергии…

Рисунок 7.

Гипотетические электронные поверхности потенциальной энергии показаны как функция координаты…

Рисунок 7.

Гипотетические поверхности потенциальной электронной энергии показаны как функция координаты θ , которая определяет вращение связи C–C внутри полиметиновой цепи цианинового хромофора. Поверхность основного состояния помечена как S 0 , возбужденное синглетное состояние помечено как S 1 , а возбужденное триплетное состояние помечено как T 1 . Поглощение транс-конформацией ( θ = 0°) создает колебательно-возбужденное состояние в S 1 , которое может подвергаться эффективной колебательной релаксации (VR) с последующим IC или флуоресценцией.В качестве альтернативы молекула может подвергаться колебательно-активируемой фотоизомеризации с образованием более стабильного «скрученного промежуточного соединения» ( θ = 90°), которое может разветвляться с образованием заселенности основного состояния как в цис ( θ = 180°), так и в транс конформации. Интерсистемному скрещиванию (ISC) в триплетное состояние T 1 способствует образование скрученного интермедиата. Скрученное состояние T 1 является первичным промежуточным продуктом, через который происходит фотодеградация цианинового хромофора.

Все фигурки (7)

Похожие статьи

  • Одномолекулярные исследования FRET и линейного дихроизма дыхания ДНК и связывания геликазы в местах соединения вилок репликации.

    Фелпс С., Ли В., Хосе Д., фон Хиппель П.Х., Маркус А.Х. Фелпс С. и др.Proc Natl Acad Sci USA. 2013 Oct 22;110(43):17320-5. doi: 10.1073/pnas.1314862110. Epub 2013 23 сентября. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013. PMID: 24062430 Бесплатная статья ЧВК.

  • Время жизни фотообесцвечивания цианиновых флуорофоров, используемых для одномолекулярного резонансного переноса энергии Фёрстера в присутствии различных систем фотозащиты.

    Купер Д., Ум Х., Таузин Л.Дж., Поддар Н., Ландес С.Ф.Купер Д. и соавт. Химбиохим. 2013 17 июня; 14 (9): 1075-80. doi: 10.1002/cbic.201300030. Epub 2013 3 июня. Химбиохим. 2013. PMID: 23733413 Бесплатная статья ЧВК.

  • Измерение локальных конформаций и конформационного беспорядка (Cy3) 2 димеров, меченных вилочными соединениями ДНК, с использованием поглощения, кругового дихроизма и двумерной флуоресцентной спектроскопии.

    Хойсман Д., Киттелл Дж., Крингл Л., Тамими А., фон Хиппель П.Х., Маркус А.Х.Хьюсман Д. и др. Фарадей Обсудить. 2019 11 июля; 216 (0): 211-235. дои: 10.1039/c8fd00245b. Фарадей Обсудить. 2019. PMID: 31038134 Бесплатная статья ЧВК.

  • Резонансный перенос энергии флуоресценции (FRET) и конкурирующие процессы в донорно-акцепторных замещенных цепях ДНК: сравнительное исследование ансамблевых и одномолекулярных данных.

    Дитрих А., Бушманн В., Мюллер С., Зауэр М.Дитрих А. и др. Дж Биотехнолог. 2002 г., январь; 82 (3): 211–31. doi: 10.1016/s1389-0352(01)00039-3. Дж Биотехнолог. 2002. PMID: 11999691 Рассмотрение.

  • Каскад Excimer-FRET в двойных ДНК-зондах: открытый доступ к большому стоксову сдвигу, расширенному акцепторному освещению и надежному обнаружению РНК.

    Апарин И.О., Сергеева О.В., Мишин А.С., Хайдуков Е.В., Коршун В.А., Зацепин Т.С. Апарин И.О. и соавт.Анальная хим. 2020 19 мая; 92 (10): 7028-7036. doi: 10.1021/acs.analchem.0c00270. Epub 2020 5 мая. Анальная хим. 2020. PMID: 32314568

Цитируется

15 статьи
  • Влияние гидрофобности на экситонное связывание в ДНК-шаблонных агрегатах индоленинсквараинового красителя.

