И он выложил в блоге изображение этой аварии — это его Mercedes. Справа Лада Самара, в которую он врезался.

Недавно исчезла одна Лада.

Где ж ты, милый мой, лада моя.

И вы пытаетесь продать мне Лада.

А без бороды не лада.

Мензура — это расстояние от верхнего порожка до центра 12 лада.

Лада Нива, дизельная.

Женская футбольная команда «Лада» добилась куда больших успехов.

На Московской биеннале дизайна показали развитие стиля LADA

Стив Маттин, занимающий на АВТОВАЗе пост директора по дизайну, накануне Биеннале рассказал на примере трех автомобилей ЛАДА нового поколения о развитии стиля LADA. В качестве примера он взял уже выпускающийся седан LADA Vesta, новую модификацию модели, которая встанет на конвейер во второй половине этого года, – универсал LADA Vesta Cross, а также концепт-кар LADA XCODE.

Сейчас, как отметил Маттин, фирменной ДНК стиля автомобилей LADA является так называемая «Икс»-графика, который воплощается в эмоциональном и контрастном дизайне. Причем он вызвал серию плагиата среди иностранных автобрендов и уже реально присутствует на нескольких десятках тысяч машин российского производителя.

Седан Лада Веста стал первым представителем LADA, выпускающимся серийно и имеющим новую концепцию стиля. Эта модель в настоящее время на российском рынке регулярно входит в пятерку самых продающихся моделей. Тем самым косвенно подтверждается, что АВТОВАЗ выбрал правильную стратегию дизайна, которая уже стала успешной. Семейство автомобилей LADA Vesta в нынешнем году пополнится еще универсалом. Этот автомобиль на дизайнерском мероприятии демонстрируют в версии с приставкой «Кросс». Отличительными особенностями указанной версии универсала являются оригинальный обвес, а также более высокий дорожный просвет. Подобные модификации есть в наличии и у иных семейств автомобилей LADA. Речь идет о «кроссовых» версиях универсалов Калина и Ларгус.

Наиболее близкую перспективу развития фирменного стиля LADA показывает универсал Лада Веста Кросс (Vesta Cross). Вместе с тем в более отдаленное будущее окунуться посетителям мероприятия поможет перспективный кроссовер LADA XCODE. На указанном концепт-каре, впервые показанном на ММАС-2016, фирменная ДНК стиля стала еще более контрастной, выразительной и эмоциональной.

В рамках Биеннале также будут представлены проекты студентов. К примеру, Московский политех проведет презентацию студенческого проекта под названием «LADA_2050 — Видение мобильности будущего». Этот проект студенты политеха разрабатывали под руководством представителей студии дизайна LADA, базирующейся в Москве.

Фильтр масляный LADA Largus, Renault Logan Невский фильтр NF-1018 — цена, отзывы, характеристики, фото

Фильтр масляный LADA Largus, Renault Logan Невский фильтр NF-1018 очищает масло от продуктов износа трущихся деталей. Обеспечивает безопасную работу двигателя и его долгий срок службы. Важно вовремя менять фильтр, в соответствии с графиком сервисного обслуживания. Фильтр изготовлен из целлюлозных и синтетических волокон, что гарантирует максимальную очистку масла.  Фильтр масляный Невский фильтр NF-1018 подходит к автомобилям ALFA ROMEO 156 (932), ALFA ROMEO 156 Sportwagon (932), ALFA ROMEO AR 6 Box (280), ALFA ROMEO GT (937), ARO 10, DACIA DUSTER, DACIA LOGAN (LS_), DACIA LOGAN EXPRESS (FS_), DACIA LOGAN MCV (KS_), DACIA LOGAN Pickup (US_), DACIA SANDERO, DACIA SOLENZA, DACIA SUPERNOVA, JEEP WRANGLER   (YJ, SJ_), LADA Largus, LADA Vesta, MITSUBISHI CARISMA (DA_), MITSUBISHI CARISMA Saloon (DA_), MITSUBISHI SPACE STAR (DG_A), NISSAN Almera (Avtovaz), NISSAN Almera II, NISSAN ALMERA Mk II (N16), NISSAN ALMERA Mk II (N16), NISSAN DUALIS (J10, JJ10), NISSAN INTERSTAR Box (X70), NISSAN INTERSTAR Bus (X70), NISSAN KUBISTAR (X76), NISSAN KUBISTAR Box (X80), NISSAN MARCH III (K12), NISSAN NOTE (E11), NISSAN PRIMASTAR Box (X83), NISSAN PRIMASTAR Van (X83), NISSAN PRIMERA (P12), NISSAN PRIMERA Hatchback (P12), NISSAN PRIMERA Traveller (WP12), NISSAN Qashqai (+2), NISSAN Tiida I (II),  OPEL ARENA Box (TB, TF), OPEL ARENA Combi (THB), OPEL MOVANO Box (F9), OPEL MOVANO Combi (J9), OPEL VIVARO Box (F7), OPEL VIVARO Combi (J7), OPEL VIVARO Platform/Chassis (E7), RENAULT 11 Box (S37_), RENAULT 18 Box, RENAULT 18 Break (135_), RENAULT 18 Saloon (134_), RENAULT 19 Mk II (B/C53_),  RENAULT 19 Mk II Box (S53_), RENAULT 19 Mk II Convertible (D53_, 853_), RENAULT 19 Mk II Saloon (L53_), RENAULT 19   (B/C53_), RENAULT 19   Box (S53_), RENAULT 19   Convertible (D53_), RENAULT 19   Saloon (L53_), RENAULT 20 (127_), RENAULT 21 (B48_), RENAULT 21 Box (S48_), RENAULT 21 Saloon (L48_), RENAULT 21 Savanna (K48_), RENAULT 4 Box (R21_, R23_), RENAULT 4 Estate (112_), RENAULT 5 Box (238_), RENAULT ALLIANCE (L42_), RENAULT AVANTIME (DE0_), RENAULT CLIO II Box (SB0/1/2_), RENAULT CLIO Mk II (BB0/1/2_, CB0/1/2_), RENAULT CLIO   (B/C57_, 5/357_), RENAULT CLIO   Box (S57_), RENAULT Duster, RENAULT ENCORE (B/C37_), RENAULT ESPACE Mk II (J/S63_), RENAULT ESPACE Mk III (JE0_), RENAULT ESPACE Mk IV (JK0/1_), RENAULT ESPACE   (J11_), RENAULT EURO CLIO III (BR0/1, CR0/1), RENAULT EXTRA Box (F40_, G40_), RENAULT Fluence, RENAULT FUEGO (136_), RENAULT GRAN TOUR III Estate (KZ0/1), RENAULT GRAND SCENIC II (JM0/1_), RENAULT GRAND SCENIC III (JZ0/1_), RENAULT KANGOO (KC0/1_), RENAULT KANGOO / GRAND KANGOO (KW0/1_), RENAULT KANGOO BE BOP (KW0/1_), RENAULT KANGOO Express (FW0/1_), RENAULT KANGOO Rapid (FC0/1_), RENAULT Kaptur, RENAULT LAGUNA Coupe (DT0/1), RENAULT LAGUNA I Estate (K56_), RENAULT LAGUNA I I (B56_, 556_), RENAULT LAGUNA II (BG0/1_), RENAULT LAGUNA II Sport Tourer (KG0/1_), RENAULT LAGUNA III (BT0/1), RENAULT LAGUNA III Sportour (KT0/1), RENAULT LE CAR (122_), RENAULT Logan, RENAULT Logan II, RENAULT MASTER II Bus (JD), RENAULT MASTER II Van (FD), RENAULT MEGANE CC (EZ0/1_), RENAULT MEGANE I (BA0/1_), RENAULT MEGANE I Break (KA0/1_), RENAULT MEGANE I Cabriolet (EA0/1_), RENAULT MEGANE I Classic (LA0/1_), RENAULT MEGANE I Coupe (DA0/1_), RENAULT MEGANE II (BM0/1_, CM0/1_), RENAULT MEGANE II Coupe-Cabriolet (EM0/1_), RENAULT MEGANE II Saloon (LM0/1_), RENAULT MEGANE II Sport Tourer (KM0/1_), RENAULT MEGANE III Coupe (DZ0/1_), RENAULT MEGANE III Hatchback (BZ0_), RENAULT MEGANE Scenic (JA0/1_), RENAULT MODUS / GRAND MODUS (F/JP0_), RENAULT Sandero, RENAULT Sandero II, RENAULT SCENIC I (JA0/1_), RENAULT SCENIC II (JM0/1_), RENAULT SCENIC III (JZ0/1_), RENAULT SUPER 5 (B/C40_), RENAULT SUPER 5 Box (S40_), RENAULT SYMBOL I (LB0/1/2_), RENAULT TONDAR 90 (LS_), RENAULT TONDAR 90 Estate (KS_), RENAULT TRAFIC Bus (T5, T6, T7), RENAULT TRAFIC Bus (TXW), RENAULT TRAFIC II Bus (JL), RENAULT TRAFIC II Platform/Chassis (EL), RENAULT TRAFIC II Van (FL), RENAULT TRAFIC Platform/Chassis (P6), RENAULT TRAFIC Platform/Chassis (PXX), RENAULT TRAFIC Van (T1, T3, T4), RENAULT TRAFIC Van (TXX), RENAULT TWINGO I (C06_), RENAULT TWINGO I Van (S06_), RENAULT TWINGO II (CN0_), RENAULT VEL SATIS (BJ0_), RENAULT WIND (E4M_),  SUZUKI JIMNY (FJ), SUZUKI JIMNY (SJ), VAUXHALL ARENA Combi, VAUXHALL ARENA Van, VAUXHALL MOVANO Mk I (A) Combi (JD), VAUXHALL MOVANO Mk I (A) Van (FD), VAUXHALL VIVARO Box (F7), VAUXHALL VIVARO Combi (J7) VOLVO 340-360 (343, 345), VOLVO 340-360 Saloon (344)   org/PropertyValue»> Внешний диаметр, мм 76 Высота, мм 50 Перепускной клапан да Противодренажный клапан да для Nissan да для ВАЗ нет для Ford нет для Chevrolet нет для Opel да org/PropertyValue»> для Skoda нет для Audi нет для Peugeot нет для Mitsubishi да для Volvo да для Subaru нет для Citroen нет для Fiat нет для Volkswagen нет org/PropertyValue»> для Chrysler нет для Москвич нет для Suzuki да для ЗАЗ нет для DAF нет для Jeep нет для Daewoo нет Для ГАЗ нет Для LADA да org/PropertyValue»> для Renault да Для УАЗ нет Для КАМАЗ нет Для HYUNDAI нет Показать ещё Параметры упакованного товара Единица товара: Штука Вес, кг: 0,20 Длина, мм: 76 Ширина, мм: 71 Высота, мм: 50 Преимущества Подходят для тяжелых условий эксплуатации Центральная стальная трубка для лучшей жесткости Подходит для всех типов масел Большая площадь фильтрующей части Уплотнительное кольцо не деформируется под воздействием масла и бензина Изготовлен из безопасных материалов, которые не выделяют в масло составляющих компонентов Оснащен оцинкованной крышкой Прошел испытания в НАМИ Произведено Россия — родина бренда Россия — страна производства* * Производитель оставляет за собой право без уведомления дилера менять характеристики, внешний вид, комплектацию товара и место его производства. Указанная информация не является публичной офертой Отзывы о фильтре Невский фильтр NF-1018 Оставить свой отзыв На данный момент для этого товара нет расходных материалов Сервис от ВсеИнструменты.ру Мы предлагаем уникальный сервис по обмену, возврату и ремонту товара! Вернем вам деньги, если данный товар вышел из строя в течение 14 дней с момента покупки. Обратиться по обмену, возврату или сдать инструмент в ремонт вы можете в любом магазине или ПВЗ ВсеИнструменты.ру.

Может понадобиться

Автовыходные с LADA: Гатчина — запись в блоге Прагматика

Гатчина – это прекрасный пример исторического городка «при мегаполисе», в котором гармонично объединены культурные и природные достопримечательности.

Большинство туристов знает Гатчину по экскурсиям в Гатчинский дворец с парком, а также в Приоратский замок. Но хочется увидеть этот колоритный городок с другой, не массово-туристической стороны, поэтому давайте прогуляемся по малоизвестным достопримечательностям Гатчины.

Совет на все случаи жизни: приезжая в небольшую провинцию постарайтесь схематично разделить город по «скоплению» достопримечательностей, а дальше – просто гуляйте! По узким улочкам, небольшим проспектам и переулкам, и наслаждайтесь архитектурой встретившихся древних построек, неожиданно «вынырнувших» после поворота не отмеченных на карте памятников и просто нетипичной атмосферой города. Поверьте, вы получите намного больше удовольствия, чем пытаясь пробраться сквозь толпу к затертой до дыр «звезде» всех путеводителей.

Улицы Гатчины – не исключение. Пройдитесь по главному проспекту города, сверните на любой понравившейся улице, и полюбуйтесь на сказочные деревянные домики, окрашенные в яркие цвета.

Можно, например, дойти до Покровского или Павловского Соборов, восхищающих своим величием и убранством. Найдите на карте Усадьбу Шербова – интересное здание в стиле модерн, в котором долгое время жил художник карикатурист. Однозначно, ничего подобного вы еще не видели.

Если ваше автопутешествие в Гатчину случилось зимой, загляните в Дворцовый парк – в снегах и сугробах в парке особенно романтично.

Еще одно необычное место в Гатчине – домик няни А.С. Пушкина. Это единственный в мире музей, созданный в память о крепостной женщине, расположенный в деревянном доме 200-летней давности. Во время реставраций в нем заменили только крышу и пол. Экспонаты музея воспроизводят быть крестьян, живших в XVIII веке. Здесь можно увидеть скалку и рубель, прялки, иконы, подвесную детскую люльку. Там же бережно хранится реликвия, принадлежащая непосредственно любимой няне великого поэта — сумка-торба из домотканого полотна.

Во время неспешной прогулки по городу не забудьте зайти в уютное кафе на чашечку кофе и приобрести пару милых местных сувениров на память.

Поделиться в соцсетях:

Введение в технологию флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET) и ее применение в биологических науках

Автор : Пол Хелд, доктор философии, отдел приложений, BioTek Instruments

Флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET) — физическое явление, впервые описанное более 50 лет назад, которое сегодня все чаще используется в биомедицинских исследованиях и открытии лекарств. FRET полагается на зависящую от расстояния передачу энергии от молекулы-донора к молекуле-акцептору. Из-за своей чувствительности к расстоянию FRET использовался для исследования молекулярных взаимодействий. FRET — это безызлучательная передача энергии от молекулы-донора к молекуле-акцептору. Молекула-донор — это краситель или хромофор, который первоначально поглощает энергию, а акцептор — хромофор, которому впоследствии передается энергия. Это резонансное взаимодействие происходит на расстояниях, превышающих межатомные расстояния, без преобразования в тепловую энергию и без каких-либо столкновений молекул.Передача энергии приводит к уменьшению интенсивности флуоресценции донора и времени жизни возбужденного состояния, а также к увеличению интенсивности излучения акцептора. Пару молекул, которые взаимодействуют таким образом, что возникает FRET, часто называют парой донор / акцептор.

Несмотря на то, что на FRET влияет множество факторов, основных условий, которые должны быть соблюдены для возникновения FRET, относительно мало. Молекулы донора и акцептора должны находиться в непосредственной близости друг от друга (обычно 10–100 Å).Спектр поглощения или возбуждения акцептора должен перекрывать спектр излучения флуоресценции донора (рис. 1). Степень их перекрытия называется спектральным интегралом перекрытия (J). Ориентации диполей донорного и акцепторного переходов должны быть примерно параллельны. Если предположить, что донорно-акцепторные пары совместимы, наиболее важным элементом, необходимым для возникновения FRET, является близость пар. Ферстер продемонстрировал, что эффективность процесса (E) зависит от обратного шестого расстояния между донором и акцептором (см. Уравнение 1).[1]

Где Ro — расстояние Ферстера, на котором передается половина энергии, а r — фактическое расстояние между донором и акцептором. Расстояние, на котором передача энергии эффективна на 50%, называется радиусом Ферстера (Ro). Величина Ro зависит от спектральных свойств донора и акцептора. Расстояние Ферстера от 20 до 90 Å наиболее полезно для исследования биологических макромолекул.Эти расстояния сопоставимы с диаметрами многих белков, толщиной биологических мембран и расстояниями между сайтами на мультисубъединичных белках. Любой процесс, который влияет на скорость передачи энергии, позволяет количественно оценить процесс. В результате FRET часто называют спектроскопической линейкой. Обратите внимание, что расстояние Ферстера (Ro) зависит от ряда факторов, включая квантовый выход флуоресценции донора в отсутствие акцептора (fd), показатель преломления раствора (n), дипольную угловую ориентацию каждой молекулы. (k2) и спектральный интеграл перекрытия донора и акцептора (J).См. Уравнение 2.

Рис. 1. Схематическое изображение интеграла перекрытия спектров

В качестве примера влияния расстояния на эффективность передачи энергии можно использовать некоторые произвольные числа для расстояния Ферстера (Ro) и фактического расстояния (r). Если Ro произвольно задан равным 1 (Ro = 1), и расстояние между донором и акцептором также равно 1, тогда r = Ro, и уравнение эффективности будет E = 1 ⁶ / (1 ⁶ + 1 ⁶ ), что равно 0.5 (т.е. 50%). Эта половина максимального значения и есть то, что определяется как расстояние Фёрстера. Если расстояние в 10 раз меньше (например, r = 0,1Ro), то E = 1 ⁶ / (1 ⁶ + 0,1 ⁶ ) = 0,999999, что значительно эффективнее. Однако, если расстояние между донором и акцептором в 10 раз больше (т.е. r = 10Ro), то E = 1 ⁶ / (1 ⁶ + 10 ⁶ ) = 0,0000001. Эта чрезвычайная чувствительность к расстоянию — вот что позволяет использовать FRET для экспериментов с приближением.

Обычно донорная и акцепторная части различаются, и в этом случае FRET можно обнаружить по появлению флуоресценции акцептора или по тушению донорной флуоресценции. Зонд-донор всегда представляет собой флуоресцентную молекулу. Обратите внимание, что люминесцентные молекулы ведут себя как флуоресцентные молекулы в отношении своего излучения. При соответствующем возбуждении его электроны перескакивают из основного состояния (So) на более высокий колебательный уровень. Эти электроны очень быстро (в течение пикосекунд) распадаются на самые низкие колебательные уровни (S1) и в конечном итоге (в течение наносекунд) возвращаются в состояние So, и излучается фотон света.Когда выполняются условия для возникновения FRET, затухание флуоресценции донора и передача энергии акцептору будут конкурировать за спад энергии возбуждения. При резонансной передаче энергии фотон НЕ испускается, а энергия передается молекуле-акцептору, электроны которой, в свою очередь, возбуждаются, как описано для молекулы-донора. Последующий возврат в основное состояние испускает фотон (рис. 2).

Рис. 2. Схематическое изображение состояний колебательной энергии электрона, возникающих во время FRET.

Измерение

Обнаружение и количественное определение FRET, безусловно, может быть выполнено разными способами. Поскольку FRET может приводить как к уменьшению флуоресценции молекулы донора, так и к увеличению флуоресценции акцептора, может быть выполнено определение метрики соотношения двух сигналов. Преимущество этого метода заключается в том, что измерение взаимодействия не зависит от абсолютной концентрации датчика.Поскольку не все акцепторные части являются флуоресцентными, их можно использовать в качестве средства для гашения флуоресценции. В этих случаях те взаимодействия, которые приводят к приближению флуоресцентной донорной молекулы к такой молекуле, могут привести к потере сигнала. И наоборот, реакции, которые устраняют близость флуоресцентного донора и тушителя, могут привести к увеличению флуоресценции. Одним из таких примеров могут быть анализы протеазы. Эти анализы обычно включают флуоресцентный фрагмент на одном конце и молекулу гашения на другом конце, разделенных пептидом, содержащим последовательность расщепления протеазой.

Некоторые примеры

Генетически кодируемые флуоресцентные красители, такие как зеленый флуоресцентный белок (GFP) и родственные молекулы синего, голубого, желтого и красного цветов, обеспечивают способность выполнять FRET in vitro, особенно в живых клетках [2]. Эти белки образуют пары FRET друг с другом, а также с обычными красителями. Они могут быть связаны с другими белками генетически или ковалентно, но при этом сохранять свою флуоресцентную способность. Эти красители могут быть генетическими элементами, которые могут быть связаны с другими генами с образованием химерных белков.Эти химерные белки содержат GFP (или связанный с ним флуоресцентный белковый элемент) и предполагаемый связывающий домен. С различными химерными белками (один донор и один акцептор) можно исследовать белок-белковые взаимодействия. Только когда пары донор / акцептор взаимодействуют посредством белок-белковых взаимодействий, результатом будет FRET. (Рисунок 3)

Рис. 3. Схематическое изображение взаимодействия двух различных флуоресцентных белковых химер. Взаимодействия белок-белок между белками, помеченными A и B, приводят к тому, что синий флуоресцентный белок и зеленый флуоресцентный белок находятся в достаточно близком расстоянии, чтобы позволить FRET возникать. В этом примере возбуждение синего флуоресцентного белка приводит к испусканию флуоресценции зеленым флуоресцентным белком.

Органические цианиновые красители Cy3, Cy5, Cy5.5 и Cy7, которые излучают в красном диапазоне (> 550 нм), обладают рядом преимуществ. Их диапазон излучения таков, что часто снижается фоновая флуоресценция. Кроме того, большие расстояния (> 100 Å) могут быть измерены в результате высоких коэффициентов экстинкции и хороших квантовых выходов. Даже донорно-акцепторные пары с разделенными спектрами излучения (т.е. низкий интеграл перекрытия) приводят к приемлемым расстояниям Фёрстера. Например, Cy3, который излучает максимум на 570 нм, и Cy5, который излучает на 670 нм, имеют расстояние Ферстера> 50 Å. Большое расстояние между парами позволяет измерять излучение акцептора в результате FRET без помех от излучения донора. Кроме того, эти молекулы могут быть напрямую связаны с определенными участками в синтетически полученных нуклеиновых кислотах, что позволяет использовать FRET для оценки отжига нуклеиновых кислот.

Рисунок 4.Схематическое изображение FRET, возникающего между флуоресцентными фрагментами Cy3 и Cy5, когда меченые олигонуклеотиды отжигаются.

В примере, изображенном на фиг. 4, два комплементарных олигонуклеотида РНК помечены Cy3 и Cy5 соответственно. Когда эти меченые молекулы не отжигаются (рис. 4A), возбуждение РНК-олигонуклеотида, меченного Cy3, светом с длиной волны 540 нм приводит только к испусканию света Cy3 с длиной волны 590 нм, тогда как комплементарная РНК-олиго, меченная Cy5, не излучает любой свет с длиной волны 590 нм или его истинная длина волны излучения 680 нм.Однако, когда двум олигонуклеотидам позволяют отжигаться, непосредственная близость молекул позволяет происходить переносу FRET. Это приводит к испусканию света с длиной волны 680 нм, когда отожженная молекула возбуждается светом с длиной волны 540 нм. Обратите внимание, что не все излучение Cy3 при 590 нм теряется, но значительная его часть теряется.

Рис. 5. Принципиальная схема работы FRET, используемой ВСП

(VSP) — это технология анализа на основе флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET), используемая для обнаружения лекарств с высокопроизводительным ионным каналом.Донор FRET представляет собой связанный с мембраной кумарин-фосфолипид (CC2-DMPE), который связывается только с внешней стороной клеточной мембраны. Акцептор FRET представляет собой мобильный, отрицательно заряженный, гидрофобный оксонол [DiSBAC ₂ (3) или DiSBAC ₄ (3)], который будет связываться с любой стороной плазматической мембраны в ответ на изменения мембранного потенциала (рис. 5). В ВСП используется зависимость от расстояния. Только когда акцептор DISBAC ₂ (3) расположен снаружи клеточной мембраны, FRET может иметь место.Покоящиеся клетки обладают относительно отрицательным потенциалом, поэтому два зонда связываются с внешней стороной клеточной мембраны, что приводит к эффективному FRET. Возбуждение донорного зонда CC2-DMPE (при ~ 400 нм) генерирует сильный красный сигнал флуоресценции (при ~ 590 нм) от зонда-акцептора оксонола. Когда мембранный потенциал становится более положительным, как это происходит при деполяризации клеток, оксонольный зонд быстро перемещается (в субсекундном временном масштабе) на другую сторону мембраны (рис. 5). Таким образом, каждый оксонольный зонд «чувствует» и реагирует на изменения напряжения в ячейке.Эта транслокация разделяет пару FRET, поэтому возбуждение донорного зонда CC2-DMPE теперь генерирует сильный синий сигнал флуоресценции (при ~ 460 нм) от зонда CC2-DMPE. Ожидается, что деполяризация клетки, которая заставляет DISBAC ₂ (3) перемещаться на внутреннюю сторону мембраны, приведет к снижению активности FRET.

Соединения лантанидов, такие как европий и тербий, эффективно используются в качестве доноров в реакциях FRET. Эти соединения обеспечивают очень хорошее соотношение сигнал / шум в результате их длительного периода полураспада флуоресценции и спектральных характеристик. Эмиссия этих соединений имеет резко пиковый профиль с большим стоксовским сдвигом от возбуждения. Кроме того, длительный период полураспада флуоресценции позволяет начинать измерение после прекращения возбуждающего света. Задержка между возбуждением и измерением (диапазон мсек) позволяет рассеяться фоновой флуоресценции от молекулы органического акцептора с периодом полураспада в наносекундном диапазоне. Таким образом, при соответствующей задержке измеряется только донорно-акцепторная эмиссия.

Донорная молекула не всегда должна включать флуоресцентное соединение.Люминесцентные молекулы излучают фотоны очень похоже на флуоресценцию. Основное различие состоит в том, что электронное возбуждение не является результатом поглощения фотона, а скорее является результатом высвобождения химической энергии, содержащейся в молекуле. Когда возбужденные электроны возвращаются к своему основному состоянию, энергия может быть высвобождена в виде фотона света или передана через RET молекуле-акцептору, если условия верны. Хотя количество молекул, которые можно использовать, более ограничено, эта технология имеет то преимущество, что отсутствует внешнее возбуждение молекулы акцептора.

Проблемы

При разработке экспериментов FRET необходимо учитывать ряд вопросов. Самая очевидная проблема — это близость. В зависимости от схемы анализа, непосредственная близость будет либо установлена, либо устранена во время анализа, что приведет к изменению сигнала, который можно измерить. Необходимо выбрать подходящие пары донор / акцептор. Пары должны иметь достаточное спектральное перекрытие для эффективной передачи энергии, но при этом иметь достаточную разницу в спектрах, чтобы их можно было отличить друг от друга.Выбор фильтров для выбора длины волны флуоресценции также имеет решающее значение для успеха или неудачи экспериментального обнаружения FRET. Фильтр возбуждения для донора должен иметь возможность избирательно возбуждать молекулу донора, сводя к минимуму прямое возбуждение молекулы акцептора. Загрязняющее прямое возбуждение акцепторной молекулы может быть учтено с использованием соответствующих контролей, но большие количества затрудняют интерпретацию данных. Как показано на рисунке 1, фильтры, используемые для возбуждения Cy3, минимизировали возбуждение Cy5, обеспечивая при этом достаточный сигнал возбуждения для Cy3.

Еще одна важная проблема, связанная с обнаружением FRET, связана с концентрацией аналита. Только те молекулы, которые взаимодействуют друг с другом, приведут к FRET. Если присутствуют большие количества донорных и акцепторных молекул, но они не взаимодействуют, количество происходящего FRET будет довольно низким. В этом примере, хотя молекулы донора и акцептора могут быть очень легко обнаружены по отдельности, фактического количества активности FRET может быть недостаточно для обнаружения. Что касается FRET, фактически измеряемым «аналитом» являются пары донор / акцептор, а не отдельные компоненты.Кроме того, как донорные, так и акцепторные молекулы должны быть в достаточной концентрации для того, чтобы FRET имел место. Большинство связывающих событий — это динамический процесс, который достигает устойчивого состояния. Если одного из компонентов реакции не хватает, то общее связанное количество будет естественно низким. Например, временные трансфекции с двумя разными генетическими элементами, которые приводят к тому, что один из элементов не транслируется эффективно в белок, приведут к низким уровням FRET. Клеточная локализация также может иметь значение.Если одна молекула находится в цитоплазме, а другая — в ядре, взаимодействия друг с другом не будет, несмотря на достаточное количество каждой из них.

Приложения FRET

• Структура и конформация белков [3]
• Пространственное распределение и сборка белков [4]
• Взаимодействия рецептор / лиганд [5]
• Иммуноанализ [6]
• Структура и конформация нуклеиновых кислот [7]
• ПЦР в реальном времени и определение SNP [8,9]
• Гибридизация нуклеиновых кислот [10]
• Распределение и транспорт липидов [11]
• Анализы слияния мембран [12]
• Измерение потенциала мембраны [13, 14]
• Анализ флуорогенных протеаз [15]
• Индикаторы циклического AMP [16]

Узнать больше о Synergy HTX
Многорежимный считыватель

Ссылки

1. Förster, T. (1948) Межмолекулярная миграция энергии и флуоресценция Ann. Phys 2: 55-75.
2. Tsien, R. (1998) Ann. Обзор Biochem, 67: 509-544
3. Jonsson T, Waldburger CD, Sauer RT, (1996) Нелинейные отношения свободной энергии в разворачивании репрессора дуги подразумевают существование нестабильных, нативных промежуточных продуктов сворачивания. «. Biochemistry 35: 4795-4802.
4. Watson BS, Hazlett TL, Eccleston JF, Davis C, Jameson DM, Johnson AE. (1995) Макромолекулярное расположение в аминоацил-тРНК.фактор элонгации Tu.GTP тройной комплекс. Исследование передачи энергии флуоресценции. Биохимия 34: 7904-7912
5. Berger W, Prinz H, Striessnig J, Kang HC, Haugland R, Glossmann H. (1994) Сложный молекулярный механизм связывания дигидропиридина с Ca (2 +) — каналами L-типа, выявленный с помощью резонансной передачи энергии флуоресценции. Биохимия 33: 1875-11883.
6. Ханна П.Л., Ульман Э.Ф. (1980) 4 ‘, 5’-Диметокси-6-карбоксифлуоресцеин: новый диполь-дипольный акцептор переноса энергии флуоресценции, пригодный для флуоресцентных иммуноанализов. Анальная биохимия 108: 156-161.
7. Клегг Р.М., Мерчи А.И., Лилли Д.М. (1994) Структура раствора четырехстороннего соединения ДНК в условиях с низким содержанием соли: анализ флуоресцентного резонансного переноса энергии. Biophys J 66: 99-109.
8. Ли Л.Г., Ливак К.Дж., Мулла Б., Грэм Р.Дж., Винаяк Р.С., Вуденберг TM. (1999) Семицветное, гомогенное обнаружение шести продуктов ПЦР »Biotechniques 27: 342-349.
9. Мякишев М.В., Хрипин Ю., Ху С., Хамер Д.Х. 2001) Высокопроизводительное генотипирование SNP с помощью аллель-специфической ПЦР с универсальными праймерами, меченными переносом энергии.Genome Res 11: 163-169.
10. Parkhurst KM, Parkhurst LJ. (1995) Кинетические исследования резонансного переноса энергии флуоресценции с использованием олигонуклеотида с двойной меткой: гибридизация с олигонуклеотидным комплементом и с одноцепочечной ДНК. Биохимия 34: 285-292.
11. Николс Дж. У., Пагано РЭ. (1983) Анализ резонансного переноса энергии белково-опосредованного переноса липидов между везикулами. J Biol Chem 258: 5368-5371.
12. Uster PS (1993) Микроскопия резонансного переноса энергии in situ: мониторинг слияния мембран в живых клетках.Методы Энзимол. 221: 239-246.
13. Hoffman, R. и Held, P. Примечание по применению BioTek.
14. Gonzalez JE, Tsien RY. (1995) Измерение напряжения путем резонансного переноса энергии флуоресценции в отдельных клетках. Biophys J 69: 1272-1280.
15. Matayoshi ED, Wang GT, Krafft GA, Erickson J. (1990) Новые флуорогенные субстраты для анализа ретровирусных протеаз с помощью резонансной передачи энергии ». Science 247, 954-958.
16. . Адамс С.Р. и др. (1993) Оптические зонды для циклического AMP, флуоресцентные и люминесцентные зонды для определения биологической активности, Mason W.T., Ed.С. 133-149.

Основы FRET-микроскопии | Nikon’s MicroscopyU

Считается, что в живых клетках динамические взаимодействия между белками играют ключевую роль в регулировании многих путей передачи сигналов, а также вносят вклад в широкий спектр других критических процессов. В прошлом подходы классической биохимии к выяснению механизма таких взаимодействий были обычным явлением, но слабые или временные взаимодействия, которые могут происходить в естественной клеточной среде, обычно прозрачны для этих методов.Например, совместная локализация предполагаемых белковых партнеров с использованием иммунофлуоресцентной микроскопии в фиксированных клетках была популярным методом для изучения взаимодействий in situ , и на основе этого метода были представлены многочисленные литературные отчеты. Однако, поскольку разрешение флуоресцентного микроскопа в несколько сотен раз меньше, чем размер типичного белка, совместная локализация часто приводит к сомнительным результатам. Прекрасная аналогия состоит в том, что флуоресцентная микроскопия дает информацию, эквивалентную знанию того, что два студента присутствуют в большом лекционном зале.Он не предлагает разрешения, необходимого для определения того, находятся ли ученики в одном классе или, что еще лучше, сидят ли они за соседними партами.

Типичные методы флуоресцентной микроскопии основаны на поглощении флуорофором света на одной длине волны (возбуждение) с последующим испусканием вторичной флуоресценции на более длинной длине волны.Длины волн возбуждения и излучения часто отделены друг от друга на десятки и сотни нанометров. Маркировка клеточных компонентов, таких как ядра, митохондрии, цитоскелет, аппарат Гольджи и мембраны, специфическими флуорофорами, позволяет локализовать их в фиксированных и живых препаратах. Путем одновременного мечения нескольких субклеточных структур отдельными флуорофорами, имеющими отдельные спектры возбуждения и испускания, можно использовать специальные комбинации флуоресцентных фильтров для изучения близости меченых молекул в пределах одной клетки или участка ткани.При использовании этого метода молекулы, которые расположены ближе друг к другу, чем предел оптического разрешения, по-видимому, совпадают (и говорят, что совмещают ). Эта очевидная пространственная близость подразумевает, что молекулярная ассоциация возможна. В большинстве случаев, однако, нормального разрешения флуоресцентного микроскопа с ограничением дифракции недостаточно, чтобы определить, действительно ли имеет место взаимодействие между биомолекулами.