    Масс О.А., Уилсон К.К., Барсенас Г., Терпецниг Э.А., Обухова О.М., Колосова О.С., Татарец А.Л., Ли Л., Юрке Б., Ноултон В.Б., Пенсак Р.Д., Ли Дж. Массовый ОА и др. Интерфейсы J Phys Chem C Nanomater. 2022 24 февраля; 126 (7): 3475-3488. doi: 10.1021/acs.jpcc.1c08981. Epub 2022 10 февраля. Интерфейсы J Phys Chem C Nanomater. 2022. PMID: 35242270 Бесплатная статья ЧВК.

  • Точное моделирование экситонной связи в цианиновом красителе Cy3.

    Сорур М.И., Кистлер К.А., Маркус А.Х., Мацика С. Сорур М.И. и соавт. J Phys Chem A. 16 сентября 2021 г.; 125 (36): 7852-7866. doi: 10.1021/acs.jpca.1c05556. Epub 2021 8 сентября. J Phys Chem A. 2021. PMID: 34494437

  • Реализация усиления флуоресценции, тушения и FRET для исследования ферментативной реакции эндонуклеазы 1 лоскута на уровне одной молекулы.

    Собхи М.А., Техсин М., Такахаши М., Бралич А., Де Биасио А., Хамдан С.М.Собхи М.А. и соавт. Comput Struct Biotechnol J. 27 июля 2021 г .; 19: 4456-4471. doi: 10.1016/j.csbj.2021.07.029. Электронная коллекция 2021. Comput Struct Biotechnol J. 2021. PMID: 34471492 Бесплатная статья ЧВК. Рассмотрение.

  • Флуорогенные аптамеры устраняют гибкость соединений РНК, используя FRET, зависящий от ориентации.

    Jeng SCY, Trachman RJ 3rd, Weissenboeck F, Truong L, Link KA, Jepsen MDE, Knutson JR, Andersen ES, Ferré-D’Amaré AR, Unrau PJ.Jeng SCY и др. РНК. 2021 апр; 27 (4): 433-444. doi: 10.1261/РНК.078220.120. Epub 2020 29 декабря. РНК. 2021. PMID: 33376189 Бесплатная статья ЧВК.

  • Полимераза μ в негомологичном соединении концов ДНК: важность порядка прибытия к двухцепочечному разрыву в очищенной системе.

    Чжао Б., Ватанабэ Г., Либер М.Р. Чжао Б. и др. Нуклеиновые Кислоты Res. 2020 17 апреля; 48 (7): 3605-3618.doi: 10.1093/nar/gkaa094. Нуклеиновые Кислоты Res. 2020. PMID: 32052035 Бесплатная статья ЧВК.

Рекомендации

    1. Ха Т., Козлов А.Г., Лохман Т.М. Одномолекулярные взгляды на движение белка по одноцепочечной ДНК. Анну. Преподобный Биофиз. 2012; 41: 295–319. — ЧВК — пабмед
    1. Селвин П.Р., Ха Т. Одномолекулярные методы: лабораторное руководство. Колд-Спринг-Харбор, Нью-Йорк: Лабораторное издательство Колд-Спринг-Харбор; 2008.
    1. Рой Р., Хонг С., Ха Т. Практическое руководство по одномолекулярному FRET. Нац. Методы. 2008; 5: 507–516. — ЧВК — пабмед
    1. Мён С., Бруно М.М., Пайл А.М., Ха Т. Пружинный механизм раскручивания ДНК геликазой NS3 вируса гепатита С. Наука. 2007; 317: 513–516. — ЧВК — пабмед
    1. Йод Дж.G., Stevens BC, Kanagaraj R., Janscak P., Ha T. Хеликаза BLM измеряет раскручивание ДНК перед переключением цепей, а hRPA способствует повторной инициации раскручивания. EMBO J. 2009; 28: 405–416. — ЧВК — пабмед

Показать все 37 ссылок

Типы публикаций

  • Поддержка исследований, Н.И.Х., заочная
  • Поддержка исследований, правительство США, не-PHS

термины MeSH

  • Карбоцианины / химия*
  • Флуоресцентная резонансная передача энергии
  • Флуоресцентные красители / химия*

LinkOut — больше ресурсов

  • Полнотекстовые источники

  • Прочие литературные источники

[Икс]

Укажите

Копировать

Формат: ААД АПА МДА НЛМ

.

Leave a Reply

Ваш адрес email не будет опубликован.

2019 © Все права защищены.