Измерения совместной локализации в лучшем случае наводят на размышления, а в худшем — вводят в заблуждение, особенно с учетом того, что многие сигнальные пути используют одну и ту же клеточную структуру, как, например, покрытые клатрином ямки, которые используются для интернализации многих рецепторных комплексов.Знание о том, что две молекулы или белки на самом деле являются смежными, а не просто находятся в одном и том же районе, обеспечивает значительно более надежное определение их потенциала для взаимодействия. Проверенная временем методика электронной микроскопии имеет достаточное разрешение для удовлетворения потребностей высокоточной локализации, но просто не имеет точной методологии маркировки, необходимой для получения надежных результатов. Более того, многие методы совместной локализации обычно применяются для использования в фиксированных клетках, что исключает очень желательные динамические измерения, достижимые с помощью анализов в живых клетках.Флуоресцентная визуализация с использованием многоцветных флуоресцентных белков позволяет легко проводить эксперименты с живыми клетками, которые необходимы для анализа переходного взаимодействия, но этот подход страдает от относительно низкого пространственного разрешения, ограниченного примерно 200 нанометрами.

Ограничения в определении пространственной близости белковых молекул можно преодолеть, применяя методы микроскопии Фёрстера (или флуоресценции) с резонансным переносом энергии ( FRET ). FRET возникает между двумя правильно расположенными флуорофорами только тогда, когда расстояние между ними составляет от 8 до 10 нанометров или меньше.Таким образом, FRET хорошо подходит для исследования белковых взаимодействий, которые происходят между двумя молекулами, расположенными на расстоянии нескольких нанометров друг от друга. За последние десять лет подходы FRET приобрели популярность из-за роста приложений, требующих генетического нацеливания на определенные белки и пептиды с использованием слияния с зеленым флуоресцентным белком ( GFP ) и его мутантными производными. FRET между двумя спектрально различными флуоресцентными белками (известный как FP-FRET ) широко применяется для двух совершенно разных экспериментальных методик, как обсуждается ниже.Представлено в Рис. 1 — это энергетическая диаграмма Яблонского, иллюстрирующая связанные переходы возбужденного состояния между испусканием донора и поглощением акцептора в FRET. Абсорбционные и эмиссионные переходы представлены прямыми вертикальными стрелками (синими, зелеными и красными), а колебательная релаксация обозначена волнистыми желтыми стрелками. Связанные переходы нарисованы пунктирными линиями, что указывает на их правильное расположение на диаграмме Яблонского, если они возникли в результате опосредованных фотонами электронных переходов. В присутствии подходящего акцептора донорный флуорофор может передавать энергию возбужденного состояния непосредственно акцептору, не испуская фотон (показано фиолетовой стрелкой на , рис. 1, ). Результирующая флуоресценция , сенсибилизированная, эмиссионная имеет характеристики, аналогичные спектру эмиссии акцептора.

Одним из основных препятствий на пути широкого внедрения исследований FRET в живых клетках было отсутствие подходящих методов для мечения определенных внутриклеточных белков соответствующими флуорофорами.Недавняя разработка флуоресцентных белков, обладающих широким спектром спектральных профилей, и возрастающая сложность белковых химер (гибридных, а также биосенсоров) привела к появлению ряда потенциальных пар флуоресцентных белков, которые можно использовать в экспериментах FRET. Применение флуоресцентных белков к FRET включает либо интеграцию выбранной пары в биосенсор (единая генетически кодируемая конструкция), либо проведение межмолекулярных измерений между двумя отдельными белками, каждый из которых слит с другим флуоресцентным белком. Последний подход был использован для визуализации различных белковых взаимодействий, включая олигомеризацию рецепторов и выяснение функций факторов транскрипции. Однако проведение FRET-анализов на независимо экспрессируемых химерных белках намного сложнее из-за изменчивой стехиометрии, которая неизбежно возникает, когда отдельные флуоресцентные объекты экспрессируются в живых клетках. Независимо от сложности, эксперименты такого рода могут дать информативные результаты, если установлены соответствующие средства управления и исследование проводится с высокой точностью.

Флуоресцентные белковые биосенсоры

Флуоресцентные белковые биосенсоры нашли широкое применение при составлении отчетов о разнообразных внутриклеточных процессах. Благодаря творческому слиянию пар флуоресцентных белков с биополимерами, которые выполняют критически важные функции, связанные с различными аспектами физиологической передачи сигналов, ученые-исследователи разработали множество новых молекулярных зондов, которые можно использовать для оптической визуализации живых клеток таких важных процессов, как индукция кальциевой волны, цикличность. эффекты посланника нуклеотидов, изменения pH, колебания мембранного потенциала, фосфорилирование и действие внутриклеточной протеазы.Альтернативная, но весьма полезная стратегия создания биосенсора включает модификации самой структуры основной цепи флуоресцентного белка, либо для разделения пептида на отдельные единицы, которые объединяются in vivo для получения флуоресценции (метод, названный Bi -Molecular F luorescence C oplementation; BiFC ) или для соединения природных амино- и карбоксиконцев вместе и создания сайта встраивания в молекуле для сенсорного пептида.

Первым флуоресцентным белковым биосенсором был индикатор кальция под названием cameleon , сконструированный путем смещения белка кальмодулина и кальций-кальмодулин-связывающего домена киназы легкой цепи миозина (домен M13 ) между усиленными синими и зелеными флуоресцентными белками ( EBFP ). и EGFP ). В присутствии возрастающих уровней внутриклеточного кальция домен M13 связывает пептид кальмодулин, вызывая увеличение FRET между флуоресцентными белками.К сожалению, этому датчику мешал очень низкий динамический диапазон (увеличение флуоресценции в 1,6 раза), и его было трудно визуализировать из-за недостаточной яркости и плохой фотостабильности EBFP. Улучшенные версии с использованием того же шаблона включали голубой и желтый варианты ECFP и EYFP для получения более высоких уровней сигнала, и даже лучшие результаты были получены, когда производные YFP ​​(обозначенные camgaroos ) были получены путем вставки кальций-чувствительных пептидов в начало седьмой цепи beta в остове флуоресцентного белка.Сенсорные пептиды, расположенные в этом необычном положении, довольно хорошо переносятся с точки зрения поддержания высокого уровня флуоресценции. Еще одна стратегия использует преимущества уникальной бочкообразной структуры, характерной для флуоресцентных белков, для изменения конфигурации концов белка путем связывания естественных концов N и C и создания нового стартового кодона в одном из нескольких мест в центральной области строение (обычно в петлях). Эти структурно модифицированные производные, названные циркулярно пермутированными флуоресцентными белками , могут быть объединены с кальмодулином и M13 для получения превосходных биосенсоров кальция.

За биосенсорами кальция быстро последовали генетические индикаторы pH, фосфорилирования и протеазной активности. Два общих подхода можно использовать для адаптации флуоресцентных белков в качестве датчиков pH. Первый основан на чувствительности флуоресценции EGFP (pKa = 5,9) и EYFP (pKa = 6,5) к кислой среде в сочетании с относительной нечувствительностью других белков, таких как ECFP (pKa = 4.7) или DsRed (pKa = 4,5). Слияние EGFP или EYFP с менее чувствительным флуоресцентным белком создает логометрический зонд, который можно использовать для измерения кислотности внутриклеточных компартментов. Второй подход основан на изменении протонирования нативного (дикого типа) GFP, что приводит к сдвигу бимодальных спектральных профилей нативного белка. Класс зондов под названием pHluorins , производных от wtGFP, демонстрирует сдвиг пика возбуждения с 470 до 410 нанометров при снижении pH.Также были разработаны датчики pH с двойным излучением, которые имеют пики в зеленой и синей областях спектра. Хотя биосенсоры фосфорилирования не могут регистрировать активность киназы в режиме реального времени, они состоят из пептида, содержащего мотив фосфорилирования из конкретной киназы, и связывающего домена для фосфопептида, зажатого между двумя флуоресцентными белками, способными к FRET. Когда биосенсор фосфорилируется киназой, фосфопептидсвязывающий домен связывается с фосфорилированной последовательностью, таким образом вызывая или разрушая FRET.Доказано, что эта простая стратегия позволяет создавать надежные и высокоспецифичные биосенсоры. Как и у многих других биосенсоров, основным недостатком является уменьшенный динамический диапазон.

Возможно, наиболее широко используемая конструкция биосенсора для скрининга новых или улучшенных пар FRET включает анализ протеазного расщепления (см. , рисунок 2, ). Простой мотив состоит из двух флуоресцентных белков, связанных вместе коротким пептидом, который содержит консенсусный сайт расщепления протеазой. В общем, датчик демонстрирует очень сильную передачу энергии, которая полностью исчезает при расщеплении линкерной последовательности.Поскольку метод обычно имеет высокий уровень динамического диапазона, его можно использовать для скрининга новых голубых и зеленых доноров FRET с желтыми, оранжевыми и красными акцепторами. Самое большое семейство протеазных биосенсоров включает сайт расщепления, чувствительный к одной из протеаз семейства каспаз, что позволяет исследовать сенсор во время индукции апоптоза. За последние несколько лет было сообщено о большом количестве новых биосенсоров, использующих как сенсибилизированные флуоресцентные белки, так и пары FRET. Несмотря на сохраняющиеся ограничения динамического диапазона датчиков FRET, использующих производные ECFP и EYFP, эта стратегия получила широкое распространение, вероятно, из-за простоты ратиометрических измерений и легкости конструкции датчика.Без сомнения, появятся новые стратегии с использованием более совершенных комбинаций флуоресцентных белков, которые служат для увеличения динамического диапазона и других свойств этого очень полезного класса зондов.

Основные принципы FRET

Фундаментальный механизм FRET включает в себя донорный флуорофор в возбужденном электронном состоянии, который может передавать свою энергию возбуждения соседнему акцепторному флуорофору (или хромофору) безызлучательным образом через диполь-дипольные взаимодействия на больших расстояниях.Теория, поддерживающая передачу энергии, основана на концепции рассмотрения возбужденного флуорофора как колеблющегося диполя, который может подвергаться обмену энергией со вторым диполем, имеющим аналогичную резонансную частоту. В этом отношении резонансная передача энергии аналогична поведению связанных генераторов, таких как пара камертонов, колеблющихся на той же частоте, или радиоантенна. Напротив, радиационная передача энергии требует испускания и повторного поглощения фотона и зависит от физических размеров и оптических свойств образца, а также от геометрии контейнера и путей волнового фронта.В отличие от радиационных механизмов, резонансный перенос энергии может дать значительный объем структурной информации о донорно-акцепторной паре.

Резонансная передача энергии нечувствительна к окружающей оболочке растворителя флуорофора и, таким образом, дает молекулярную информацию, уникальную по сравнению с той, которая выявляется с помощью зависящих от растворителя событий, таких как гашение флуоресценции, реакции возбужденного состояния, релаксация растворителя или измерения анизотропии. Основное влияние растворителя на флуорофоры, участвующие в резонансном переносе энергии, — это влияние на спектральные свойства донора и акцептора. Безызлучательный перенос энергии происходит на гораздо больших расстояниях, чем короткодействующий эффект растворителя, и диэлектрическая природа компонентов (растворителя и макромолекулы хозяина), расположенных между задействованными флуорофорами, очень мало влияет на эффективность резонансной передачи энергии, которая зависит в первую очередь от расстояние между донорным и акцепторным флуорофором.

Феномен FRET не опосредован испусканием фотонов, и, кроме того, даже не требует, чтобы акцепторный хромофор был флуоресцентным.Однако в большинстве приложений и донор, и акцептор являются флуоресцентными, и возникновение передачи энергии проявляется в тушении донорной флуоресценции и сокращении времени жизни флуоресценции, сопровождаемом также увеличением эмиссии акцепторной флуоресценции. Теория резонансной передачи энергии была первоначально разработана Теодором Фёрстером и недавно была названа его именем в честь его вклада. Теория Фёрстера показывает, что эффективность FRET ( E ) изменяется как обратная шестая степень расстояния между двумя молекулами (обозначается r ):

E _FRET = 1 / [1 + (r / R ₀ ) ⁶ ]

, где R (0) — характеристическое расстояние, при котором эффективность FRET составляет 50 процентов, которое может быть вычислено для любой пары флуоресцентных молекул (эта переменная также называется радиусом Фёрстера и более подробно обсуждается ниже).Эффективность FRET теоретической пары флуорофоров (усиленные голубые и желтые флуоресцентные белки) графически продемонстрирована на рис. 3 (а) . Из-за обратной зависимости шестой степени от расстояния между двумя молекулами ( r ) кривая имеет очень резкий спад. Для расстояний менее R (0) эффективность FRET близка к максимальной, тогда как для расстояний более R (0) эффективность быстро приближается к нулю. Полезный диапазон для измерения FRET обозначен красной заштрихованной областью на рис. 3 (а) с пределами 0.5 и 1,5 x R (0) . FRET может эффективно использоваться в качестве молекулярной линейки для расстояний, близких к R (0) , и действительно FRET был адаптирован для таких целей в структурной биологии с использованием прецизионных спектроскопических подходов. Однако для большинства приложений в клеточной биологии доступные отношения сигнал / шум ограничивают эксперименты FRET более двоичным считыванием. Фактически, измерение часто может различать только с высоким FRET и с низким FRET или просто между наличием и отсутствием FRET.

Как обсуждалось ранее, R (0) можно легко вычислить для любой пары флуоресцентных молекул. Значение R (0) в водном (или буферном) растворе определяется довольно простым уравнением с хорошо установленными входными параметрами:

R ₀ = [2,8 x 10 ¹⁷ × Κ ² × Q _D 6000 × Дж (λ)] ^1/6 нанометров

, где Κ (2) или в квадрате каппа представляет коэффициент ориентации между двумя флуорофорными диполями (см. Рисунок 3 (b) для сводки углов, используемых для расчета коэффициента ориентации), Q (D) — квантовый выход донора, Ε (A) — максимальный коэффициент экстинкции акцептора в обратных молях на сантиметр, а Дж (λ) — интеграл спектрального перекрытия (см. {4} dλ $$

Хотя математика может показаться сложной, большинство параметров являются константами, которые легко найти в литературе.Два наиболее важных члена, которые обычно требуют дальнейшего объяснения, — это Κ (2) и J (λ) , интеграл перекрытия. Переменная угла ориентации ( Κ (2) ) просто указывает, что связь FRET зависит от угла между двумя флуорофорами во многом так же, как положение радиоантенны может влиять на ее прием. Если донор и акцептор выровнены параллельно друг другу, эффективность FRET будет выше, чем если бы они были ориентированы перпендикулярно.Эта степень выравнивания определяет Κ (2) . Хотя Κ (2) может варьироваться от нуля до 4, обычно предполагается, что оно равно 2/3, что представляет собой среднее значение, интегрированное по всем возможным углам. Почти для любой реальной ситуации (2) близко к 2/3, и обычно исследователь ничего не может сделать, чтобы изменить это значение (хотя некоторые из них жестко прикрепили флуоресцентные белки к интересующим их целевым белкам, что может привести к драматическим эффектам). Интеграл перекрытия, J (λ) , представляет собой область перекрытия между двумя спектрами, как показано на рис. 4 . Другими параметрами, которые могут влиять на FRET, являются квантовый выход донора и коэффициент экстинкции акцептора. Таким образом, чтобы максимизировать сигнал FRET, исследователь должен выбрать донор с наивысшим квантовым выходом, наиболее поглощающий акцептор и флуорофоры, имеющие значительное перекрытие в своих спектральных профилях. Эта теория неоднократно подтверждалась экспериментом, и нет никаких других механизмов для максимизации FRET для невыровненных флуоресцентных зондов.

Следует отметить, что каждый из рассмотренных выше параметров влияет на расчет радиуса Ферстера только в шестой степени. Таким образом, удвоение квантового выхода донора приводит к изменению R (0) только на 12,5%. Поскольку почти все флуорофоры, используемые в экспериментах по визуализации FRET, имеют высокие квантовые выходы (более 0,5) и коэффициенты экстинкции (более 50000), диапазон возможных значений радиуса Ферстера ограничен между 4 и 6 нанометрами, а большинство пар FRET имеют средний значение R (0) ~ 5 нм.Учитывая, что эффективность FRET сильно зависит от расстояния, разделяющего пару FRET, а также от относительной ориентации флуорофоров, FRET можно использовать для обнаружения изменений белок-белковых взаимодействий, возникающих в результате изменений сродства между двумя белками или изменений в подтверждение их привязки. Стоит повторить, что для большинства приложений визуализации FRET в клеточной биологии эксперименты обычно различают только два состояния (FRET и отсутствие FRET), и необходима дополнительная информация, чтобы помочь в молекулярной интерпретации наблюдаемых изменений FRET.

Факторы, влияющие на измерения FRET

На практике широкий спектр проблем может усложнить и / или поставить под угрозу измерения FRET, что в конечном итоге приведет к неоднозначным или бессмысленным результатам. Одна из основных проблем заключается в том, что донорные и акцепторные флуорофоры могут иметь существенно разные уровни яркости при совместном отображении. Хотя теоретически это несоответствие не должно быть проблемой, однако на практике, поскольку большинство инструментов могут измерять только ограниченный динамический диапазон, визуализация с использованием двойного флуорофора может привести к тому, что один канал будет насыщенным (для более яркого флуорофора), в то время как в другом канале преобладает систематический шум (для диммерного флуорофора).Таким образом, по возможности лучше использовать донор и акцептор сопоставимой яркости.

Еще одним фактором, который может ограничить обнаружение FRET, является стехиометрия донор-акцептор, которая находится вне диапазона от 10: 1 до 1:10. Этот фактор может быть серьезным ограничением в измерениях FRET белок-белковых взаимодействий, в которых один партнер может иметь избыточную концентрацию. Основная проблема — измерение небольшого уровня FRET на фоне флуоресцентных меток, которые не проходят FRET. В связи с тем, что на самом деле нет ничего, что можно было бы сделать для улучшения этой ситуации, множество возможных экспериментов по межбелковому взаимодействию, попадающих в эту категорию, просто не подходят для исследования методами FRET. Для описанных выше флуоресцентных белковых биосенсоров, которые сконструированы только с одним донором и акцептором, стехиометрия является фиксированной и гарантированно составляет 1: 1; таким образом, эта проблема никогда не возникает, и уровень сигнала остается постоянным, независимо от концентрации биосенсора.

Наличие сквозных помех (также называемых перекрестными помехами и кроссоверами ) и перекрестное возбуждение между спектрально перекрывающимися флуорофорами также являются важными проблемами, которые могут затруднить исследования FRET (см. , рис. 5, ). В некоторых случаях акцептор может быть непосредственно возбужден светом в диапазоне длин волн, выбранном для возбуждения донора ( Рисунок 5 (a) ). Кроме того, флуоресценция от донора может просачиваться в канал обнаружения для флуоресценции акцептора, особенно когда спектральные профили излучения донора и акцептора значительно перекрываются (, рис. 5 (b), ).Поскольку эти два источника перекрестных помех возникают из-за фотофизики органических флуорофоров и наверняка будут присутствовать для любой пары FRET, их необходимо учитывать при измерении FRET. Выбор флуорофоров, которые хорошо разделены спектрально, является отличным механизмом для уменьшения перекрестных помех. Однако в большинстве случаев увеличенное спектральное разделение также уменьшает интеграл перекрытия ( J (λ) ), что на практике обычно приводит к снижению способности обнаруживать сигнал FRET.

Наконец, уровень сигнала FRET может быть уменьшен, если два флуорофора не выровнены должным образом (например, имея значение Κ (2) приблизительно равное нулю) или если они просто не расположены в пределах радиуса Фёрстера. (более 6 нанометров). Например, если два меченых белка взаимодействуют, но флуоресцентные метки расположены на противоположных сторонах комплекса, то может не быть обнаруживаемого сигнала FRET, даже если интересующие белки связаны.В общей практике этот тип ложноотрицательных довольно распространен, особенно с флуоресцентными белками-партнерами FRET. Часто требуется несколько стратегий мечения, прежде чем будет обнаружен достаточный и надежный сигнал FRET. Однако каждую из описанных выше проблем можно смягчить (или частично) путем осознанного выбора пары флуорофоров, которая будет использоваться перед созданием векторных конструкций или проведением экспериментов по синтетическому мечению.

Представлено в Рис. 5 — это перекрытие спектральных профилей возбуждения и испускания ECFP и mVenus, в настоящее время одной из наиболее предпочтительных пар флуоресцентных белков для исследований FRET. Эти два белка демонстрируют значительное перекрытие как в спектрах возбуждения (, фиг. 5 (а), ), так и в спектрах излучения (, фиг. 5 (b), ). Прямое возбуждение акцептора FRET (mVenus; красная кривая) может быть значительным в зависимости от длины волны, используемой для возбуждения донора (ECFP; голубая кривая или mCerulean; синяя кривая) из-за более высокого коэффициента экстинкции желтого белка по сравнению с голубые белки. Это перекрытие особенно проблематично, когда ECFP используется в качестве донора и может быть частично компенсировано использованием вариантов CFP с высокими коэффициентами экстинкции, таких как mCerulean.Обратите внимание, что кривые возбуждения на рис. 5 (a) нарисованы в масштабе, чтобы отразить различия в коэффициенте экстинкции между желтым и голубым белками. Возбуждение на 458 нм создает гораздо более высокий уровень перекрестных помех возбуждения в мВенусе, чем возбуждение на 405 или 440 нм. Широкий спектр излучения флуоресценции ECFP ( Рисунок 5 (b) ) демонстрирует значительное перекрытие интенсивности во всем диапазоне излучения mVenus.

Методы FRET в приложениях клеточной биологии

Исследователи, использующие флуоресцентные белковые биосенсоры или пытающиеся сопоставить стехиометрию флуоресцентных зондов, слитых с отдельными взаимодействующими мишенями, должны использовать как можно больше различных методов анализа FRET, чтобы установить методологию для данного эксперимента.Такие усилия оправданы, потому что каждая из пар флуоресцентных белков FRET демонстрирует определенную патологию, которая усложняет ее использование, что требует четкого понимания параметров оптической микроскопии, применяемых для измерения относительно небольших разностей сигналов, возникающих в большинстве анализов FRET. После того, как система и возможные результаты будут хорошо установлены, для текущих процедур можно использовать самые простые подходы. Список методов, которые были разработаны для изображения FRET, довольно обширен.В целом, все существующие стратегии измерения FRET могут быть применены к экспериментам с флуоресцентными белками, но, исходя из практических соображений, пять общих подходов оказались особенно полезными:

• Сенсибилизированная эмиссия — Двухканальная визуализация с использованием алгоритма, который корректирует перекрестные помехи возбуждения и эмиссии
• Фотообесцвечивание акцептора — Также известный как декушение донора , этот метод измеряет повышенное излучение донора при фотообесцвечивании акцептора
• Флуоресцентная микроскопия времени жизни (FLIM) — Измерение времени жизни донора флуоресцентного белка (или другого флуорофора)
• Спектральная визуализация — Возбуждение на одной или двух длинах волн и измерение полных спектральных профилей донора и акцептора
• Флуоресцентная поляризационная визуализация — Измеряйте поляризацию параллельно и перпендикулярно возбуждению с высоким отношением сигнал / шум

Каждый из перечисленных выше подходов FRET имеет свои сильные и слабые стороны. Например, с одной стороны, двухканальная визуализация — это самый простой метод, но требует наиболее сложного набора элементов управления. С другой стороны, FLIM может дать однозначное измерение эффективности FRET, а инструменты доступны для интеграции в конфокальную систему Nikon A1 HD25 / A1R HD25.

Чувствительное излучение

Также обычно называемый двухцветной визуализацией с элементами управления, сенсибилизированное излучение, возможно, является самым простым методом визуализации FRET. Донорный флуорофор возбуждается определенной длиной волны (в широкоугольном или конфокальном микроскопе), и сигнал собирается с использованием фильтров излучения, выбранных для флуоресценции донора и флуоресценции акцептора.При (нереальном) отсутствии перекрестных помех между возбуждением и флуоресценцией двух флуорофоров сенсибилизированное излучение было бы идеальным методом. Однако перекрестные помехи между флуоресцентными белками представляют собой серьезную проблему, и обычно требуются обширные контрольные эксперименты, чтобы установить наличие или отсутствие FRET. Таким образом, с помощью этого подхода сложно получить количественно точные данные FRET. Сенсибилизированное излучение относительно просто настроить на широкопольном флуоресцентном микроскопе, доступном во многих лабораториях, но необходимые контрольные эксперименты требуют значительной обработки изображений для вычитания компонентов перекрестных помех, что значительно увеличивает уровень шума и неопределенность измерений.

Для сенсибилизированной эмиссионной FRET визуализации были разработаны различные корректирующие подходы. Основная концепция включает использование различных комбинаций фильтров с несколькими образцами, которые содержат: только донор, только акцептор и предполагаемый образец FRET с донором и акцептором. Значения излучения из этих выборок позволяют исследователю определить величину ожидаемых перекрестных помех как в каналах возбуждения, так и в каналах излучения и вычесть их из измерения FRET.Теоретически этот подход работает хорошо, но, к сожалению, потребность в обработке изображений увеличивает уровень шума во всех изображениях. Таким образом, если сигнал FRET слабый, тогда может быть трудно измерить FRET с использованием этого подхода.

Несмотря на упомянутые выше трудности, сенсибилизированные измерения излучения могут быть полезны для быстрых динамических экспериментов, в которых сигналы FRET велики из-за возможности одновременного получения обоих изображений.Сенсибилизированная эмиссия является особенно привлекательной техникой при исследовании флуоресцентных белковых биосенсоров, где динамический диапазон FRET велик, а стехиометрия донора и акцептора фиксирована в соотношении 1: 1. Хорошим примером является биосенсор протеазы, показанный на Рис. 2 . Эта химера была сконструирована так, чтобы иметь высокую эффективность FRET, которая снижается практически до нуля, когда пептидный линкер ферментативно расщепляется. Результатом является большое и легко поддающееся измерению изменение FRET, которое демонстрирует специфическую протеазную активность в данный момент времени и в определенной области внутри живой клетки.

Акцептор фотообесцвечивания

Несмотря на то, что оно ограничено только одним измерением, фотообесцвечивание акцептора (или ослабление гашения донора) также является простым методом, который часто дает отличные результаты. Основная концепция использует тот факт, что флуоресценция донора гасится во время FRET, потому что часть энергии флуоресценции донора направляется к акцептору. Фотообесцвечивание акцепторного флуорофора необратимо устраняет эффект тушения и увеличивает уровень флуоресценции донора.Если FRET происходит между флуорофорами, флуоресценция донора должна увеличиваться, когда акцептор удаляется. В общем, важно убедиться, что фотообесцвечивание акцептора не ухудшает флуоресценцию донора и что акцептор фотообесцвечивается примерно до 10 процентов от своего первоначального значения. Оба эти ограничения легко выполняются с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа, но также могут быть выполнены с помощью широкоугольных микроскопов или микроскопов с вращающимся диском, оснащенных специальной системой освещения.

Преимущество акцепторного фотообесцвечивания состоит в том, что он очень простой, количественный и выполняется с использованием только одного образца. Эффективность FRET может быть рассчитана путем вычитания интенсивности донора в присутствии акцептора из его интенсивности после фотообесцвечивания акцептора, а затем нормализации этого значения к интенсивности донора после отбеливания. Основным недостатком является то, что фотообесцвечивание акцептора является деструктивным и может использоваться только один раз на ячейку, что ограничивает его применение теми экспериментами, которые не связаны с динамическими измерениями.Кроме того, фотообесцвечивание — относительно медленный процесс, который часто занимает несколько минут или дольше. Тем не менее, почти всегда целесообразно выполнять измерение фотообесцвечивания акцептора в конце эксперимента, независимо от того, какие методы используются для анализа FRET.

Представлено в Рис. 6 являются примерами FRET-тестов сенсибилизированного излучения и фотообесцвечивания акцепторов с использованием визуализации живых клеток. На фиг. 6 (a) показана эпителиальная клетка карциномы шейки матки человека (линия HeLa), экспрессирующая биосенсор верблюда, состоящий из mCerulean и mVenus, слитых вместе с промежуточным кальций-чувствительным пептидом, содержащим кальмодулин и домен M13 (описанный выше).Перед добавлением агента, индуцирующего кальций (иономицин), возбуждение клетки с помощью 440-нанометрового освещения вызывает голубую флуоресценцию, указывающую на отсутствие FRET между голубым и желтым флуоресцентными белками ( Рисунок 6 (a) ). При добавлении иономицина временная двухцветная визуализация (сенсибилизированная эмиссия) регистрирует кальциевую волну, пересекающую цитоплазму, поскольку биосенсор реагирует увеличением уровня FRET между флуоресцентными белками ( рисунки 6 (b) и 6 (c) ) ; FRET — желто-красный псевдоцвет).Клетки почек африканской зеленой мартышки (линия COS-7) на фиг.6 (d) — (f) были помечены синтетическими цианиновыми красителями, Cy3 ( фиг. 6 (d) ; зеленый) и Cy5 ( фиг.6 (e) ; красный), конъюгированный с B-субъединицей холерного токсина и направленный на плазматическую мембрану. Внутри мембраны непосредственная близость двух красителей обеспечивает высокий уровень FRET. Фотообесцвечивание Cy5 в выбранной области клетки (белый прямоугольник на рисунке , рис. 6 (e) ) увеличивает расщепление донора (увеличение зеленой флуоресценции на рис. 6 (f) ) в соответствующей области при просмотре флуоресценции в донорском канале только.

Флуоресцентная микроскопия для непрерывной визуализации (FLIM)

Измерения срока службы на сегодняшний день являются наиболее строгим методом определения FRET; кроме того, они также менее подвержены артефактам перекрестных помех из-за того, что отслеживается только флуоресценция донора. Все флуоресцентные молекулы демонстрируют экспоненциальное затухание своей флуоресценции в наносекундном масштабе времени, и скорость этого затухания чувствительна к переменным окружающей среде, которые гасят флуоресценцию. Таким образом, основная концепция FLIM в некоторой степени связана с концепцией фотообесцвечивания акцепторов.Флуоресценция донора гасится взаимодействием FRET, и степень гашения может быть определена путем измерения уменьшения времени затухания флуоресценции донора в присутствии FRET. Таким образом, FLIM дает однозначное значение эффективности FRET. Среди преимуществ комбинированных измерений FLIM-FRET — их нечувствительность к артефактам прямого акцепторного возбуждения, а также тот факт, что флуоресцентные доноры могут быть связаны с акцепторами, которые сами не являются флуоресцентными. Оба эти аспекта служат для увеличения числа полезных пар флуоресцентных белков FRET, доступных исследователям.

FLIM имеет несколько ограничений, которые не позволяют ему быть доминирующим методом в визуализации FRET. В первую очередь, измерения в наносекундной области жизни сложны, а оборудование дорого в получении и обслуживании. Кроме того, этот тип сложного оборудования не является широко доступным. Кроме того, FLIM обычно относится к более медленным методологиям построения изображений, потенциально требующим нескольких минут для получения каждого изображения, что ограничивает его полезность во многих экспериментах с FRET.Эти ограничения могут быть сняты в будущем по мере разработки производителями более удобных и быстрых коммерческих систем «под ключ». Другим существенным недостатком является то, что время жизни флуоресцентных белков в живых клетках часто показывает многоэкспоненциальное затухание, что требует более полного анализа данных для количественных анализов FRET. Более того, локальные факторы окружающей среды, такие как автофлуоресценция или изменение pH, также могут сократить измеряемое время жизни флуоресценции, что приведет к артефактам.Таким образом, следует проявлять большую осторожность при интерпретации данных FLIM-FRET в живых клетках.

Спектральная визуализация

Метод спектральной визуализации представляет собой разновидность метода обнаружения сенсибилизированного излучения FRET, но вместо сбора данных по двум отдельным каналам, весь спектр излучения, содержащий как донорную, так и акцепторную флуоресценцию, собирается при возбуждении донора. Запись всего спектра — типичный подход, используемый для спектроскопических экспериментов, но это относительно недавнее дополнение к инструментальной палитре широкопольной и конфокальной микроскопии.Концепция основана на предпосылке, что сбор всего спектра флуоресценции позволяет разделить перекрывающиеся спектры, используя не только пики излучения, но и различные формы спектральных хвостов. Собирая спектр как от донорного, так и от акцепторного флуорофора, можно определить относительные уровни донорной и акцепторной флуоресценции.

Для получения спектральных изображений требуется специальное оборудование, но отличные системы доступны для многих коммерческих конфокальных микроскопов и могут быть добавлены к обычным флуоресцентным микроскопам по умеренной цене.Проведение количественного анализа уровня перекрестных помех из-за прямого возбуждения акцептора или использования двух длин волн возбуждения в конфокальной микроскопии позволяет точно определить количество FRET. Главный недостаток этого подхода — пониженное отношение сигнал / шум, связанное с получением полного спектра, а не с его сбором по двум каналам с помощью системы на основе фильтров. Однако по мере того, как разрабатывается и устанавливается все больше коммерческих систем, применение спектральной визуализации в анализах FRET расширяется.В ближайшем будущем вполне возможно, что спектральная визуализация станет одним из основных методов проведения экспериментов по визуализации FRET.

Проиллюстрировано в Рис. 7 (a) — это изменения в спаде времени жизни донора (флуоресцентный белок mCerulean) псевдо-FRET биосенсора, состоящего из флуоресцентных белков mCerulean и mVenus, слитых вместе с линкером из 10 аминокислот. Синяя кривая спада показывает время жизни, наблюдаемое в клетках, экспрессирующих только mCerulean, тогда как красная кривая спада показывает время жизни mCerulean, полученное, когда клетки экспрессируют конкатенированные белки.Обратите внимание на уменьшение времени жизни mCerulean, когда белок участвует в резонансной передаче энергии. Область между кривыми представляет энергию, которая передается через FRET от mCerulean (донор) к mVenus (акцептор) в паре FRET. Профиль излучения от 450 до 650 нанометров mCerulean-mVenus в том же псевдобиосенсоре при возбуждении на 405 нанометрах в живых клетках изображен красной кривой на , рис. 7 (b) . Передача энергии от mCerulean к mVenus приводит к значительному пику излучения при 529 нанометрах (максимум излучения mVenus) с гораздо меньшим значением (приблизительно 25 процентов) на 475 нанометрах, максимальной длине волны излучения mCerulean.После фотообесцвечивания mVenus с помощью 514-нанометрового лазера и повторения спектрального сканирования профиль излучения смещается в сторону более низких длин волн и очень напоминает спектр mCerulean в отсутствие партнера FRET. Разница в интенсивности на 475 и 529 нм этих спектральных профилей связана с эффективностью FRET между связанными белками.

Построение изображений поляризационной анизотропии

Измерение поляризации флуоресценции дает особые преимущества для высококонтрастной дискриминации флуоресцентного белка FRET.Эта концепция основана на том факте, что при возбуждении поляризованным светом отбирается популяция флуоресцентных молекул, векторы поглощения которых выровнены параллельно вектору поляризации возбуждающего света. Сразу после возбуждения большая часть флуоресцентного излучения будет оставаться поляризованным параллельно возбуждению, так что флуоресценцию можно считать анизотропной с точки зрения поляризации. Анизотропия исчезнет, ​​если молекулы будут вращаться в течение наносекундного времени жизни флуоресценции.Однако, поскольку флуоресцентные белки имеют большие размеры и медленно вращаются, их флуоресценция не деполяризуется в значительной степени во время измерения. Если FRET возникает между двумя флуоресцентными белками, которые слегка смещены, тогда излучение поляризованной флуоресценции будет появляться под другим углом (от вектора возбуждения), что имитирует вращение флуоресцентного белка.

Основная сила этого подхода — простота измерения поляризации флуоресценции, параллельной и перпендикулярной вектору возбуждения, с высоким отношением сигнал / шум. Поскольку данные о поляризационной анизотропии могут быть получены быстро и с минимальными требованиями к обработке изображений, этот метод хорошо подходит для приложений при просмотре контента с высоким содержанием. Однако следует избегать прямого возбуждения акцептора, так как это может уменьшить донорный сигнал и уменьшить отношение сигнал / шум измерения. Кроме того, хотя этот метод превосходно распознает наличие и отсутствие FRET, он не является хорошим подходом для различения сильного и слабого FRET.Наконец, поляризация может ухудшаться в объективах с высокой числовой апертурой, поэтому эксперименты с поляризованным FRET должны быть ограничены визуализацией с помощью объективов с числовой апертурой 1,0 или меньше.

Представлено в Рис. 8 — это графическая иллюстрация поляризационной анизотропии с использованием флуоресцентных белков в качестве модельной системы. Когда случайно ориентированная популяция флуоресцентных белков ( Рисунок 8 (а) ) возбуждается линейно поляризованным светом (голубая волна), преимущественно возбуждаются только те молекулы, дипольный вектор поглощения которых ориентирован параллельно азимуту поляризации. Эмиссию правильно ориентированных флуоресцентных белков можно наблюдать как сигнал с помощью анализатора, который также параллелен вектору поляризации возбуждающего света (зеленая волна). Результирующая анизотропия, которая является индикатором степени ориентации, может быть определена путем измерения и сравнения интенсивности излучения с помощью вертикально и горизонтально ориентированных анализаторов. Уровень сигнала анизотропии будет уменьшаться, если флуоресцентный белок вращается в масштабе времени эксперимента ( Рисунок 8 (b) ) или если он передает энергию возбуждения из-за FRET соседнему белку ( Рисунок 8 (c) ), имеющему разная ориентация.Как описано выше, из-за того факта, что резонансный перенос энергии может происходить намного быстрее, чем вращение молекул для больших флуоресцентных белковых молекул, деполяризацию из-за FRET можно легко отличить от потери анизотропии, которая происходит во время вращения.

Рекомендации по использованию флуоресцентных белков в FRET

Выбор подходящих зондов для исследования FRET в живых клетках ограничен. Синтетические флуорофоры, идеально подходящие для исследований резонансного переноса энергии в фиксированных клетках, трудно вводить и воздействовать на живые клетки.Точно так же квантовые точки могут быть использованы для маркировки компонентов мембраны для исследования явлений на внешней стороне клетки, но они тоже не могут проникнуть через мембрану и, следовательно, мало используются во внутриклеточных компартментах, таких как ядро, митохондрии или эндоплазматические клетки. ретикулум. Генетически кодируемые флуоресцентные белки в настоящее время представляют собой лучших кандидатов для визуализации FRET в живых клетках с высоким разрешением, о чем свидетельствует объем литературы, публикуемой в этой области ежегодно.Однако многие из типичных артефактов, которые встречаются при измерении FRET с помощью синтетических флуорофоров и квантовых точек, особенно остро проявляются при применении к флуоресцентным белкам. Например, в отличие от 30-40 нанометров ширины полосы спектральных профилей излучения в синтетических материалах, профили флуоресцентных белков колеблются от приблизительно 60 до 100 нанометров, что часто приводит к значительному перекрытию при попытке разделить флуоресценцию донора и акцептора. Широкий спектр флуоресцентных белков также ограничивает количество зондов, которые можно использовать вместе в FRET и других типах экспериментов по визуализации.Кроме того, флуоресцентные белки демонстрируют широкий диапазон уровней яркости. Например, один из самых популярных белков-доноров, ECFP, имеет в пять раз меньшую яркость, чем его обычный желтый акцепторный партнер EYFP.

Хромофор флуоресцентного белка окружает полипептид из 220+ аминокислот, намотанный в трехмерную цилиндрическую структуру размером примерно 2,4 на 4,2 нанометра (называемый бета -ствол или бета -кан ) и состоит из полипептида с обширной водородной связью beta -листов, которые окружают и защищают центральную альфа -спираль, содержащую хромофор (см. Рисунок 9 ).Концы цилиндра закрыты полеспиральными пептидными участками, которые служат для блокирования проникновения ионов и небольших молекул. Внутренняя часть белка настолько плотно упакована боковыми цепями аминокислот и молекулами воды, что остается мало места для диффузии кислорода, ионов или других вторгающихся небольших молекул, которым удается пройти через концы цилиндра. Эти благоприятные структурные параметры, которые частично ответственны за упругую фотостабильность и отличные характеристики флуоресцентных белков, также способствуют снижению эффективности FRET.Большой размер цилиндра эффективно защищает соседние хромофоры флуоресцентного белка с пептидными остатками (до предельного расстояния близкого приближения от 2 до 3 нанометров; обозначено красной линией на , рис. 9 ), что приводит к снижению максимальной эффективности FRET до примерно 40 процентов от теоретического значения. Тем не менее, многочисленные преимущества использования флуоресцентных белков для FRET-визуализации живых клеток намного перевешивают затраты.

Высокая степень перекрытия спектральной полосы пропускания и проблемы с размером, которые возникают с флуоресцентными белками, усугубляются их склонностью к олигомеризации. Почти все обнаруженные к настоящему времени флуоресцентные белки демонстрируют, по крайней мере, ограниченную степень четвертичной структуры, о чем свидетельствует слабая тенденция нативного зеленого флуоресцентного белка Aequorea victoria и его производных к димеризации при иммобилизации в высоких концентрациях. Эта тенденция также подтверждается мотивом строгой тетрамеризации природных желтых, оранжевых и красных флуоресцентных белков, выделенных в рифовых кораллах и анемонах. Олигомеризация может быть значительной проблемой для многих приложений в клеточной биологии, особенно в тех случаях, когда флуоресцентный белок сливается с белком-хозяином, который нацелен на конкретное субклеточное место.После экспрессии образование димеров и олигомеров более высокого порядка, индуцированное флуоресцентной белковой частью химеры, может вызывать атипичную локализацию, нарушать нормальную функцию, мешать сигнальным каскадам или ограничивать агрегацию продукта слияния внутри конкретной органеллы или цитоплазмы. Этот эффект особенно заметен, когда флуоресцентный белок сливается с партнерами, которые сами участвуют в образовании природного олигомера. Продукты слияния с белками, которые образуют только слабые димеры (фактически, большинство вариантов Aequorea victoria ) могут не проявлять агрегацию или неправильное нацеливание при условии, что локализованная концентрация остается низкой.Однако, когда слабодимерные флуоресцентные белки нацелены на определенные клеточные компартменты, такие как плазматическая мембрана, локализованная концентрация белка в некоторых случаях может стать достаточно высокой, чтобы допустить димеризацию. Это может быть особой проблемой при проведении межмолекулярных экспериментов FRET, которые могут дать сложные наборы данных, которые иногда могут быть скомпрометированы артефактами димеризации. С другой стороны, естественная слабая димеризация в белков Aequorea в некоторых случаях может быть использована для увеличения сигнала FRET в биосенсорах, которые в противном случае имели бы ограниченный динамический диапазон.

Токсичность — это проблема, которая возникает из-за чрезмерных концентраций синтетических флуорофоров и чрезмерной экспрессии или агрегации плохо локализованных флуоресцентных белков. Кроме того, здоровье и долговечность оптимально меченных клеток млекопитающих в камерах для получения изображений микроскопа также может пострадать от ряда других вредных факторов. Прежде всего, это вызванное светом повреждение (фототоксичность), которое возникает при многократном воздействии на флуоресцентно меченые клетки излучения лазеров и высокоинтенсивных дуговых разрядных ламп.В возбужденном состоянии флуоресцентные молекулы имеют тенденцию реагировать с молекулярным кислородом с образованием свободных радикалов, которые могут повредить субклеточные компоненты и поставить под угрозу всю клетку. Флуоресцентные белки из-за того, что их флуорофоры скрыты глубоко внутри защитной полипептидной оболочки, обычно не фототоксичны для клеток. При разработке экспериментов FRET следует выбирать комбинации флуоресцентных белков, которые демонстрируют максимально длинные волны возбуждения, чтобы минимизировать повреждение клеток коротковолновым освещением, особенно в долгосрочных экспериментах по визуализации. Таким образом, вместо создания продуктов слияния и биосенсоров с синими или голубыми флуоресцентными белками (возбуждаемыми ультрафиолетовым и синим светом соответственно), варианты, которые излучают в желтой, оранжевой и красной областях спектра, были бы гораздо более идеальными.

Исследователи должны позаботиться о проведении необходимых контрольных экспериментов при использовании новых флуоресцентных белковых биосенсоров и клеточных линий, чтобы гарантировать, что артефакты цитотоксичности и фототоксичности не затеняют результаты FRET или другие важные биологические явления.В некоторых случаях липофильные реагенты вызывают вредные эффекты, которые можно спутать с токсичностью флуоресцентных белков во время визуализации клеточных линий после временных трансфекций. Олигомерные флуоресцентные белки (обсуждаемые выше) рифовых кораллов имеют гораздо большую тенденцию к образованию агрегатов (в сочетании с плохой субклеточной локализацией), чем мономерные белки медуз, но неправильно свернутые продукты слияния могут возникать с любым вариантом. Недавно сообщалось о флуоресцентном белке, способном генерировать активные формы кислорода ( ROS ) при освещении зеленым светом, как об эффективном агенте для инактивации определенных белков с помощью хромофорной световой инактивации ( CALI ).Этот генетически закодированный фотосенсибилизатор, получивший название KillerRed , способен убивать как бактерии, так и эукариотические клетки при освещении в микроскоп. Предыдущие исследования фототоксичности EGFP показали, что даже благодаря тому, что хромофор способен генерировать синглетный кислород, флуоресцентный белок относительно неэффективен в качестве фотосенсибилизатора. Однако длительное освещение клеток, экспрессирующих EGFP и его варианты, может привести к физиологическим изменениям и, в конечном итоге, к гибели клеток, что является определенным сигналом потенциальной фототоксичности в долгосрочных экспериментах по визуализации.

В экспериментах с живыми клетками флуоресцентные белки очень полезны для расширенной визуализации из-за их более низкой скорости фотообесцвечивания по сравнению с синтетическими флуорофорами. Хотя существует высокая степень некоррелированной вариабельности между флуоресцентными белками с точки зрения фотостабильности, большинство вариантов можно использовать для краткосрочной визуализации (от 1 до 25 снимков), в то время как некоторые из более фотостабильных белков можно использовать в покадровых последовательностях, которые охватывают периоды продолжительностью 24 часа и более (в которых собираются от сотен до тысяч изображений).Однако долговременная стабильность любого конкретного белка должна быть исследована для каждого сценария освещения (широкопольного, конфокального, многофотонного, качающегося поля и т. Д.), Поскольку различия в фотостабильности часто наблюдаются с одним и тем же белком, когда освещение создается дугой. -разрядная лампа против лазерной системы. Таким образом, с точки зрения фотостабильности, выбор флуоресцентных белков продиктован многочисленными параметрами, включая условия освещения, систему экспрессии и эффективность установки визуализации.

Потенциальный флуоресцентный белок FRET Partners

За последние несколько лет было разработано и доработано большое количество новых вариантов флуоресцентных белков, чтобы иметь профили излучения, охватывающие 200-нанометровый диапазон (от примерно 450 до 650 нанометров), тем самым заполняя многие пробелы, чтобы предоставить потенциально полезных партнеров FRET в каждом цветовом классе. Недавние достижения в разработке белков в синей (от 440 до 470 нанометров) и голубой (от 470 до 500 нанометров) спектральных областях позволили получить несколько новых зондов, которые могут быть полезны для визуализации и исследований FRET.Три группы инженерии белков сообщили об улучшенных вариантах флуоресцентного белка синей Aequorea, которые обладают значительно более высокой яркостью и фотостабильностью по сравнению с EBFP. Названные Azurite , SBFP2 (сильно усиленный синий FP) и EBFP2 (см. , таблица 1, ), эти белки дают первую реальную надежду на успешную долгосрочную визуализацию живых клеток в синей спектральной области, и все они могут применяться в сочетании с EGFP и производными в биосенсорах FRET.Самый яркий и самый фотостабильный из новых синих репортеров, EBFP2, демонстрирует типичное GFP-подобное поведение в слияниях и был продемонстрирован как отличный донор FRET для белков в зеленом спектральном классе. Все синие флуоресцентные белки можно легко визуализировать в флуоресцентном микроскопе с использованием стандартных наборов фильтров DAPI или запатентованных наборов BFP, доступных от производителей послепродажного обслуживания.

Флуоресцентные белки в голубой спектральной области широко применялись в качестве доноров FRET в сочетании с белками, излучающими желтый, и преобладали варианты исходного Aequorea ECFP до появления мономерного репортера бирюзового цвета, известного как мТФП1 .Флуоресцентный белок бирюзового цвета демонстрирует более высокую яркость и кислотную стабильность по сравнению с Aequorea CFP и является гораздо более фотостабильным. Высокий квантовый выход излучения mTFP1 (см. , таблица 1, ) обеспечивает отличную альтернативу циановым производным, mECFP и mCerulean, в качестве донора FRET в сочетании с желтыми или оранжевыми флуоресцентными белками. Дополнительные исследования позволили получить полезные белки в голубом спектральном классе. Среди недавно представленных улучшенных голубых флуоресцентных белков CyPet и улучшенный голубой вариант, названный Cerulean , наиболее перспективны в качестве кандидатов на использование тегов слияния, биосенсоров FRET и многоцветной визуализации.Церулеан как минимум в 2 раза ярче, чем ECFP, и в исследованиях FRET было продемонстрировано, что он значительно увеличивает контраст, а также отношение сигнал / шум в сочетании с флуоресцентными белками, излучающими желтый цвет, такими как Венера (см. Ниже). Вариант CFP под названием CyPet (от аббревиатуры: Cy — флуоресцентный белок P для передачи e nergy t ) был получен с помощью уникальной стратегии, использующей сортировку клеток с активацией флуоресценции ( FACS ) для оптимизации голубого цвета. и желтая пара для FRET.CyPet примерно вдвое слабее EGFP и на две трети ярче Cerulean, но при 37 градусах Цельсия экспрессирует относительно плохо. Однако CyPet имеет более смещенный в синий цвет и более узкий пик флуоресценции, чем CFP, что значительно увеличивает его потенциал для многоцветной визуализации.

Внедрение полезных мутаций сворачивания в мономерные варианты ECFP привело к производству новых вариантов с повышенной яркостью, эффективностью сворачивания, растворимостью и характеристиками FRET.Названные super CFP ( SCFP ), новые репортеры значительно ярче, чем родительский белок, когда они экспрессируются в бактериях, и почти в два раза ярче в клетках млекопитающих. Эти высокопроизводительные зонды должны быть полезны как для рутинных тегов слияния, так и для создания новых биосенсоров CFP-YFP FRET, демонстрирующих высокий динамический диапазон. Другой новый мономерный циан-репортер, TagCFP , был получен из GFP-подобного белка медузы Aequorea macrodactyla .Конкретные подробности о белке отсутствуют в литературе, но он коммерчески доступен в виде векторов для клонирования млекопитающих и слитых форм от Evrogen. Сообщается, что TagCFP ярче, чем ECFP и Cerulean, но имеет аналогичную кислотостойкость. Другой белок, выделяющий циан, Midoriishi-Cyan (сокращенно MiCy ) был первоначально разработан в качестве донора в новой комбинации FRET с мономерным Kusabira Orange ( mKO ; см. Таблица 1 ) для создания биосенсора. с высоким спектральным перекрытием (расстояние Фёрстера 5.3). Этот белок имеет самые длинные профили длины волны поглощения и излучения (472 и 495 нм соответственно), о которых сообщалось для любого зонда в голубой области спектра. Высокий молярный коэффициент экстинкции и квантовый выход, демонстрируемые MiCy, придают белку такую ​​же яркость, что и Cerulean.

Белковая пара	Максимум возбуждения донора (нм)	Максимум эмиссии акцептора (нм)	Квантовый выход донора	Коэффициент молярной экстинкции акцептора	Отношение яркости по Фёрстеру
EBFP2-mEGFP	383	507	0. 56	57,500	4,8	1: 2
ECFP-EYFP	440	527	0,40	83,400	4,9	1: 4
Cerberus	528	0,62	92,200	5,4	1: 2
MiCy-mKO	472	559	0,90	51,600				mKO	492	528	0.85	92,200	5,1	1: 1
CyPet-YPet	477	530	0,51	104,000	5,1	1: 4,5
	1: 4.5	E	610	0.60	72,000	5,1	2,5: 1
Venus-mCherry	528	610	0,57	72,000	908 5,7	72,000	528	581	0.57	138,000	5,9	1: 2
Venus-mPlum	528	649	0,57	41,000	5,2	13: 1
На сегодняшний день лучшим выбором для визуализации живых клеток репортеров FRET в классе зеленого цвета (от 500 до 525 нанометров) является производное GFP Emerald , которое имеет свойства, аналогичные его родительскому EGFP. Emerald содержит мутации F64L и S65T , представленные в EGFP, но вариант также имеет четыре дополнительных точечных мутации, которые улучшают сворачивание, экспрессию при 37 градусах Цельсия и яркость.Недавно появилось новое дополнение к зеленой области спектра — суперпапка GFP , которая ярче и устойчивее к кислотам, чем EGFP или Emerald, и имеет аналогичную фотостабильность. Следовательно, вариант суперпапки должен быть отличным кандидатом для слияния с белками млекопитающих и создания биосенсоров FRET, особенно тех, которые демонстрируют проблемы сворачивания со стандартными производными GFP. Другой ярко флуоресцентный репортер, который может быть хорошим кандидатом FRET, называется Azami Green , он был выделен из каменистого коралла Galaxeidae и продемонстрировал быстрое созревание во время экспрессии в линиях клеток млекопитающих.Кроме того, сообщалось о двух ярких мономерных репортерах GFP, полученных с помощью сайт-направленного и случайного мутагенеза в сочетании со скринингом библиотек в голубых белках. Произведенный от кораллов рода Clavularia , mWasabi является потенциальной альтернативой FRET-партнеру с зеленым излучением для синих флуоресцентных белков из-за незначительного поглощения при 400 нм и ниже, где часто возбуждаются синие варианты. Новый зеленый репортер коммерчески доступен (Allele Biotechnology) и должен быть особенно полезен для двухцветной визуализации в сочетании с белками с длинным стоксовым сдвигом (такими как T-Sapphire ), а также с тегом локализации в слияниях с целевыми белками.Производное TagCFP, названное TagGFP , представляет собой яркий и мономерный зеленый вариант, имеющий максимум поглощения при 482 нанометрах и излучение при 505 нанометрах. TagGFP, который лишь немного ярче EGFP, доступен в виде векторов клонирования и тегов слияния от Evrogen, но не был полностью описан в литературных отчетах. Желтые флуоресцентные белки (от 525 нанометров до 555 нанометров) являются одними из наиболее универсальных генетически закодированных зондов, которые когда-либо были разработаны, и должны предоставить кандидатов, действующих как доноры, так и акцепторы в парах FRET. Варианты, известные как Citrine и Venus , в настоящее время являются наиболее полезными белками в этом спектральном классе (см. , Таблица 1 ), но ни один из них не является коммерчески доступным. Другой вариант, названный в честь камня Topaz , доступен от Invitrogen и был полезен при локализации тегов слияния, внутриклеточной передаче сигналов и исследованиях FRET. Новый член коммерческой серии белков-репортеров локализации Evrogen «Tag», TagYFP , представляет собой производное мономерной медузы ( Aequorea macrodactyla ), которое немного менее яркое, чем EYFP, но на порядок более фотостабильно.Как и его партнеры, TagYFP (пик излучения при 524 нанометрах) не описан в литературе, но может быть приобретен как векторы для клонирования млекопитающих или теги слияния. Во время того же исследования сортировки клеток с активацией флуоресценции, которое привело к генерации CyPet (обсуждалось выше), был также получен эволюционно оптимизированный комплементарный акцептор FRET, названный YPet . Названный в честь его мастерства в FRET ( Y F P для e nergy t ransfer), YPet является самым ярким желтым вариантом из когда-либо созданных и демонстрирует приемлемую фотостабильность.Устойчивость к кислой среде, обеспечиваемая YPet, превосходит Венеру и другие производные YFP, что увеличивает применимость этого зонда в комбинациях биосенсоров, нацеленных на кислые органеллы. Однако, хотя оптимизированная комбинация CyPet-YPet должна быть предпочтительной отправной точкой при разработке новых биосенсоров FRET, остается серьезное сомнение в отношении происхождения повышенной производительности YPet, которая, вероятно, связана просто с усиленной димеризацией с его совместно развивающимися партнер, CyPet.Аналогичным образом, пригодность CyPet и YPet в тегах слияния для экспериментов по локализации, анализа бимолекулярной комплементации и других приложений еще не установлена. Оба белка существуют в растворе в виде слабых димеров, но предположительно могут быть преобразованы в истинные мономеры с использованием мутации A206K, которая так хорошо работала с другими вариантами Aequorea (хотя это, по-видимому, уничтожает их преимущества в FRET). Оранжевые флуоресцентные белки, все из которых были выделены из видов коралловых рифов, потенциально могут быть полезны в различных сценариях визуализации FRET.Возможно, наиболее универсальным из них является мономерный Kusabira Orange, белок, первоначально полученный в виде тетрамера из грибного коралла Fungia concinna (известного на японском языке как Kusabira-Ishi ). Мономерная версия Kusabira Orange (сокращенно mKO) была создана путем введения более 20 мутаций посредством сайт-направленного и случайного мутагенеза. Мономер (коммерчески доступный от MBL International) проявляет спектральные свойства, аналогичные тетрамеру, и имеет значение яркости, аналогичное EGFP, но немного более чувствительно к кислой среде, чем его родительский компонент.Однако фотостабильность этого репортера является одной из лучших среди белков во всех спектральных классах, что делает mKO отличным выбором для долгосрочных экспериментов по визуализации. Кроме того, спектральный профиль излучения достаточно хорошо отделен от голубых флуоресцентных белков, чтобы повысить эффективность FRET в биосенсорах, включающих mKO, и зонд полезен в многоцветных исследованиях с комбинацией голубых, зеленых, желтых и красных зондов. Рисунок 10 — Спаривание флуоресцентного белка FRET с дальним красным акцептором На рисунке 10 показаны спектральные профили ECFP (, рисунок 10 (a), ), EGFP (, рисунок 10 (b), ), EYFP (, рисунок 10 (c), ) и mOrange (, рисунок 10). (d) ), каждый из которых действует как донор FRET для mPlum, акцептора флуоресцентного белка с дальним красным излучением.Когда спектральные профили излучения доноров смещаются в сторону более длинных волн (от голубого к оранжевому), спектральное перекрытие (закрашенная серая область) и рассчитанное расстояние Ферстера ( R (0) ) соответственно увеличивается. Точно так же перекрестные помехи возбуждения и излучения (области, заштрихованные красным и синим цветом соответственно) также увеличиваются по мере уменьшения расстояния между длинами волн между пиками излучения донора и акцептора. Обратите внимание, что ECFP и mPlum демонстрируют лишь ограниченную степень перекрытия в спектрах возбуждения и практически никакого перекрытия в спектрах излучения.Напротив, когда mOrange сочетается с mPlum, наблюдается высокий уровень перекрестных помех как возбуждения, так и излучения. Поскольку цветовая палитра флуоресцентных белков продолжает расширяться, широкий спектр новых пар FRET должен стать легко доступным для исследователей. Производное mRFP1 , mOrange , немного ярче, чем mKO, но имеет менее 10 процентов фотостабильности, что серьезно затрудняет его применение для экспериментов, требующих повторной визуализации.Однако mOrange остается одним из самых ярких белков в оранжевом спектральном классе и по-прежнему является отличным выбором там, где интенсивность более важна, чем долговременная фотостабильность. Кроме того, в сочетании с T-сапфиром, излучающим зеленый цвет, mOrange является подходящей альтернативой белкам CFP-YFP в качестве пары FRET для создания более длинноволновых биосенсоров и может быть соединен с белками в других спектральных областях для многоцветных исследований. Теперь доступна улучшенная версия mOrange (названная mOrange2 ) с резко увеличенной фотостабильностью.Яркий новый мономерный белок оранжевого цвета, названный TagRFP , был недавно представлен в качестве кандидата для локализации и исследований FRET и может оказаться эффективным в большом количестве конструкций биосенсоров. Самым ярким флуоресцентным белком в любом спектральном классе является тандемная версия димера Tomato (dTomato), производного апельсина, который был одним из исходных белков Fruit . Белок томата содержит первые и последние семь аминокислот из GFP на концах N — и C — с целью повышения толерантности к гибридным белкам и уменьшения потенциальных артефактов в локализации, а также для повышения возможности его использования. в биосенсорах FRET.Тандемно-димерная версия (фактически мономер) была создана путем слияния двух копий dTomato «голова к хвосту» с линкером из 23 аминокислот. Благодаря наличию двойных хромофоров полученный tdTomato очень яркий и имеет исключительную фотостабильность. Основным недостатком использования этого белка является больший размер (вдвое больше мономерного белка), что может мешать упаковке слитого белка в некоторых биополимерах. Поиск идеального флуоресцентного белка, излучающего красный цвет, долгое время был целью визуализации живых клеток и целых животных с использованием биосенсоров FRET и слияния, в первую очередь из-за потребности в датчиках в этой спектральной области в экспериментах с многоцветной визуализацией, а также того факта, что что более длинные волны возбуждения вызывают меньшую фототоксичность и могут проникать глубже в биологические ткани.На сегодняшний день сообщается о широком спектре потенциально полезных красных зондов (излучение от 590 до 650 нанометров), многие из которых все еще страдают определенной степенью обязательной четвертичной структуры, обусловленной их разновидностями происхождения. В отличие от белков медуз, большинство природных и генно-инженерных вариантов белков коралловых рифов созревают очень эффективно при 37 градусах Цельсия. Обширные усилия по исследованию мутагенеза, включая недавно внедренную методологию, были успешно применены в поисках вариантов флуоресцентных белков желтого, оранжевого, красного и дальнего красного цвета, которые дополнительно снижают тенденцию этих потенциально эффективных биологических зондов к самоассоциации, одновременно вызывая выбросы. максимумы в сторону более длинных волн.В результате были улучшены мономерные белки с повышенными коэффициентами экстинкции, квантовыми выходами и фотостабильностью, хотя ни один вариант еще не был оптимизирован по всем критериям. Красные белки mFruit , mApple , mCherry и mStrawberry (пики эмиссии при 592, 610 и 596 нанометрах соответственно) имеют уровни яркости от 50 до 110 процентов EGFP, но mpple и mCherry гораздо более фотостабильны, чем mStrawberry, и являются лучшим выбором для замены mRFP1 в долгосрочных экспериментах по визуализации. Дальнейшее расширение спектрального класса белков mFruit за счет итеративной соматической гипермутации привело к появлению двух новых флуоресцентных белков с максимумами длины волны излучения 625 и 649 нанометров, представляющих первые настоящие дально-красные зонды, созданные генной инженерией. Наиболее потенциально полезный зонд в этой паре был назван mPlum , который имеет довольно ограниченное значение яркости (10 процентов от EGFP), но отличную фотостабильность. Этот мономерный зонд должен быть полезен в сочетании с вариантами, излучающими в голубой, зеленой, желтой и оранжевой областях, для экспериментов с многоцветной визуализацией, а также в качестве биосенсора FRET-партнера с зелеными и желтыми белками, такими как изумруд и цитрин (см. , рис. 10, ). .Несколько дополнительных красных флуоресцентных белков, показывающих разную степень перспективности, были выделены из организмов рифовых кораллов. Применение сайт-специфического и случайного мутагенеза к вариантам TurboRFP с последующим скринингом мутаций, проявляющих дальнюю красную флуоресценцию, привело к димерному белку, названному Катушка (максимум эмиссии 635 нанометров). Хотя яркость «Катушки» составляет всего две трети от EGFP, она демонстрирует самые высокие уровни яркости среди всех флуоресцентных белков в спектральном окне, охватывающем от 650 до 800 нанометров, что важно для визуализации глубоких тканей.Введение четырех основных мутаций катушки в TagRFP привело к получению мономерного белка дальнего красного цвета, названного mKate , который имеет сходные спектральные характеристики. Сообщается, что фотостабильность mKate является исключительной, и белок показывает яркость, аналогичную яркости mCherry, что делает его отличным кандидатом для экспериментов по локализации и FRET в дальней красной части спектра. Несмотря на значительные успехи в расширении флуоресцентной цветовой палитры на оранжевую, красную и далекую красные области спектра, голубой и желтый Производные Aequorea остаются наиболее полезным сценарием сочетания для разработки полезных биосенсоров.Это непредвиденное несоответствие происходит из-за того, что большинство белков, полученных из оранжевого и красного коралла, демонстрируют относительно широкий спектральный профиль поглощения с длинным хвостом возбуждения, который простирается в фиолетовую и голубую области, таким образом вызывая прямое возбуждение акцептора. Другой фактор, который может иметь значение, — это относительная скорость созревания слитых флуоресцентных белков-партнеров. В большинстве случаев варианты, полученные из белков Aequorea , созревают гораздо быстрее, чем варианты, полученные из рифовых кораллов, поэтому возможно, что незрелые акцепторы вносят вклад в слабую сенсибилизированную эмиссию, проявляемую многими белками, полученными из кораллов.Кроме того, широкие спектры адсорбции оранжевого и красного белков в сочетании со сниженными квантовыми выходами мономерных версий, вероятно, затрудняют их использование в FRET. Будущий успех экспериментального дизайна флуоресцентного белка FRET будет сосредоточен, среди прочего, на согласовании скорости созревания парных белков. Выводы Хотя эксперименты FRET, основанные на вездесущем семействе флуоресцентных белков, предлагают огромный потенциал для выявления молекулярной динамики в живых клеточных системах, идеальной пары FRET пока нет. Оптимизированные версии CFP и YFP по-прежнему обеспечивают наиболее эффективную пару для общего использования, хотя лучшие комбинации могут появиться на горизонте. Точно так же не существует совершенной техники для измерения FRET, хотя все описанные выше подходы имеют сильные стороны, которые можно использовать в зависимости от конкретной исследуемой экспериментальной ситуации. По мере того, как становятся доступными более оптимизированные флуоресцентные белки, включая ярко-красные варианты, которые могут быть подходящими в качестве акцепторов для доноров GFP или YFP, FRET, использующий флуоресцентные белки, должен стать еще более полезным для исследований взаимодействия белок-белок в живых клетках.Как обсуждалось, широкие спектры поглощения текущей палитры красных флуоресцентных белков, в дополнение к более низким квантовым выходам мономерных версий, затрудняют использование этих кандидатов в FRET. Тем не менее, быстрые темпы усовершенствования флуоресцентных белков вселяют оптимизм в отношении того, что такие белки будут доступны в ближайшем будущем, и помогут произвести дальнейшую революцию в этом новом подходе к выяснению внутриклеточных биохимических механизмов. Флуоресцентный резонансный перенос энергии — Chemistry LibreTexts Флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET) — это специальный метод измерения расстояния между двумя хромофорами, называемый парой донор-акцептор.Ограничение FRET состоит в том, что этот процесс переноса эффективен только тогда, когда расстояние между донорно-акцепторной парой меньше 10 нанометров. Однако FRET — это явление, сильно зависящее от расстояния, и поэтому он стал популярным инструментом для измерения динамической активности биологических молекул в наномасштабе. Введение FRET — это аббревиатура от Förster (Flourescence) Resonance Energy Transfer. Передача энергии по Фёрстеру — это явление, при котором возбужденный донор передает энергию (не электрон) акцепторной группе посредством безызлучательного процесса.Этот процесс сильно зависит от расстояния, что позволяет исследовать биологические структуры. Одним из распространенных приложений является простое измерение расстояния между двумя интересующими позициями на большой молекуле, обычно биологической макромолекуле, путем присоединения соответствующих донорно-акцепторных групп к большой молекуле. Если большая молекула включает только одного донора и одну акцепторную группу, расстояние между донором и акцептором можно легко измерить, если в этом процессе нет конформационных изменений.Кроме того, если молекула имеет огромное конформационное изменение, можно также измерить динамическую активность между двумя сайтами на этой макромолекуле, например, взаимодействия белков. Сегодня этот метод широко применяется во многих областях, таких как эксперименты с одной молекулой, молекулярные двигатели, биосенсоры и механические движения ДНК. FRET также называют «спектроскопической линейкой» из-за его внутреннего удобства. Общая картина FRET Теоретический анализ был хорошо разработан Теодором Ферстером.Этот механизм безызлучательного переноса схематически представлен на рисунке 1. Донорная группа (D) возбуждается фотоном, а затем релаксирует в самое низкое возбужденное синглетное состояние, S 1 (по правилу Каша). Если акцепторная группа находится не слишком далеко, энергия, высвобождаемая, когда электрон возвращается в основное состояние (S 0 ), может одновременно возбуждать донорную группу. Этот безызлучательный процесс называется «резонансом». После возбуждения возбужденный акцептор излучает фотон и возвращается в основное состояние, если другие состояния тушения не существуют. Рис. 1. Принципиальная схема F ö rster Резонансная передача энергии Резонансный механизм связан с кулоновским взаимодействием между электронами. Таким образом, относительное расстояние кулоновского взаимодействия между парой донор-акцептор может быть больше, чем передача энергии электронного обмена, которая требует перекрытия волновых функций, а именно передачи энергии Декстера. Кулоновское взаимодействие требует только перекрытия спектра, что означает идентичность резонансной энергии. Рисунок 2 здесь дает представление о том, что такое резонансный механизм. (Обратите внимание, что зазор HOMO-LUMO не равен разности энергий между основным состоянием и самым низким возбужденным состоянием молекулы.) Рисунок 2: Принципиальная схема кулоновских взаимодействий Факторы, влияющие на FRET Эффективность FRET (\ (E \)) — квантовый выход перехода с переносом энергии; то есть доля события передачи энергии, приходящейся на событие возбуждения донора . 6} \ tag {2} \] где \ (r \) — расстояние между донорными и акцепторными хромофорами, а \ (R_o \) — характерное расстояние (расстояние Ферстера или радиус Ферстера) с эффективностью передачи 50% Перекрытие спектра Для повышения эффективности FRET группа доноров должна обладать хорошими способностями поглощать фотоны и излучать фотоны.Это означает, что донорная группа должна иметь высокий коэффициент экстинкции и высокий квантовый выход. Наложение спектра излучения донора и спектра поглощения акцептора означает, что энергия, потерянная от возбужденного донора до основного состояния, может возбуждать акцепторную группу. Согласование энергии называется явлением резонанса. Таким образом, чем больше перекрытие спектров, тем лучше донор может передавать энергию акцептору. Интеграл перекрытия J (λ) между донором и акцептором означает перекрытие спектров, как показано на , рис. 3, .4 д \ lambda \ tag {3} \], где F D (λ) — нормированный спектр излучения донора \ (\ epsilon_ {A} «)}} стандартов для молярного коэффициента поглощения акцептора и λ — длина волны. Ориентация переходных диполей На механизм резонансной передачи энергии также влияют ориентации диполя эмиссионного перехода донора и диполя поглощения акцептора.Параметр ориентации κ 2 дает количественное значение взаимодействия между двумя дипольными моментами. κ 2 теоретически может принимать значения от 0 (когда диполи перпендикулярны друг другу) до 4 (когда диполи коллинеарны). κ 2 равно 1, когда эти два переходных диполя параллельны. Ориентация переходных диполей показана на Рис. 4. Для свободно вращающейся группы доноров и акцепторов среднее значение κ 2 трактуется как 2/3. Расстояние Фёрстера (R 0 ) Длинный R 0 может привести к высокой эффективности FRET.{-4} \ tag {4} \] Таблица 1: Расстояния Ферстера различных донорно-акцепторных пар. Донор Приемник Расстояние Фёрстера (R0, нм) Нафталин Дансил 2,2 LY TNP-ATP 3,5 Дансил ODR 4.3 LY EM 5,3 FITC EM 6,0 BPE CY5 7,2 Сокращения: BPE , B-фикоэритрин; CY5 , карбоксиметилиндоцианин; Dansyl , просто дансильная группа; EM , малеимид эозина; FITC , фторцеин-5-изотиоцианат; LY , желтый Люцифер; ODR , октадецилродамин; TNP-ATP , тринитрофенил-ATP. Заключение и ограничения FRET FRET обеспечивает эффективный способ измерения расстояния между донорным и акцепторным хромофором. На эффективность передачи энергии сильно влияет соотношение R и R 0 из-за экспоненты 6. Таким образом, измеряя эффективность FRET, можно легко получить точное расстояние между донором и акцептором. При правильном выборе донора и акцептора этот эксперимент также можно провести in vivo .Однако FRET дает информацию только о расстояниях. Если происходят драматические конформационные изменения, такие как удлинение или изгиб, невозможно узнать точное движение донора и акцептора. Кроме того, прикрепление хромофоров к точным участкам макромолекулы также важно, как по количеству хромофоров, так и по положению макромолекулы, иначе FRET может создавать шумовые сигналы. (См. Вопрос 5) Внешние ссылки 1. Онлайн-лекция профессора Пола Р.Селвин, профессор физики UIUC. Лекция охватила все фундаментальные аспекты FRET и объяснила классические эксперименты, связанные с FRET. http://nanohub.org/resources/4333 2. Первая серия международных лекций Теодора Ферстера в Кембриджском университете. Серия содержит вопросы, относящиеся к фундаментальным знаниям о современных приложениях. Кембриджский университет записал все лекции и загрузил их на сайт. laser.ceb.cam.ac.uk/foerster/ Проблемы Вопрос 1 Нить F-актина состоит из мономеров G-актина.Прикрепив хоромофор донора (D) или акцептора (A) к мономеру G-актина и измерив эффективность передачи энергии для измерения среднего расстояния между мономерами G-актина в филаменте F-актина (при условии, что мономеры в норме расположены в последовательности DADADADA ….), и обнаруживается, что средняя эффективность передачи энергии составляет 23%. Если R 0 составляет 4,5 нм, каково среднее расстояние между мономерами в нити? (Вопросы 1 и 2 отредактированы из интересной статьи, которая визуализировала равновесие F-актина и G-актина с помощью техники FRET. 9 ) Вопрос 2 На основании вопроса 1, если последовательность филаментов состоит из 8 мономеров в порядке DADADADA, сколько видов эффективности может быть обнаружено, если филамент не изгибается, а R 0 достаточно велик, чтобы увидеть их все ? Вопрос 3 Пара cy3-дорнор и cy5-акцептор прикреплена к финалам последовательности ДНК.Если игнорировать ориентацию переходных диполей донора и акцептора, нарисуйте зависимость между отношением (R / R 0 ) и эффективностью передачи энергии. Вопрос 4 Воспользуйтесь примером из вопроса 3, а теперь рассмотрите ориентацию переходных диполей. Постройте зависимость между разделительным расстоянием между донорно-акцепторной парой и эффективностью передачи энергии. (Помните, что при удлинении ДНК путем добавления пар оснований ориентация донорных и акцепторных хромофоров изменится) (Вопросы 3 и 4 переработаны из статьи, в которой измерялась зависимость ориентации в процессе FRET с использованием спирали ДНК. 10 ) Вопрос 5 Одна из наиболее сложных проблем в области ионных каналов — это наблюдение за тем, как канал работает in vivo и конформационным изменением канала, встроенного в клеточную мембрану. Если ученый хочет исследовать движение ворот ионного канала с помощью FRET, какие факторы следует учитывать? Например, как правильно привязать донор и акцептор к точному положению ворот канала.(Вопрос 5 переработан из этого документа 11 .) Ключи 5,5 нм. Будет обнаружено 4 вида эффективности. См. Веб-сайт профессора Тэкджип Ха. Https://netfiles.uiuc.edu/tjha/www/newTechnique.html См. PNAS, август 2008 г., 105 (32), 11176-11181, DOI: 10.1073 / pnas.0801707105 Открытый вопрос. Пожалуйста, обратитесь к этой вводной статье об использовании FRET для исследования движения ионных каналов.Биофизический журнал, 2003, январь, 84 (1), 1-2, DOI: 10.1016 / S0006-3495 (03) 74827-9 Сноски PNAS, декабрь 2006 г., 103 (49), 18458-18463, DOI: 10.1073 / pnas. 0605422103 PNAS, ноябрь 2008 г., 105 (47), 18337-18342, DOI: 10.1073 / pnas.0800977105 Nature Biotechnology 2003, 21, 1387-1395, DOI: 10.1038 / nbt896 PNAS, октябрь 2009 г., 106 (42), 17741-17746, DOI: 10.1073 / pnas.07106 Nature, 1997 август, 388, 882-887 PNAS, декабрь 2006 г., 103 (51) 19217-19218, DOI: 10.1073 / pnas.06003 PNAS, 1967 августа, 58 (2), 719-26. DOI: 10.1073 / pnas.58.2.719 Аналитическая биохимия, апрель 1994 г., 218 (1), 1-13, DOI: 10.1006 / abio.1994.1134 Протоколы природы, 2006 г., 1 августа, 911–919, DOI: 10.1038 / nprot.2006.122 PNAS, август 2008 г., 105 (32), 11176-11181, DOI: 10.1073 / pnas.0801707105 Биофизический журнал, 2003, январь, 84 (1), 1-2, DOI: 10.1016 / S0006-3495 (03) 74827-9 FRET Отображение в трехмерных гидрогелях Получение изображений с резонансным переносом энергии по Фёрстеру (FRET) — мощный инструмент для исследований клеточной биологии в реальном времени.Здесь представлен метод визуализации клеток FRET в физиологических трехмерных (3D) микроокружениях гидрогеля с использованием традиционной эпифлуоресцентной микроскопии. Описан анализ ратиометрических зондов FRET, который дает линейные отношения в диапазоне активации. Общая цель этого экспериментального метода состоит в том, чтобы сделать возможным изучение внутриклеточной передачи сигналов в реальном времени с использованием изображений FRET клеток, встроенных в трехмерные гидрогели, имитирующие естественные ткани.Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биологии развития, фармакологии и регенеративной медицины, такие как разработка оптимальных биоматериалов и высокопроизводительный скрининг лекарств в созданных трехмерных микротканях. Основное преимущество этого метода заключается в том, что FRET можно использовать на большом количестве клеток в различных типах гидрогелей с использованием обычных систем широкоугольных микроскопов. После изготовления форм для отливки гидрогеля и суспендирования культивируемых клеток в растворе гидрогеля, в соответствии с текстовым протоколом, в вытяжном шкафу для культивирования тканей добавьте клетки, содержащие предшественник, в формы для отливки, используя стерильную технику.Перед сшивкой центрифугируйте клетки, суспендированные в предшественнике гидрогеля, чтобы оптимизировать визуализацию, ограничивая клетки одной фокальной плоскостью и минимизируя сигнал вне плоскости. Затем, чтобы сшить гидрогели ПК, используйте источник света UVA для времени воздействия, равного 3,2 джоулей на квадратный сантиметр на миллиметр толщины, чтобы облучить клетки, содержащие предшественник. Или используйте менее дорогую ручную стоматологическую лампу. Избегайте передержки гидрогеля, так как это снизит жизнеспособность клеток.Вместо этого физически сшивающие гидрогели помещают при 37 градусах Цельсия. После сшивания удалите литейную форму гидрогеля PDMS и замените ее ранее подготовленной чашкой PDMS. С помощью стерильного шпателя прижмите PDMS к стеклу, чтобы оно приклеилось. Добавьте бессывороточную среду без фенола или среду определенного химического состава в лунку, созданную в чашке для PDMS, с покровным стеклом, чтобы гидрогель оставался погруженным. Инкубируйте чашку при 37 градусах Цельсия в течение 30 минут. После того, как чашка PDMS с гидрогелем была закреплена на предметном столике микроскопа и на объектив было нанесено масло, используйте проходящий свет, чтобы найти не менее 15 клеток для визуализации, и проверьте трансфекцию с помощью флуоресцентной визуализации.В программном обеспечении микроскопа настройте параметры камеры для каналов изображения FRET, выбрав одну из нескольких ячеек рядом с центром поля зрения, и оптимизируйте экспозицию и усиление для каждого канала изображения в соответствии с текстовым протоколом. Выбирайте ячейки, расположенные близко к центру гидрогеля, в относительно плоском поле освещения, которые не являются ни слишком яркими, ни слишком тусклыми, и с отношением FRET от 00 до 1,0. Затем выберите несколько полей зрения, чтобы получить изображения по крайней мере 15 трансфицированных клеток.По завершении выключите свет, чтобы ограничить экспозицию. Чтобы настроить скорость захвата для получения покадрового изображения, введите периодичность захвата. Используйте высокую скорость для захвата базового сигнала, например каждые пять секунд на поле зрения, и более низкую скорость для последующей долгосрочной кинетики передачи сигналов. Выберите «Запустить сейчас», чтобы начать получение изображения и сделать снимок в течение пяти минут, чтобы установить базовый уровень для реакции датчика в указанном поле обзора. Через пять минут после получения изображения внесите пипеткой нужный агонист или антагонист, перемешайте пипеткой и продолжите визуализацию.После выполнения калибровки FRET в соответствии с текстовым протоколом, в программном обеспечении микроскопа выберите стрелку на значке интересующей области фона и выберите «Нарисовать эллиптическую фоновую область интереса». Нарисуйте и обозначьте одну интересующую область или область интереса для каждого поля обзора рядом с ячейками, чтобы определить уровень фона. Убедитесь, что выбран параметр «Продолжать обновление смещения фона», затем включите просмотр интересующей фоновой области, щелкнув значок «Фоновая область интереса».В качестве альтернативы, выберите значок интересующей области и установите свойства области интереса как Использовать в качестве фоновой области интереса, а интересующие области различны в каждой многоточечной точке. Используя фоновый значок интересующей области, выберите «Вычесть фон, используя интересующую область». Во всплывающем окне в разделе «Вычесть интересующую область фона» выберите «Каждое изображение», а в разделе «Применить к» выберите «Все кадры». Для каждого поля обзора, чтобы определить интересующую область вокруг ячейки, используя канал излучения акцептора и двоичную маску, используйте меню «Двоичный», «Определить порог» и выберите «Применить к текущему кадру».Затем настройте нижний порог, чтобы выбрать ячейки. Затем используйте функцию «Бинарное закрытие», чтобы при необходимости заполнить пробелы в бинарной маске. Затем с помощью значка «Область интереса» выберите «Копировать двоичный файл в область интереса», чтобы сохранить двоичную маску в качестве области интереса. Добавьте области интереса для последующих полей зрения к существующему пулу областей интереса. Удалите любые ложные области интереса. Затем щелкните правой кнопкой мыши интересующие области и убедитесь, что их свойства — «Использовать в качестве стандартной области интереса», а области интереса различны в каждой многоточечной точке.Область интересов ячеек можно нарисовать от руки, но следует позаботиться о том, чтобы удалить ложные значения. Протокол содержит процедуры для клеток, находящихся за пределами плоского поля освещения, и для микроскопов, у которых нет плоского поля. Центрифугирование предшественников гидрогеля перед гелеобразованием увеличивало количество клеток в одной фокальной плоскости вблизи покровного стекла. Это минимизировало фоновый шум и увеличило скорость обработки изображений. В этом эксперименте FRET для расчета погашенного излучения, или QE, расчета отношения FRET, для одноцепочечного бинарного зонда ICUE1 требовалось только два изображения, включая QE, равное CFP CFP для возбуждения и излучения, а излучение акцептора равно YFP YFP для возбуждения и эмиссия.Было выбрано несколько полей зрения, в которых несколько ячеек находились в пределах однородной освещенной области, как показано здесь. Области интереса для фоновой коррекции сигналов каналов и для клеточного анализа были определены с использованием изображений эмиссии акцепторов с пороговыми значениями с начала экспериментов. Кроме того, как показано здесь, были отобраны клетки, экспрессирующие достаточное количество зонда. Были рассчитаны отношения QE и сенсибилизированного излучения FRET на пиксель и среднее отношение FRET на ячейку. Было рассчитано обратное отношение SE, и оба отношения были нормализованы. При стимуляции форсколином соотношения Fret на основе QE и SE определяют повышенную активность циклического АМФ в хондроцитах. Как физически сшитые, так и химически сшитые гели показали увеличение соотношения QE FRET с течением времени, что указывает на усиленный ответ передачи сигналов циклического АМФ на добавление форсколина. Эту процедуру можно использовать с другими методами микроскопии, такими как FRAP, измерение ладов, ладов и анизотропии, чтобы ответить на такие вопросы, как различия в проницаемости и выделении клеток между разными типами микротканей. Поскольку сшивание прекращается рядом с ПДМС, важно помнить, что проектировать формы для фото-сшивающих гидрогелей немного больше по диаметру, чем сами гидрогели. Определение ладов Мерриам-Вебстера \ ˈfret \ переходный глагол 1a : есть или грызть : разъедают также : изнашиваются Кислота раздражает металл. b : руб, натереть Ремень сбруи трогал коня. c : получить путем истирания вещества поток беспокоил канал 2 : , чтобы вызвать эмоциональное напряжение : Досада, не волнуйтесь обо мне — JC Powys 3 : , чтобы скоротать (время) на раздражение бедного игрока, который торопится и беспокоит его час на сцене — Уильям Шекспир непереходный глагол 1a : чтобы съесть что-то b : , чтобы воздействовать на что-то, как если бы грызть или кусать : раздражать… настойчивый голос раздражал на нервы — Грэхем Грин b : натерла его спина, где натерли ремни безопасности, начала беспокоить. 3a : раздражаться или беспокоиться беспокойство из-за высокой стоимости прокорма своих семей — Вэнс Паккард b проточной воды : чтобы волноваться ручей , истирающий по скалам 1a : действие истирания : эрозия b : изношенное или размытое пятно переходный глагол 1a : для украшения переплетенными узорами : , чтобы сформировать узор на 2 : , чтобы обогатить тисненым или вырезанным резным узором 1 : орнаментальную сеть, особенно : средневековую металлическую или украшенную драгоценностями сетку для женского головного убора 2 : орнамент или орнаментальное произведение, часто рельефное, состоящее из небольших прямых полос, пересекающихся друг с другом под прямым или наклонным углом : один из ряда выступов, закрепленных на грифе струнного музыкального инструмента (например, гитары) Скрининг для белок-белковых взаимодействий с использованием резонансного переноса энергии Фёрстера (FRET) и флуоресценции Электронная микроскопия с визуализацией при жизни (FLIM) 1 Eggeling, C., Виллиг, К. И., Сахл, С. Дж. И Хелл, С. В. Флуоресцентная наноскопия на основе линз. кварт. Rev. Biophys. 48 , 178–243 (2015). CAS Google ученый 2 Паттерсон, Дж., Дэвидсон, М., Мэнли, С. и Липпинкотт-Шварц, Дж. Визуализация сверхвысокого разрешения с использованием локализации одной молекулы. Annu. Rev. Phys. Chem. 61 , 345–367 (2010). CAS PubMed PubMed Central Google ученый 3 Занелла, Ф., Lorens, J. B. & Link, W. Скрининг высокого содержания: увидеть — значит поверить. Trends Biotechnol. 28 , 237–245 (2010). CAS PubMed Google ученый 4 Ярес-Эриджман, Э. А. и Джовин, Т. М. Визуализация молекулярных взаимодействий в живых клетках с помощью микроскопии FRET. Curr. Мнение. Chem. Биол. 10 , 409–416 (2006). CAS PubMed Google ученый 5 Хоппе, А., Кристенсен, К. и Свансон, Дж. А. Стехиометрия на основе флуоресцентного резонансного переноса энергии в живых клетках. Biophys. J. 83 , 3652–3664 (2002). ADS CAS PubMed PubMed Central Google ученый 6 Чен, Х., Пуль, 3-й Х. Л., Кушик, С. В., Фогель, С. С. и Икеда, С. Р. Измерение эффективности FRET и отношения концентрации донора к акцептору в живых клетках. Biophys, J. 91 , L39–41 (2006). CAS Google ученый 7 Бадер, А.Н., Хофман, Э.Г., ван Берген эн Хенегувен, П.М.П. и Герритсен, Х.С. Получение изображений размеров белковых кластеров с помощью конфокальной флуоресцентной анизотропной микроскопии с временной синхронизацией. Опт. Экспресс 15 , 6934–6945 (2007). ADS CAS PubMed Google ученый 8 Уоррен, С.К., Марджиняну, А., Катан, М., Дансби, С. и Френч, П. М. В. Биосенсоры на основе Homo-FRET и их применение для мультиплексной визуализации сигнальных событий в живых клетках. Внутр. J. Mol. Sci. 16 , 14695–14716 (2015). CAS PubMed PubMed Central Google ученый 9 Мэтьюз, Д. Р. и др. Многофункциональный подход к визуализации для скрининга взаимодействия белков с высоким содержанием. PLoS ONE 7 , e33231 (2012). ADS CAS PubMed PubMed Central Google ученый 10 Флуоресцентная спектроскопия на протяжении всей жизни и визуализация: принципы и приложения Eds. Марку Л., Френч П. М. У., Элсон Д. С., CRC Press, стр. 1–322, (2015). 11 Kumar, S. et al. Технология FLIM FRET для открытия лекарств: автоматизированный многолуночный анализ с высоким содержанием, мультиплексированные считывания и приложение in situ . ChemPhysChem 12 , 609–626 (2011). CAS PubMed PubMed Central Google ученый 12 Köllner, M. & Wolfrum, J. Сколько фотонов необходимо для измерения времени жизни флуоресценции? Chem. Phys. Lett. 200 , 199–203 (1992). ADS Google ученый 13 Дигман, М., Кайолфа, В. Р., Замай, М.& Грэттон, E. Подход векторов к анализу изображения времени жизни флуоресценции. Biophys. J. 94 , L14–16 (2008). CAS PubMed Google ученый 14 Эйхорст, Дж. П., Тенг, К. В. и Клегг, Р. М. Представление полярной диаграммы флуоресценции с временным разрешением, в «Флуоресцентная спектроскопия и микроскопия: методы и протоколы», Методы в молекулярной биологии Eds. Энгельборгс, Ю., Виссер, А.J. W. G. vol. 1076, Springer Science + Business Media, стр. 97–112 (2014). 15 Chan, J. J. et al. Сравнительный анализ взаимодействий РАССФ1-10. Adv. Биол. Regul. 53 , 190–201 (2013). CAS PubMed PubMed Central Google ученый 16 Шил, Х. и Хофманн, К. Новый мотив взаимодействия, SARAH, связывает три класса опухолевых супрессоров. Curr. Биол. 13 , R899 – R900 (2003). CAS PubMed Google ученый 17 Oh, H. J. et al. Роль опухолевого супрессора RASSF1A в Mst1-опосредованном апоптозе. Cancer Res. 66 , 2562–2569 (2006). CAS PubMed Google ученый 18 Praskova, M., Khoklatchev, A., Ortiz-Vega, S. & Avruch, J. Регулирование киназы MST1 с помощью аутофосфорилирования, белков, ингибирующих рост, RASSF1 и NORE1, и Ras. Biochem J. 381 , 453–462 (2004). CAS PubMed PubMed Central Google ученый 19 Хохлатчев А. и др. Идентификация нового Ras-регулируемого проапоптотического пути. Curr. Биол. 12 , 253–265 (2002). CAS PubMed Google ученый 20 Guo, C. et al. RASSF1A является частью комплекса, подобного сети супрессоров опухолей Drosophila Hippo / Salvador / Lats. Curr. Биол. 17 , 700–705 (2007). CAS PubMed Google ученый 21 Ikeda, M. et al. Белок 6 семейства Ras-ассоциативных доменов индуцирует апоптоз как через каспазозависимые, так и независимые от каспаз пути. Exp. Cell Res. 313 , 1484–1495 (2007). CAS PubMed Google ученый 22 Икеда, М.и другие. Зависимые и независимые от пути бегемотика роли RASSF6. Sci. Сигнал 2 , ra59 (2009). PubMed Google ученый 23 Del Re, D. P. et al. Проапоптотическая передача сигналов Rassf1A / Mst1 в сердечных фибробластах защищает мышей от перегрузки давлением. J. Clin. Вкладывать деньги. 120 , 3555–67 (2010). CAS PubMed PubMed Central Google ученый 24 Park, J.и другие. Семейство 5 ассоциативных доменов ras-супрессоров опухолей (RASSF5 / NORE1) опосредует апоптоз, индуцированный лигандом рецептора смерти. J. Biol. Chem. 285 , 35029–38 (2010). CAS PubMed PubMed Central Google ученый 25 Sherwood, V., Recino, A., Jeffries, A., Ward, A. & Chalmers, AD Семейство N-концевых RASSF: новая группа белков, содержащих Ras-ассоциативный домен, с возникающими связями к образованию рака. Biochem. J. 425 , 303–311 (2010). CAS Google ученый 26 Hwang, E. et al. Структурное понимание димерного взаимодействия доменов SARAH из белков семейства Mst1 и RASSF в пути апоптоза. Proc. Nat. Акад. Sci. США 104 , 9236–9241 (2007). ADS CAS PubMed Google ученый 27 Ni, L.и другие. Структурная основа аутоактивации киназы Mst2 человека и ее регуляция с помощью RASSF5. Структура 21 , 1757–1768 (2013). CAS PubMed PubMed Central Google ученый 28 Hwang, E. et al. Структурная основа гетеродимеризации доменов MST и RASSF SARAH в сигнальном пути Hippo. Acta Crystallogr. D Biol. Кристаллогр. 70 , 1944–1953 (2014). CAS PubMed PubMed Central Google ученый 29 Miertzschke, M. et al. Характеристика взаимодействий адаптерного белка RAPL / Nore1B с RAP GTPases и их роль в миграции Т-клеток. J. Biol. Chem. 282 , 30629–30634 (2007). CAS PubMed Google ученый 30 Stieglitz, B. et al. Установлен новый тип эффекторного взаимодействия Ras между опухолевым супрессором NORE1A и переключателем Ras II. EMBO J. 27 , 1995–2005 (2008). CAS PubMed PubMed Central Google ученый 31 Rodriguez-Viciana, P., Sabatier, C. & McCormick, F. Специфичность передачи сигналов GTPases семейства Ras определяется полным спектром эффекторов, которые они регулируют. Мол. Cell. Биол. 24 , 4943–54 (2004). CAS PubMed PubMed Central Google ученый 32 Авруч, Ю., Праскова, М., Ортис-Вега, С., Лю, М. и Чжан, X. F. Регулирование пролиферации клеток и киназ MST1 / 2 с помощью Nore1 и RASSF1. Methods Enzymol. 407 , 290–310 (2006). CAS PubMed Google ученый 33 Ciani, B. et al. Молекулярная основа специфичности состояния олигомеризации спиральной спирали. Proc. Natl. Акад. Sci. США 107 , 19850–19855 (2010). ADS CAS PubMed Google ученый 34 Moutevelis, E.И Вулфсон, Д. Н. Периодическая таблица спиральных белковых структур. J. Mol. Биол. 385 , 726–32 (2009). CAS PubMed Google ученый 35 Warren, S.C. et al. Быстрая глобальная подгонка наборов данных микроскопии для визуализации с большим временем жизни флуоресценции. PLoS ONE 8 , e70687 (2013). ADS CAS PubMed PubMed Central Google ученый 36 Рааб, М., Smith, X., Matthess, Y., Strebhardt, K. & Rudd, C. E. PH домен белка SKAP1 определяет локализацию мембраны RapL и образование комплекса белка Rap1 для активации Т-клеточного рецептора (TCR) LFA-1. J. Biol. Chem. 286 , 29663–29670 (2011). CAS PubMed PubMed Central Google ученый 37 Барлоу Д. Дж. И Торнтон Дж. М. Геометрия спирали в белках. J. Mol. Биол. 201 , 601–619 (1988). CAS PubMed Google ученый 38 Фогель, С. С., Нгуен, Т. А., ван дер Меер, Б. В. и Бланк, П. С. Влияние гетерогенности и темных акцепторных состояний на FRET: последствия использования флуоресцентных доноров и акцепторов белков. PLoS ONE 7 , e49593 (2012). ADS CAS PubMed PubMed Central Google ученый 39 Котуренкене, А.Молекулярная основа апоптотической передачи сигналов Ras через мультибелковый комплекс Nore1-MST1. Кандидатская диссертация, Бохумский университет (2008 г.). 40 Константинеску Aruxandei, D., Makbul, C., Koturenkiene, A., Ludemann, MB & Herrmann, C. Индуцированное димеризацией сворачивание MST1 SARAH и влияние внутренне неструктурированного ингибирующего домена: низкая термодинамическая стабильность мономер. Биохимия 50 , 10990–1000 (2011). CAS PubMed Google ученый 41 Макбул, К.и другие. Структурные и термодинамические характеристики Nore1-SARAH: небольшой спиральный модуль, важный в сетях передачи сигналов. Биохимия 52 , 1045–1054 (2013). CAS PubMed Google ученый 42 Сонг, Ю., Мадахар, В. и Ляо, Дж. Развитие метода FRET для создания платформ для количественного и высокопроизводительного скрининга белок-белковых взаимодействий. Ann. Биомед.Англ. 39 , 1224–1234 (2010). PubMed PubMed Central Google ученый 43 Сонг, Ю., Роджерс, В. Г. Дж., Шульц, Дж. С. и Ляо, Дж. Определение аффинности взаимодействия белков с помощью количественной технологии FRET. Biotechnol. Bioeng. 109 , 2875–2883 (2012). CAS PubMed Google ученый 44 Чакраборти, С., Hu, S.-Y., Wu, S.-H., Karmenyan, A. & Chiou, A. Аффинность взаимодействия между молекулой адгезии сосудистых клеток-1 (VCAM-1) и очень поздним антигеном-4 (VLA- 4) анализировали количественным методом FRET. PLoS One 10 , e0121399 (2014). Google ученый 45 Du, Y. et al. Анализ флуоресцентного резонансного переноса энергии с временным разрешением для высокопроизводительного скрининга ингибиторов межбелкового взаимодействия 14-3-3. Assay Drug Dev. Technol. 11 , 367–381 (2013). CAS PubMed PubMed Central Google ученый 46 Чен, Х., Пул, Х.Л., III и Икеда, С.Р. Оценка сродства белок-белкового взаимодействия в живых клетках с использованием количественных измерений передачи энергии резонанса Фёрстера. J. Biomed. Оптика 12 , 054011 (2007). ADS Google ученый 47 Мехта, К., Hoppe, A.D., Kainkaryam, R., Woolf, P.J. и Linderman, J.J. Вычислительный подход к выводу сродства связывания клеточного белка на основе количественной визуализации флуоресцентного резонансного переноса энергии. Протеомика 9 , 5371–5383 (2009). CAS PubMed Google ученый 48 Дэй, Р. Н. Измерение взаимодействия белков с использованием резонансной передачи энергии Фёрстера и микроскопии для визуализации времени жизни флуоресценции. Методы 66 , 200–207 (2014). CAS PubMed Google ученый 49 Hom, E. F. Y. и Verkman, A. S. Анализ кинетики и диффузии связанных бимолекулярных реакций с помощью двухцветной флуоресцентной корреляционной спектроскопии: повышенное разрешение кинетики за счет резонансной передачи энергии. Biophys. J. 83 , 533–546 (2002). ADS CAS PubMed PubMed Central Google ученый 50 Фу, Ю.Х., Нареди-Райнер, Н., Лэмб, Д. К., Ахмед, С. и Уоланд, Т. Факторы, влияющие на количественную оценку биомолекулярных взаимодействий с помощью флуоресцентной кросс-корреляционной спектроскопии. Biophys. J. 102 , 1174–1183 (2012). ADS CAS PubMed PubMed Central Google ученый 51 Hohng, S., Joo, C. & Ha, T. Одномолекулярный трехцветный FRET. Biophys. J. 87 , 1328–1337 (2004). ADS CAS PubMed PubMed Central Google ученый 52 Kim, H. et al. Белковая динамика РНК во время ранней сборки рибосом. Природа 506 , 334–340 (2014). ADS CAS PubMed PubMed Central Google ученый 53 Lee, J. et al. Одномолекулярный четырехцветный FRET. Angew. Chem. Int. Эд. Англ. 49 , 9922–9925 (2010). CAS PubMed PubMed Central Google ученый 54 Чжао, М., Хуанг, Р. и Пэн, Л. Количественные многоцветные измерения FRET с помощью матрицы возбуждения-излучения за время жизни Фурье. Оптика Экспресс 20 , 26806–26827 (2012). ADS PubMed PubMed Central Google ученый 55 Гальперин, Э., Верхуша В. В., Соркин А. Треххромофорная FRET-микроскопия для анализа мультипротеиновых взаимодействий в живых клетках. Nat. Методы 1 , 209–217 (2004). CAS PubMed Google ученый 56 Wallrabe, H., Sun, Y., Fang, X., Periasamy, A. & Bloom, G. Трехцветный FRET расширяет возможности количественной оценки взаимодействий нескольких белков, участвующих в зародышеобразовании актиновых филаментов. Proc.SPIE 822 , 82260J (2012). ADS Google ученый 57 Скотт Б. Л. и Хоппе А. Д. Трехмерная реконструкция трехфакторной FRET-микроскопии улучшает визуализацию множественных белок-белковых взаимодействий. PLoS One 11 , e0152401 (2016). PubMed PubMed Central Google ученый 58 Грант, Д. М.и другие. Мультиплексированный FRET для визуализации нескольких сигнальных событий в живых клетках. Biophys. J. 95 , L69 – L71 (2008). CAS PubMed PubMed Central Google ученый 59 Zhao, M., Wan, X., Li, Y., Zhou, W. & Peng, L. Мультиплексная 3D-визуализация FRET в глубоких тканях живых эмбрионов. Научный представитель 5 , 13991 (2015). ADS CAS Google ученый 60 Саркар, П., Фогель, С.С., Грычински, И., Грычинский, З. Фотофизические свойства флуоресцентных белков Церулеана и Венеры. J. Biomed. Опт. 14 , 034047 (2009). ADS PubMed PubMed Central Google ученый 61 Чен, Ю., Мюллер, Дж. Д., Руан, К. и Граттон, Е. Определение молекулярной яркости EGFP in vivo с помощью флуоресцентной флуктуационной спектроскопии. Biophys. Дж. 82 , 133–144 (2002). CAS PubMed PubMed Central Google ученый 62 Kelly, D. J. et al. Автоматический многолуночный считывающий микроскоп FLIM для анализа времени жизни автофлуоресценции живых клеток. J. Innov. Опт. Health Sci. 7 , 1450025 (2014). CAS Google ученый 63 Grant, D. M. et al. Высокоскоростная визуализация времени жизни флуоресценции с использованием оптических срезов позволяет изучать события передачи сигналов живыми клетками. Опт. Экспресс 15 , 15656–15673 (2007). ADS CAS PubMed Google ученый 64 Talbot, C. B. et al. Высокоскоростной конфокальный многолуночный считыватель планшетов с непрерывной флуоресцентной визуализацией без учителя для анализа высокого содержания. Дж. Биофотоника 1 , 514–521 (2008). PubMed Google ученый 65 Алибхай, Д.и другие. Автоматический считыватель планшетов для визуализации времени жизни флуоресценции и его применение для считывания Förster-резонансной передачи энергии агрегации белка Gag. J. Biophotonics 6 , 398–408 (2013). CAS PubMed Google ученый Передача энергии резонанса флуоресценции — обзор 2.1 Разработка зонда FRET для мониторинга активации каспаз Технология FRET может предоставить ценную информацию о динамике и характере активности ферментов.Ранние зонды FRET для активации каспаз использовали гибридный белок, то есть белок с повышенной голубой флуоресценцией (ECFP) в качестве донора FRET, и белок с повышенной желтой флуоресценцией (EYFP) в качестве акцептора FRET, связанный пептидами, содержащими расщепление каспазы-3. последовательность, DEVD (Luo, Yu, Pu, & Chang, 2001; Rehm et al., 2002; Tyas et al., 2000). Наиболее важной особенностью зонда FRET является специфичность к молекуле-мишени. Коэффициент молярной экстинкции акцепторного белка является важным фактором для определения эффективности FRET; однако молярный коэффициент экстинкции EYFP, обычного флуоресцентного белка в акцепторах FRET, демонстрирует высокую чувствительность к протонам и ионам хлора, особенно в физиологических условиях (Jayaraman, Haggie, Wachter, Remington, & Verkman, 2000; Llopis, McCaffery, Miyawaki, Farquhar, & Tsien, 1998).В нескольких отчетах предполагалось, что закисление происходит во время апоптоза (Matsuyama, Llopis, Deveraux, Tsien, & Reed, 2000; Perez-Sala, Collado-Escobar, & Mollinedo, 1995; Vincent, TenBroeke, & Maiese, 1999) и что хлорид / бикарбонатный обменник участвует в апоптотических событиях (Araki et al., 2002; Maeno, Ishizaki, Kanaseki, Hazama, & Okada, 2000). Поскольку изменение концентрации хлоридов также происходит в нейронах, было бы крайне важно использовать нечувствительный к хлоридам индикатор для мониторинга активации каспаз в нейронах.Из-за этих особенностей исследователи должны быть осторожны при использовании EYFP в качестве акцептора FRET, особенно для визуализации апоптоза in vivo . Чтобы преодолеть эти ограничения, Венера использовалась в качестве акцептора FRET в зонде SCAT3 (рис. 12.1; Takemoto et al., 2003), потому что он показывает низкую чувствительность к протонам и ионам хлора (Nagai et al., 2002). Действительно, SCAT3 показал высокую стабильность in vitro и в живых клетках по сравнению с ранее описанным зондом ECFP-EYFP (Takemoto et al., 2003). Разработка индикаторов SCAT3 позволила исследователям отслеживать активацию каспаз в живых клетках и in vivo в реальном времени (Campbell & Okamoto, 2013; Koto, Kuranaga, & Miura, 2009; Kuranaga et al. « Как проверить юридическую чистоту автомобиля при покупке: Как проверить юридическую чистоту автомобиля при покупке: сервисы и пошаговая инструкция Как на ваз отрегулировать фары: Регулировка фар ваз 2110 своими руками » Leave a Reply Отменить ответ Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены * 2019 © Все права защищены.